Cancer Research

Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/57588

Yanlan Wang^1,2, Jiayu Liu^1,2, Haitao Pan^1,2, Jieyu Xing^1,2, Xiaoqiong Wu^1,2, Qing Li^1,2, Zhong Wang^1,2

¹School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, ²Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour produire un anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab dans Escherichia coli. La GPC3-S-Fab purifié a puissante cytotoxicité contre les cellules de cancer du foie positive GPC3.

Abstract

Ce protocole décrit la construction et des études fonctionnelles d’un anticorps bispécifiques (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs peut reconnaître deux épitopes différents par le biais de leurs deux armes différentes. bsAbs ont été activement étudiées pour leur capacité à recruter directement des cellules immunitaires pour tuer les cellules tumorales. Actuellement, la plupart des bsAbs est produite sous forme de protéines recombinantes, soit comme contenant du Fc bsAbs ou comme petits bsAb dérivées sans la région Fc. Dans cette étude, GPC3-S-Fab, un anticorps bispécifiques base d’anticorps fragment (Fab), a été conçu en associant la Fab d’anticorps anti-GPC3 CG33 avec anticorps anti-CD16 domaine unique. La GPC3-S-Fab peut être exprimé chez Escherichia coli et purifié par chromatographie d’affinité deux. La GPC3-S-Fab purifié peut se lient à spécifiquement et tuent les cellules de cancer du foie positive GPC3 en recrutant des cellules tueuses naturelles, suggérant une application potentielle de GPC3-S-Fab dans le traitement du cancer du foie.

Introduction

Anticorps monoclonaux sont maintenant largement utilisés pour le traitement de cancer¹. En raison de la flexibilité des anticorps, différents formats de base d’anticorps ont été activement explorés. Par rapport aux anticorps monoclonaux, bsAbs présentent deux modules de liaison antigène différent, leur permettant de reconnaître les deux cibles différentes simultanément et efficacement déclenchent le recrutement des cellules effectrices immunitaire afin de cibler et de tuer des cellules de tumeur².

Les formats actuels de bsAb recombinante peuvent être généralement attribués à deux classes : Fc contenant bsAbs et bsAbs sans une région Fc. Par rapport aux formats contenant des Fc qui sont produites principalement dans les cellules de mammifères, bsAbs sans une région Fc ont les avantages de plus petites tailles, sont plus facilement produits dans des systèmes d’expression micro-organisme et peuvent pénétrer les tissus tumoraux plus efficacement³.

bsAbs sans une région Fc sont communément formés en reliant les moitiés de liaison individuels, tels que la variables chaîne unique fragments (scFvs) ou Fabs³. Sans les domaines stabilisantes, bsAbs basés sur des fragments de scFv souvent ont compromis la stabilité thermique, faible solubilité ou un risque accru d’agrégation⁴^,⁵. En revanche, axée sur la Fab bsAbs sont plus stables en raison de l’hétérodimérisation du CH1 et CL dans le fragment Fab natif⁴^,⁶.

Domaine variable de heavy-chain-seulement anticorps (HHV, aussi appelées anticorps à domaine unique) sont le fragment de liaison de l’antigène actif de chaîne lourde naturels anticorps⁷. HHV ont les caractéristiques de haute affinité, spécificité des classiques IgG⁸faible immunogénicité et des rendements élevés en expression bactérienne⁹. En comparaison avec des fragments de Fv, HHV ont plus élevé de stabilité thermique¹⁰. En comparaison avec les fragments Fab, HHV ont des tailles plus petites en raison de l’absence de CH1 et CL. Ainsi, les S-Fab, le format bsAb obtenu en associant la Fab d’un anticorps de domaine unique, VHH, a été conçu et étudié pour ses effets anti-tumoraux¹¹^,¹².

