Summary
Здесь мы представляем протокол производить антитела bispecific GPC3-S-Fab в Escherichia coli. Очищенный GPC3-S-Fab имеет мощный цитотоксичность против GPC3 положительные печени раковых клеток.
Abstract
Этот протокол описывает строительные и функциональных исследований bispecific антитела (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs может признать два различных эпитопов через двух различных оружие. bsAbs активно были изучены для их способности непосредственно набирать иммунные клетки, чтобы убить раковые клетки. В настоящее время большинство bsAbs выпускаются в виде рекомбинантных белков, либо как Fc содержащих bsAbs или меньше bsAb производные без ФК региона. В этом исследовании GPC3-S-Fab, антитела фрагмент (ФАБ) на основе bispecific антитела, был разработан путем увязывания Fab антитела анти GPC3 GC33 с одного домена антитела анти CD16. GPC3-S-Fab может выражена в Escherichia coli и очищенный два сродства chromatographies. Очищенный GPC3-S-Fab специально можно привязать к и убить GPC3 позитивные печени раковые клетки путем найма естественных клеток-киллеров, предлагая потенциальным применение GPC3-S-Fab в терапии рака печени.
Introduction
Моноклональные антитела широко используются для лечения рака1. Благодаря гибкости антител активно изучаются различные форматы, основанные на антитела. По сравнению с моноклональными антителами, bsAbs имеют два различных антигена привязки модулей, позволяя им признать, что два различных целей одновременно и эффективно инициировать набор иммунных эффекторных клеток и убить опухолевые клетки2.
Текущие форматы рекомбинантных bsAb могут присваиваться как правило два класса: Fc содержащих bsAbs и bsAbs без ФК региона. По сравнению с Fc содержащих форматы, которые производятся в основном в mammalian клетках, bsAbs без ФК региона имеют преимущества небольших размеров, более легко производятся в системах выражения микроорганизмов и может проникать в ткани опухоли более эффективно 3.
bsAbs без ФК региона часто образуются путем увязывания постановление отдельные привязки, например переменной фрагменты одной цепи (scFvs) или Fabs3. Без стабилизации доменов bsAbs, часто основанные на фрагменты scFv подорвали термическая стабильность, низкая растворимость или увеличение потенциала для агрегирования4,5. В отличие от этого на основе Fab bsAbs более стабильными вследствие heterodimerization CH1 и CL в родной Fab остаток4,6.
Переменной домена от тяжелых цепи только-антител (VHHs, также упоминается как одного домена антитела) являются активные антиген связывая фрагмент природных тяжелых цепей антитела7. VHHs имеют характеристики высоким сродством, специфика обычных IgGs8, низкой иммуногенностью и высокие урожаи в бактериальных выражение9. По сравнению с Fv фрагментов, VHHs имеют более высокой термостабильности10. По сравнению с Fab постановление, VHHs имеют меньшие размеры из-за отсутствия CH1 и CL. Таким образом S-Fab, формат bsAb, полученные путем увязывания Fab с одного домена антитела, VHH, был разработан и изучал его противоопухолевый эффекты11,12.
В этом исследовании был описан строительство GPC3-S-Fab, связывая Fab hGC3313 с анти CD16a VHH14 . GPC3-S-Fab может производиться эффективно периплазматическое выражением в Escherichia coli (E. coli). Функциональные исследования GPC3-S-Fab предложил, что GPC3-S-Fab является перспективной стратегией для терапии рака печени. Таким образом преимущества GPC3-S-Fab альтернативные методы с применимыми ссылки на предыдущие исследования включают в себя легко производства и очистки и более стабильной bsAbs.