Dans cette étude, la construction de GPC3-S-Fab en liant la Fab de hGC33¹³ avec un anti-CD16a VHH¹⁴ a été décrite. La GPC3-S-Fab peut être efficacement produit par expression périplasmique chez Escherichia coli (e. coli). Des études fonctionnelles de GPC3-S-Fab a suggéré que la GPC3-S-Fab est une stratégie prometteuse pour le traitement du cancer du foie. Ainsi, les avantages de GPC3-S-Fab sur des techniques alternatives avec références applicables aux études antérieures incluent production facile et purification et bsAbs plus stable.

Systèmes d’expression chez les mammifères et des systèmes d’expression procaryotes ont été utilisés pour exprimer les différents formats de BsAbs. Contrairement aux systèmes d’expression chez les mammifères, e. coli-systèmes d’expression de protéine de base ont beaucoup d’avantages, y compris avec des rendements élevés, faible coûts et allégeant, la facilité des manipulations génétiques et de transformation haute efficacité¹⁵. Pour bsAbs expression dans Escherichia coli, il y a deux stratégies de base : expression dans le cytoplasme et l’expression dans le périplasme entre le cytoplasme et la membrane cellulaire externe¹⁵. Par rapport à l’environnement réducteur du cytoplasme, le périplasme est un oxydant plus environnement qui favorise le repliement correct et la co-expression de protéines¹⁶. Un pliage correct joue un rôle clé dans la solubilité, stabilité et la fonction de génération de bsAbs. Par conséquent, un signal séquence pelB a été ajouté à la N-terminale de la S-Fab pour diriger la sécrétion pour le périplasme des e. coli¹⁷. Afin d’assurer bon pliage, solubilité, stabilité thermique et la stabilité conformationnelle, réduisant la complexité et la taille d’un anticorps est fréquemment employé¹⁶. Le format S-Fab comprend un Fab et un VHH, qui s’exprime très bien dans les systèmes bactériens probables due à la structure simple et de petite taille.

GPC3 a été choisi dans ce format d’anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) est un membre de la famille de protéoglycanes héparine sulfate (HS) qui est ancrée à la surface des cellules via glycosylphosphatidylinositol (GPI)¹⁸. GPC3 est surexprimée dans 70 % des cas de hepatocellular carcinoma (HCC), qui représentent la majorité des cancers du foie¹⁹^,²⁰^,²¹^,²². Car GPC3 est rarement exprimée dans les tissus normaux, GPC3 a été proposé comme une cible potentielle pour HCC. Plusieurs souris mAbs ont été produites contre GPC3. Cependant, seulement CG33 présentait l’activité anti-tumorale limitée ²², et il n’a pas à exposer une efficacité clinique chez les patients. Dans cette étude, GPC3-S-Fab s’est avéré être en mesure de recruter les cellules NK pour tuer GPC3 tumeur cellules¹⁴.

Pour recruter des cellules NK, anti-CD16 VHH a été utilisé. CD16a est un récepteur de faible affinité IgG, exprimé principalement sur certains sous-types de cellules T, les macrophages, les monocytes et les cellules tueuses naturelles (NK). Il est impliqué dans la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par NK cellules²³. Les cellules NK humains peuvent être classés en deux types, CD56 - CD16 + et CD56 + CD16-. Contrairement aux cellules CD56 + CD16− NK, CD56-cellules NK CD16 + peuvent libérer des niveaux plus élevés de la perforine et granzyme B et donc présenter une forte cytotoxicité²⁴. Des cellules de Kupffer (KCs), exprimant les CD16a, sont les macrophages résidents dans le foie. Des cellules de Kupffer jouent un rôle important dans la répression d’un cancer du foie,²⁵. Ainsi, bsAbs CD16a de ciblage peut être une stratégie plus prometteuse que se livrer à des lymphocytes T contre le cancer du foie.

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Protocol

Toutes les procédures y compris la collecte de sang humain ont été approuvées par le Comité d’éthique de Sun Yat-Sen University.