Млекопитающих выражение и прокариот выражение систем использовались для выражения различных форматов BsAbs. В отличие от системы млекопитающих выражения, E. coli-системах выражения протеина на основе имеют много преимуществ, включая высокие урожаи, низкой стоимости и труда, экономии, легкость генетических манипуляций и высокие преобразования эффективности15. Для выражения bsAbs в E. coli, существуют две основные стратегии: выражение в цитоплазме и выражение в periplasm между цитоплазмой и наружной мембраны клеток15. По сравнению с снижение окружающей среды цитоплазмы, periplasm является более окисляющие окружающей среды, которая способствует правильной складывания и Сопредседатель выражение белки16. Правильно складывать играет ключевую роль в растворимости, стабильности и функции поколения bsAbs. Таким образом pelB последовательность сигнала был добавлен к N-го S-Fab направлять секреции periplasm E. coli17. Для обеспечения корректного складные, растворимость, термостабильность и конформационную стабильность, уменьшение сложности и размеров антитела часто работают16. S-Fab формата состоит из одного ВСБ и один VHH, который очень хорошо выражена в бактериальных систем, вероятно, из-за простую структуру и малый размер.
GPC3 был выбран в этом формате антитела bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) является членом семьи протеогликана сульфат (HS) гепарина, которая привязана к поверхности клетки через glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 является гиперэкспрессия в 70% случаев гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) случаи, которые составляют большинство из печени рака19,20,,21-22. Потому что редко GPC3 выражается в нормальных тканях, GPC3 было предложено как потенциальной мишенью для КЦУК. Были произведены несколько мышь mAbs против GPC3. Однако только GC33 выставлены ограниченное противоопухолевую активность 22, и он не выставлять клиническая эффективность у пациентов. В этом исследовании чтобы иметь возможность нанимать НК-клеток, чтобы убить GPC3 опухолевых клеток14было показано GPC3-S-Fab.
Чтобы набрать НК-клеток, VHH анти CD16 был использован. CD16a является низкое сродство IgG рецепторов, выражена главным образом на естественных киллеров (НК), макрофаги, моноцитов и некоторых подтипов Т-клеток. Он участвует в цитотоксичности антител зависимой ячейки (ADCC) НК клеток23. NK клеток человека могут быть разделены на два типа, CD56 - CD16 + и CD56 + CD16-. В отличие от CD56 + CD16− НК-клеток, CD56-CD16 + НК-клеток может выпуска более высокого уровня Перфорины и Гранзим B и таким образом представляют сильную цитотоксичность24. Купфера (КИС), выражая CD16a, являются резидентов макрофаги в печени. Купфера играют важную роль в борьбе с раком печени25. Таким образом bsAbs ориентации CD16a может быть более перспективной стратегией, чем привлечение Т-клетки против рака печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включая сбор крови человека были утверждены Комитетом Sun Yat-Sen университета этики.
1. GPC3-S-потрясающий дизайн стратегии
- Дизайн GPC3-S-Fab, связывая Fab анти GPC3 (гуманизированные GC3313) с анти CD16 VHH14 (рис. 1).
- Синтезировать и клонировать VH-CH1-CD16-VHH и ВЛ-CL в векторов pET26b и pET21a, как сообщалось ранее12.
2. преобразование и культура
- Добавить 100 нг pET26b содержащий VH-CH1-CD16 (рис. 1A) и 100 нг pET21a содержащий ВЛ-CL (рис. 1A) в 100 мкл компетентных BL21 (DE3) клетки. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду на 30 мин инкубировать в ванну воды 42 ° C для 45-90 s, передачи и инкубировать на льду для 3-5 мин.
- Добавьте 500 мкл lysogeny бульон (LB) среды в пробирку, содержащую BL21 (DE3) клетки и затем инкубации при 37 ° C, 150 rpm для 45-60 мин распространения 100 мкл BL21 (DE3) клетки на LB-агар плиты, содержащих 50 мкг/мл канамицин и 100 мкг/мл ампициллина , а затем инкубации при 37 ° C для 12-16 ч.
- Подготовка среднего lysogeny бульон (Фунты): Триптон wt/vol 1%, 0,5% wt/vol дрожжевой экстракт, wt/vol 1% NaCl.
- Прививать клеток из одной колонии в 5 мл супер бульон (SB) среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин и 100 мкг/мл ампициллини культуры при 37 ° C, 220/мин, на ночь. Затем прививать 1 мл культуры в 100 мл SB среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин и 100 мкг/мл ампициллин и культуры при 37 ° C, 220 rpm для 4 ч. Затем перевести 10 мл культуры на 1 Л SB среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин и 100 мкг/мл ампициллин и культуры при 37 ° C, 220 об/мин.
- Подготовка среднего супер бульон: 3.2% wt/vol Триптон, wt/vol 2% экстракт дрожжей, 0,5% wt/vol NaCl.
- Когда ОД600 достигает 0,6 - 0,8, добавить изопропил b-D-Тио галактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0,2 мм. Культура на 16 ° C, 180 rpm для 36-48 h для периплазматическое выражения.
3. GPC3-S-Fab периплазматическое очистки
- Подготовка периплазматическое дроби
- Собрать клетки центрифугированием при 4000 x g, 4 ° C на 30 мин, отказаться от среднего и весят клетки.
- Ресуспензируйте клетки тщательно в 4 мл раствора ледяной сахарозы (20 мм трис-HCl, рН 7,5; 25% (wt/vol) сахарозы и 1 мм ЭДТА) на грамм клеток и инкубировать на льду за 15 мин.
- Центрифуга на 8500 x g (столешница центрифуги, фиксированный угол ротор), 4 ° C для 20 мин удалить супернатант (фракция сахарозы) и сохраните его на льду.
- Ресуспензируйте гранулы в смеси ледяной 5 мм MgCl2 и 1 мм PMSF (4 мл на грамотрицательные клетки). 40 мкл лизоцима запасов (15 мг/мл) на грамм и инкубировать на льду за 30 мин.
- Центрифуга на 8500 x g (столешница центрифуги, фиксированный угол ротор), 4 ° C в течение 20 мин передачи супернатант (периплазматическое фракция) и сохраните его на льду.
- Объединить часть сахарозы и периплазматическое дроби и центрифуги на 30000 x g, 4 ° C для 30 мин удалить супернатант и сохранить его в 50 мл Конические трубки на льду.
- Очищение сродства Ni-НТА
- Ресуспензируйте тщательно смешивая для достижения однородной подвеска, удалить 1 мл Ni-НТА агарозы для свежего 15 мл конические и добавить 10 столбцов томов (CV) уравновешивания буфер 1 мл Ni-НТА агарозы (25 мм трис-HCl, рН 7,5; 1 M NaCl) чтобы сбалансировать.
- Центрифуга на 400 g x 5 минут и тщательно удалить супернатант. Затем добавьте Ni-НТА агарозы в Тюбик 50 мл, содержащие сахарозу дроби и периплазматическое дроби. Рок на 4 ° C на 2 ч.
- Центрифуга смеси на 400 x g, 4 ° C за 5 мин тщательно удалить супернатант в другой свежие ледяной пробки как несвязанные дроби. Передача Ni-НТА агарозы в столбец гравитации.
- Добавить 10 CV отмывающего буфера (25 мм трис-HCl, рН 7,5; 1 M NaCl; 20 мм, 30 мм или 40 мм имидазола) для столбца и собирать elute как стиральная дроби.
Примечание: Эти решения должны быть добавлены в порядке возрастания концентрации имидазола. - Добавить 3 резюме Элюирующий буфер (Tris-HCl, рН 7,5; 300 мм NaCl в 25 мм, 100 мм, 200 мм, 300 или 400 мм имидазола) в столбце и собирать elute как элюции дроби 1, 2, 3 и 4.
Примечание: Эти решения должны быть добавлены в порядке возрастания концентрации имидазола. - Диализ eluted фракций в 2 Л PBS (137 мм NaCl, 2,7 мм хлористого калия, 10 Na2HPO4, 2 мм х2PO4, рН 7,4) с помощью диализа трубы (12.4 кДа) при 4 ° C на 2 ч. проверить наличие GPC3-S-Fab на 12% SDS-PAGE, а затем Окрашивание Кумасси синий.