1. la GPC3-S-Fab Design stratégie

Conception GPC3-S-Fab en liant un Fab d’anti-GPC3 (CG33 humanisé¹³) avec un anti-CD16 VHH¹⁴ (Figure 1).
Synthétiser et cloner les VH-CH1-CD16-VHH et VL-CL dans les pET26b et la pET21a des vecteurs comme indiqué précédemment¹².

2. transformation et la Culture

Ajouter 100 ng de pET26b contenant VH-CH1-CD16 (Figure 1 a) et 100 ng de pET21a contenant VL-CL (Figure 1 a) dans 100 µL de compétente BL21 (DE3) cellules. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min. Incuber dans un bain-marie à 42 ° C pendant 45-90 s, transfert et incuber sur glace pendant 3-5 min.
Ajouter 500 µL de milieu de lysogénie bouillon (LB) dans un tube contenant BL21 (DE3) cellules et puis incuber à 37 ° C, 150 tr/min pendant 45-60 min. propagation 100 µL de BL21 (DE3) cellules sur LB-agar assiettes contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et puis incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h.
1. Préparer lysogénie milieu de bouillon (LB) : 1 % wt/vol tryptone, 0,5 % wt/vol extrait de levure, 1 % wt/vol NaCl.
Ensemencer les cellules d’une seule colonie dans 5 mL de milieu de super bouillon (SB) contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicillineet de culture à 37 ° C, 220 tr/mn, du jour au lendemain. Puis, ensemencer 1 mL de culture dans 100 mL de milieu de SB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et de la culture à 37 ° C, 220 tr/mn pendant 4 h. Ensuite, transférer 10 mL de la culture dans 1 L de milieu de SB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et de la culture à 37 ° C, 220 tr/mn.
1. Préparer le bouillon de super : 3,2 % wt/vol tryptone, extrait de levure 2 % wt/vol, 0,5 % wt/vol NaCl.
Lorsque l' OD₆₀₀ atteint 0,6 - 0,8, ajouter isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,2 mM. Culture à 16 ° C, 180 tr/min pendant 36 à 48 heures pour l’expression périplasmique.