- IgG-CH1 очищение сродства
- Передача 1 мл IgG-CH1 сродство смолы в 50 мл Конические трубки и сначала вымойте бусины с PBS. Затем добавьте dialyzed раствор, содержащий GPC3-S-Fab после шага 3.2.6. Рок на 4 ° C на 2 ч.
- Центрифуга на 400 x g 5 мин, 4 ° C. Тщательно удалить супернатант в другой свежей ледяной пробки и передачи смолы к столбцу гравитации.
- Добавить 10 CV стирки буфера (PBS) в столбце и собирать элюции как мыть дроби.
- Подготовьте коллекцию трубок, добавив 1 М трис рН 9,0 (0,1 мл мл каждого eluted фракции). Элюировать с 3 резюме Элюирующий буфер (0,1 М глицин-HCl, рН 2.7) и собирать eluted фракция; Повторите 3 раза.
- Диализ eluted фракций в 2 Л PBS с помощью диализа трубы (12.4 кДа) при 4 ° C на 2 ч. повторять дважды.
- Определите концентрацию белка, ultramicrospectrophotometer (коэффициент молярной вымирания: 91105. 1 A280 = 0,69 мг/Л).
4. SDS-PAGE и Западный blotting анализ
- Взять 10 мкл пример в 5 x SDS загрузки буфера и хорошо перемешать. Кипятите смесь белков при 100 ° C за 5 мин.
- Подготовить 5 x SDS загрузки буфера: 250 мм трис-HCl, pH 6.8, wt/vol 10% SDS, 0,5% wt/vol бромфеноловый синий, 50% vol/vol глицерина, 5% vol/vol бета меркаптоэтанол.
- Подготовка геля SDS-PAGE с загрузкой (5%) и разделения лари (12%) как описано в26,27,28.
- Загрузка 10 мкл смесь вареных белков и белка маркера и выполнение SDS-PAGE.
- Пятно гель путем встряхивания в течение 20 мин с Кумасси синий настойка и затем выполнить минигелей.
- Для западный blotting, после передачи PVDF мембрану, блокировать мембраны с TBST (20 мм трис-HCl, 150 мм NaCl, 0.1% vol/vol анимации 20) + 5% wt/vol обезжиренного молока за 1 ч при комнатной температуре при встряхивании.
- Проинкубируйте мембрану с первичных антител (против его или борьбе с флагом) разбавляют стоматологов в TBST + 5% обезжиренного молока за 1 ч.
- Вымойте с TBST 5 мин при комнатной температуре и повторите 3 раза.
- Проинкубируйте мембрану в вторичное антитело (HRP-связаны антитела анти мыши ФК) разбавляют стоматологов в TBST + 5% обезжиренного молока за 1 час.
- Вымойте с TBST 5 мин при комнатной температуре и повторите 3 раза.
- Добавьте 1 mL HPR субстрата за фильм, разрабатывать и принимать изображения.
5. гель фильтрации анализ
- Используйте следующий столбец: столбец объем 24 мл; Уравновешивания буфер PBS рН 7,4; Скорость потока 0,5 мл/мин на номер умеренный; Объем образца 200 мкл.
- Используйте следующие белка объема и концентрации: 500 мкл 1,2 мг/мл GPC3-S-Fab. Центрифуга на 20000 x г за 30 мин и принять 200 мкл для загрузки.
- Для белка маркера объема и концентрации принимать 100 мкл цитохрома C (2 мг/мл, 12.4 кДа), 140 мкл является (3 мг/мл, 29 кДа), 140 мкл альбумина (10 мг/мл, 66 кДа) и 200 мкл Дегидрогеназа спирта (5 мг/мл, 150 кДа) в одну трубу. Центрифуга на 20000 x г за 30 мин и принять 200 мкл для загрузки.
- До каждого запуска, мыть с по крайней мере 2 CV дистиллированной воды при скорости потока 0,5 мл/мин.
- Сбалансировать столбец с по крайней мере 2 CV уравновешивания буфера (PBS, рН 7,4) со скоростью потока 0,5 мл/мин.
- Автоматически вставляет образца в 0,5 мл/мин для загрузки образца.
- Элюировать с буфером уравновешивания в 0,5 мл/мин и обнаружить на 280 и 215 Нм.
6. поток Cytometry анализ
- Культура HepG2 (положительное GPC3), Hep3B (GPC3 положительные), Huh7 (GPC3 плюс) и MHCC - 97H (GPC3 отрицательный) клетки в 100 мм x 20 мм пластиковая блюд, содержащих среде DMEM с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) при 37 ° C, 5% CO2.
- Культура клетки Чо (GPC3 минус) и Чо/GPC3 клетки укрывательство полнометражного cDNA человеческого GPC3 (GPC3 плюс) в 100 мм x 20 мм пластиковая блюд, содержащих среду RPMI 1640 с 10% FBS, пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) при 37 ° C, 5% CO2.
- Культура NK92/CD16, укрывательство полнометражного человека CD16 cDNA (CD16 положительным) в 25 см2 флакон, содержащий среду RPMI 1640 с 10% FBS, пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) при 37 ° C, 5% CO2.
- Когда клетки вырожденная, отменить 70-90% средних и вымыть клетки с 2 мл ФСБ. Добавить 1 мл 0,25% трипсина и инкубировать при 37 ° C на 2-3 минут (или до тех пор, пока клетки начинают оторваться от поверхности). Добавьте 1 mL полный рост средних для нейтрализации трипсина и вновь приостановить клетки, нежно закупорить вверх и вниз.
- Подсчет числа клеток с помощью Горяева Нойбауэр и выявления жизнеспособности клеток путем Трипановый синий.
- Соберите 3 х 106 клеток для каждой ячейки строки. Добавьте 1 mL PBS + 0,2% BSA вновь приостановить клетки. Центрифуга на 200 x g, 4 ° C на 5 мин повторить дважды.
- Добавление 0,3 мл PBS + 0,2% BSA вновь приостановить клетки и передавать каждый 5 мл полистирола раунд дно трубки 100 мкл (приблизительно 1 млн.).
Примечание: Убедитесь, что все шаги здесь для трубы должны храниться холодной на льду. Когда антитела является обязательным для клеток поверхностного антигена, комплекс будет начать интернализации. Сохраняя холодный, этот процесс значительно замедлились. - Добавить 10 мкл первичных антител (GPC3-S-Fab или человеческие IgG1, конечная концентрация 5 мкг/мл) в каждый трубки и инкубировать на льду за 1 час.
- Добавьте 1 mL PBS + 0,2% BSA мыть и центрифуги на 200 x g, 4 ° C за 5 мин повторить три раза.
- Вновь приостановить в 100 мкл PBS + 0,2% BSA, а затем 0.5 мкл вторичного антитела (античеловеческие IgG(H+L)-488, окончательный концентрации 10 мкг/мл) и инкубировать на льду на 1 ч. Примечание: от этого шага, пожалуйста сохранить клетки от света.
- Добавьте 1 mL PBS + 0,2% BSA мыть и центрифуги на 200 x g, 4 ° C за 5 мин повторить три раза.
- Проанализируйте клетки проточный цитометр согласно стандартному протоколу29. Приобрести клетки с 488 нм лазер для возбуждения.
7. цитотоксических анализов
- Подготовьте опухолевых клеток.
- Культура HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H и Чо клеток линий, как описано в шагах 6.1-6.5.
- Разбавить клетки 0.5 ×10/5мл и пластины 100 мкл (клетки 5000 за хорошо) на 96-луночных пластины. Культура 6-8 ч, чтобы позволить клетки для присоединения.
- Подготовьте мононуклеаров периферической крови человека (получения).
- Разбавьте свежий подготовленный крови с равным объемом PBS в 50 мл Конические трубки. Например развести 10 мл крови с 10 мл ФСБ.
- 15 мл лимфоцитов разделения среды учитывать свежие 50 мл Конические трубки. Передача в разбавленной крови на носитель разделения лимфоцитов вдоль стороне трубки медленно.