3. la GPC3-S-Fab périplasmique Purification

Préparation de la fraction périplasmique
1. Prélever des cellules par centrifugation à 4 000 x g, 4 ° C pendant 30 min, jeter le milieu et peser les cellules.
2. Remettre en suspension les cellules soigneusement dans 4 mL de solution de saccharose glacé (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 25 % (wt/vol) de sucrose et d’EDTA 1 mM) par gramme de cellules et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
3. Centrifuger à 8 500 g (dessus de table centrifugeuse, rotor de l’angle fixe), 4 ° C pour 20 min. Retirez le surnageant (la fraction de saccharose) et l’enregistrer sur la glace.
4. Remettre les boulettes dans un mélange glacé 5 mm de MgCl₂ et 1 mM de PMSF (4 mL par gramme de cellules). Ajouter 40 µL de l’action du lysozyme (15 mg/mL) par gramme et incuber sur glace pendant 30 min.
5. Centrifuger à 8 500 g (centrifugeuse de dessus de table, fixé le rotor de l’angle), 4 ° C pendant 20 min. transfert le surnageant (la fraction périplasmique) et enregistrez-le sur la glace.
6. Combiner la fraction de saccharose et de la fraction périplasmique et centrifuger à 30 000 x g, 4 ° C pour 30 min. Retirez le surnageant et enregistrez-le dans un tube conique de 50 mL sur la glace.
Purification d’affinité ni-NTA
1. Remettre en suspension 1 mL de Ni-NTA agarose en mélangeant bien pour obtenir une suspension homogène, prélever 1 mL de Ni-NTA agarose dans un tube conique frais 15 mL et ajouter 10 volumes (CV) de colonne un tampon d’équilibration (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 1 M de NaCl) s’équilibrer.
2. Centrifuger à 400 g pendant 5 min et retirer le liquide surnageant avec précaution. Puis, ajoutez l’agarose de Ni-NTA dans le tube de 50 mL contenant la fraction de saccharose et de la fraction périplasmique. Roche à 4 ° C pendant 2 h.
3. Centrifuger le mélange à 400 g, 4 ° C pendant 5 min. Retirer délicatement le surnageant dans un autre tube glacé fraîche comme la fraction libre. Transférer l’agarose de Ni-NTA dans une colonne de gravité.
4. Ajouter 10 CV de tampon de lavage (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 1 M de NaCl ; 20 mM, 30 mM ou 40 mM de l’imidazole) à la colonne et collecter l’élution comme la fraction de lavage.
  NOTE : Ces solutions devraient être ajoutées par ordre croissant des concentrations d’imidazol.
5. Ajouter 3 CV d’élution de la mémoire tampon (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 300 mM de NaCl ; 100 mM, 200 mM, 300 mM ou 400 mM de l’imidazole) à la colonne et de recueillir l’élution fraction d’élution 1, 2, 3 et 4.
  NOTE : Ces solutions devraient être ajoutées par ordre croissant des concentrations d’imidazol.
6. Dialyse les fractions éluées dans 2 L de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄, 2 mM de KH₂PO₄, pH 7,4) utilisez un tuyau de dialyse (12,4 kDa) à 4 ° C pendant 2 h. vérifier la présence de GPC3-S-Fab de 12 % SDS-PAGE et ensuite par Une coloration bleu de Coomassie.
Purification d’affinité igG-CH1
1. Transférer 1 mL de résine IgG-CH1 dans un tube conique de 50 mL et laver d’abord les perles avec du PBS. Ensuite, ajouter la solution de dialyse contenant GPC3-S-Fab après l’étape 3.2.6. Roche à 4 ° C pendant 2 h.
2. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min, 4 ° C. Retirer le surnageant dans un autre tube glacé fraîche soigneusement et transférer la résine dans une colonne de gravité.
3. Ajouter 10 CV de lavage tampon (PBS) à la colonne et de recueillir l’élution comme la fraction de lavage.
4. Préparer les tubes de prélèvement en ajoutant 1 M Tris pH 9,0 (0,1 mL de chacune des fractions éluées par mL). Éluer avec tampon d’élution 3 CV (0,1 M de glycine-HCl, pH 2,7) et recueillir la fraction éluée ; répéter 3 fois.
5. Dialyse les fractions éluées dans 2 L de PBS à l’aide de tubes de dialyse (12,4 kDa) à 4 ° C pendant 2 h. répéter deux fois.
6. Déterminer la concentration de protéine par ultramicrospectrophotometer (coefficient d’extinction molaire : 91105. 1 A₂₈₀= 0,69 mg/L).

4. SDS-PAGE et analyse Western-Blot

Prendre un 10 µL de l’échantillon en 5 x tampon de charge SDS et bien mélanger. Faire bouillir le mélange de protéine à 100 ° C pendant 5 min.
1. Préparer 5 x tampon de charge SDS : 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % wt/vol SDS, 0,5 % wt/vol bleu de bromophénol, 50 % vol/vol glycérol, 5 % vol/vol bêta-mercaptoéthanol.
Préparer un gel SDS-PAGE, avec un chargement gel (5 %) et le gel de séparation (12 %) comme décrit précédemment²⁶^,²⁷^,²⁸.
Charger 10 µL du mélange de protéines bouillies et marqueur de protéine et exécuter le SDS-PAGE.
Souillez le gel en agitant pendant 20 min avec solution bleue de Coomassie brillant et procédez de décoloration.
Pour éponger occidental, après le transfert sur une membrane de PVDF, bloquer la membrane avec un mélange TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 % vol/vol Tween 20) + 5 % wt/vol écrémé lait pendant 1 h à température ambiante en agitant.
Incuber la membrane avec des anticorps primaires (anti-His ou Anti-Flag) dilué 1:2,000 dans un mélange TBST + 5 % de lait écrémé pendant 1 h.
Laver avec un mélange TBST pendant 5 min à température ambiante et répéter 3 fois.
Incuber la membrane en 1:2,000 anticorps secondaire (HRP-liée de Fc anticorps anti-souris) dilué dans un mélange TBST + 5 % de lait écrémé pendant 1 h.
Laver avec un mélange TBST pendant 5 min à température ambiante et répéter 3 fois.
Ajouter 1 mL de substrat HPR par film, développer et prendre des photos.