Примечание: Держите вертикальные трубки. Не нарушайте поверхности лимфоцитов разделения среды. - Центрифуга на 400 x g 35 мин при комнатной температуре с тормозом выкл.
- Медленно снимите верхний плазменный слой и принять белой крови слой, содержащий репликацию в интерфейсе среднего разделения плазмы лимфоцитов.
- Разбавить репликацию с двойной объем PBS + 2% FBS. Центрифуга на 400 x g за 5 мин.
- Вымыть клетки дважды с PBS + 2% FBS. Центрифуга на 400 x g 5 мин рассчитывать число клеток, как описано в шаге 6.5.
- Подготовка клетки.
- Подготовьте получения подвеска в концентрации 5 x 107 кл/мл в PBS + 2% FBS и место их в 5 мл трубку из полистирола раунд снизу.
- Добавьте человека NK клеток обогащения коктейль на 50 мкл/мл клеток. Хорошо перемешайте и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Ресуспензируйте магнитные частицы из клеток NK комплект обогащения и перемешать хорошо чтобы убедиться, что они равномерно приостановлено, закупорить вверх и вниз энергично более чем 5 раз. Передачи ресуспензированы магнитных частиц на 100 мкл/мл суспензии клеток. Хорошо перемешайте и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Принесите суспензию клеток вплоть до общего объема 2,5 мл, добавляя PBS + 2% FBS. Смешайте клетки в пробирку аккуратно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза. Положите трубку (без капитализации) в магнит. Пусть магнитные бусы поселиться за 2,5 мин при комнатной температуре.
- Удалите магнит. В одном непрерывном движении Инвертируйте трубки, наливая покинуть суспензию обогащенных клеток в новой трубки.
- Подсчет числа клеток, как описано в шаге 6.5.
- Настройка цитотоксические реакции.
- Разбавьте НК-клеток 5 × 105 клеток/мл, используя соответствующий питательной среды. Добавьте 100 мкл суспензии клеток NK клеток опухоли, покрытие на плиту 96-луночных.
- 10 мкл GPC3-S-Fab, в различных концентрациях, с высокой дозой в конечной концентрации 30 мкг/мл, 3 раза разрежения, 9 баллов (три репликация).
- Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2 за 72 ч.
- После 72 ч инкубации удалите средство, 100 мкл среде DMEM, содержащей 10 мкл Реагента CCK8 для каждой скважины в 96-луночных пластины и затем Инкубируйте на 37 ° C.
- Читайте пластину на 450 Нм при 1, 2, 3 и 4 h после добавления CCK8 реактива.
- Проанализируйте данные. Рассчитать выживаемость (OD450 GPC3-S-Fab + эффекторных опухоли - OD450 средний) / (OD450 опухоль - OD450 средний) × 100% и (OD450 GPC3-S-Fab + опухоль - OD450 средний) / (OD450 опухоль - OD450 средний) × 100%. Эффекторные клетки являются клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab очистки
GPC3-S-Fab был очищен от кишечной палочки очищение сродства двухступенчатый, сначала с Ni-НТА агарозы, следуют IgG-CH1 очищение сродства. После очищения сродства двухступенчатый GPC3-S-Fab был очищен до однородности с двумя цепями близко к 1:1 (рис. 2A). Присутствие VH-CH1-CD16 VHH и ВЛ-CL полипептиды могут быть идентифицированы по их собственный терминал C теги, против его для ВЛ-CL примерно 25 кДа и анти флаг для VH-CH1-VHH приблизительно 38 кДа (рис. 2B). После очищения сродства двухступенчатый ~1.2 мг белка можно получить 1 Л SB культуры. Для дальнейшей характеризации очищенный GPC3-S-Fab, была выполнена фильтрация гель. Основываясь на стандартных маркеров (рис. 2 c), GPC3-S-Fab была определена как однородных мономера в виде гетеродимер с молекулярной размером примерно 63 кДа (рис. 2 c).
GPC3-S-Fab привязки деятельность
Чтобы оценить ли GPC3-S-Fab признает GPC3-положительных клеток и CD16-положительных клеток, поток cytometry анализ был проведен с использованием GPC3-положительным раком печени клеточных линий HepG2, Hep3B, Huh7, Чо/GPC3 и линии клеток рака печени GPC3-отрицательный, MHCC - 97H и Чо клетки. GPC3-S-Fab может связать все GPC3-положительных клеток, хотя с слабее привязки к Hep3B (рис. 3B) и Huh7 клеток (рис. 3 c), чем в HepG2 (Рисунок 3А) и Чо/GPC3 (Рисунок 2F). Нет или минимальный привязку к GPC3-отрицательных MHCC - 97H и Чо клеток было отмечено (рис. 3D, 3E). GPC3-S-Fab также может привязать к CD16-положительных клеток, NK92/окрашенных CD16 + клеток (рис. 3 g). Эти результаты согласуются с ранее полученными результатами, используя другие анти GPC3 антитела30, предполагая, что GPC3-S-Fab конкретно можно связать линии GPC3-положительных клеток и CD16-положительных клеток.
Чтобы оценить цитотоксичности GPC3-S-Fab, опухолевые клетки инкубировали с свежими изолированных клеток NK с различной концентрации GPC3-S-Fab. Без НК-клеток GPC3-S-Fab имел не цитотоксичность против опухолевых клеток независимо от статуса выражение GPC3 (рис. 4). Присутствии НК-клеток GPC3-S-Fab вызвали сильное цитотоксичность против HepG2, Hep3B и Huh7 клеток в зависимости от дозы, но показал никакого эффекта на клетки GPC3-отрицательных MHCC - 97 H (рис. 4), предполагая, что цитотоксичности GPC3-S-Fab зависит от GPC3 выражения на поверхности опухолевых клеток.
Рисунок 1. Конструкции GPC3-S-Fab
(A) бактериальной выражение конструкции GPC3-S-Fab. Конструкции содержат последовательность сигнала pelB , VHH VH-CH1-анти CD16 гуманизированные анти GPC3 (GC33) (тяжелые цепи), или ВЛ-CL (легкие цепи). Для облегчения очистки и обнаружения протеина, флаг тег или His8 тег был добавлен в C-terminus. (B) схемы из GPC3-S-Fab после совместного выражения.
Рисунок 2. GPC3-S-Fab очистки от E. coli.
(A) левой, после Ni-НТА аффинной хроматографии; Правая панель, после анти IgG-CH1 аффинной хроматографии; M, молекулярный вес лестница; Окрашивание Кумасси синий. Левая панель (B), после Ni-НТА аффинной хроматографии; Правая панель, после анти IgG-CH1 аффинной хроматографии; M, молекулярный вес лестница; Западный Blotting. (C) гель фильтрации анализ GPC3-S-Fab. Верхняя панель, стандартных маркеров; Нижняя панель, GPC3-S-Fab. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. GPC3-S-Fab признает позитивные клетки GPC3 и CD16-положительных клеток.
Поток cytometry анализ HepG2 (A), Hep3B (Б), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), (E), Чо Чо/GPC3 (F) и (G) NK92/CD16 клетки была выполнена, как описано в протоколе. Красная линия: опухолевые клетки только; Зеленая линия: изотипа управления, опухолевых клеток + человеческие IgG1 антинародным IgG(H+L)-488; синяя линия: опухолевых клеток + GPC3-S-Fab человека против IgG (H + L)-488. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. GPC3-S-Fab способствует гибели клеток GPC3-положительных клеток рака.
Доза зависимой цитотоксичности анализов были выполнены, как описано в протоколе для HepG2 (A), Hep3B (Б), Huh7 (C) и MHCC - 97 H (D). Концентрации GPC3-S-Fab были от 0.0045 мкг/мл по 30 мкг/мл. Данные являются среднее triplicates с погрешностей , представляющий стандартное отклонение. Сплошной круг, только GPC3-S-Fab; сплошной квадрат, GPC3-S-Fab+ НК, НК-клетки (50000 за хорошо) и клеток-мишеней (5000 в колодец). Смеси инкубировали за 72 ч до измерения цитотоксичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы представляем стратегию построить новый формат bsAbs, GPC3-S-Fab, который можно набрать НК-клеток, ориентация GPC3 позитивных опухолевых клеток. S-Fab основывается на природных Fab формат, добавив анти CD16 VHH11,12. По сравнению с областью, содержащей ФК bsAbs, GPC3-S-Fab легко могут быть произведены в periplasm бактерий в крупных масштабах.
Используя выражение и очистки стратегии, описанные в протоколе, мы получили растворимых и функциональной GPC3-S-Fab в больших количествах. Чтобы облегчить периплазматическое выражение, pelB последовательность сигнала был добавлен в N-го направить секреции periplasm E. coli17. В отличие от цитоплазмы, более окислительной среды в Периплазматическое пространство между цитоплазмы и наружной мембраны оснащен ряд важных белков для сворачивания белка и Ассамблеи и таким образом способствует коррекции складывания и растворимость рекомбинантных белков16. Однако машины для сворачивания белка и экспорта в periplasm в E. coli ограниченные возможности. Высокая экспрессия рекомбинантных белков часто приводит к накоплению нерастворимых продукта в periplasm16. Чтобы избежать высокая экспрессия белка за короткий период времени, в настоящем Протоколе, чтобы избежать накопления нерастворимого белка применялись низкий IPTG (0,2 мм) и низкой температуры (16 ° C) в питательной среде. В этом исследовании ~1.2 мг белка был получен от 1 Л среды, повышения урожайности, по меньшей мере вдвое по сравнению с предыдущей работы12.
Чтобы избежать деградации белка, всех фракций, содержащих GPC3-S-Fab в различные шаги должны храниться на льду. С его тег на C-терминала ВЛ-CL, Ni-НТА агарозы был использован для очистки. Однако один Ni-НТА агарозы очистки недостаточно для удаления нежелательных белков, таких как непарных ВЛ-CL белка. Для того чтобы очистить однородных гетеродимерная GPC3-S-Fab, второй шаг, очищение сродства анти IgG-CH1, был применен. Очищенный протеин был высокой чистоты и два полипептиды близко к 1:1 (рисунок 2A-2B).
Гель хромотографии фильтрации можно определить молекулярного веса протеины основанные на их молекулярных размеров и форм; анализировать степень чистоты; и определить, является ли очищенный протеин мономера, димер, или состоит из агрегатов15. Хромотографией фильтрации геля GPC3-S-Fab отождествлялся с ожидаемой молекулярного размера приблизительно 63 кДа, который находится в виде мономера с heterodimerization GPC3-S-Fab (рис. 2 c).
Проточной цитометрии можно определить ли антитела можно привязать ее антигена на клеточные мембраны, по сравнению с традиционными Западный blotting и ELISA, которые только обнаруживать антиген антитела binding реакций. Cytometry анализ потока GPC3-S-Fab признал GPC3 на клеточной мембраны, предполагая, что GPC3-Fab остаток был функциональным. При выполнении анализа цитометрия потоков, важно держать все шаги на льду или на 4 ° C, после добавления антитела. Когда антитело связывает к клеток поверхностного антигена, комплекс антител антигена будет инициировать интернализации. Сохраняя холодный, значительно замедляется процесс интернализации.
Получения и НК-клеток были эффективно изолированы от периферической крови человека центрифугированием, с помощью разделения лимфоцитов среднего, следуют магнитные активации клеток, сортировка стратегии. GPC3-S-Fab показал мощным цитотоксичность против позитивных клеток GPC3, когда НК-клеток в клетки-мишени (опухолевые клетки) составляло 10:1, и соотношение НК-клеток в клетки-мишени могут варьироваться от 50: 1 до 5:1.
В целом GPC3-S-Fab, который может быть получен в системе выражения микроорганизма, обеспечивает новые возможности для создания функциональных форматах bsAbs против опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана R & D плана провинции Гуандун (Китай) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