5. gel Filtration analyse

Utilisez la colonne suivante : volume de la colonne de 24 mL ; Tampon d’équilibration du tampon au phosphate pH 7.4 ; Débit de 0,5 mL/min à la température ambiante ; Volume de l’échantillon de 200 µL.
Utiliser le volume suivant de protéine et la concentration : 500 µL de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min et prendre 200 µL à charger.
Pour la protéine marqueur volume et la concentration, prendre 100 µL du cytochrome C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL d’anhydrase carbonique (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL d’albumine (10 mg/mL, 66 kDa) et 200 µL de l’alcool déshydrogénase (5 mg/mL, 150 kDa) dans un tube. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min et prendre 200 µL à charger.
Avant chaque course, laver avec au moins 2 CV d’eau distillée à un débit de 0,5 mL/min.
Équilibrer la colonne avec au moins 2 CV du tampon d’équilibration (PBS, pH 7,4) à un débit de 0,5 mL/min.
Automatiquement injecter l’échantillon à 0,5 mL/min pour charger l’échantillon.
Éluer avec tampon d’équilibration à 0,5 mL/min et détecter à 280 et 215 nm.

6. analyse en cytométrie en flux

Culture la HepG2 Hep3B (GPC3 positive), Huh7 (GPC3 positive), (GPC3 positif) et les cellules de la CSMC - 97H (GPC3 négatif) dans les plats en plastique 100 x 20 mm, contenant un milieu DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO₂.
Cellules CHO (GPC3 négatif) de la culture et des cellules CHO/GPC3 nourrissait l’ADNc pleine longueur de GPC3 humaine (GPC3 positif) dans des plats en plastique 100 x 20 mm contenant le milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS, pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO₂.
Culture du NK92/CD16 nourrissait l’ADNc pleine longueur de CD16 humaine (CD16 positif) dans le flacon de² de 25cm contenant le milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS, pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO₂.
Quand les cellules sont jeter confluentes, de 70 à 90 % la moyenne et laver les cellules avec 2 mL de PBS. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2-3 min (ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher de la surface). Ajouter 1 mL de milieu de croissance complète pour neutraliser la trypsine et remettre en suspension les cellules par pipetage doucement verticalement.
Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer et détecter la viabilité cellulaire par le bleu Trypan.
Collecter 3 x 10⁶ cellules pour chaque lignée cellulaire. Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA pour remettre en suspension les cellules. Centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. de répéter deux fois.
Ajouter 0,3 mL de PBS + 0,2 % de BSA pour remettre en suspension les cellules et transférer 100 µL (environ 1 million) dans chaque tube à fond rond 5 mL en polystyrène.
Remarque : S’il vous plaît assurez-vous que toutes les mesures d’ici pour les tubes doivent être conservés au froids sur la glace. Lorsque l’anticorps est lier à l’antigène de surface de cellules, le complexe va commencer à assimiler. En le gardant froid, le processus est sensiblement ralenti.
Ajouter 10 µL d’anticorps primaires (GPC3-S-Fab ou humain IgG1, concentration finale 5 µg/mL) dans chaque tube et incuber sur glace pendant 1 h.
Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA au lavage et centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. répéter trois fois.
Remettre en suspension dans 100 µL de PBS + 0,2 % de BSA, puis ajouter 0,5 µL d’anticorps secondaire (anti-humain IgG(H+L)-488, final concentration de 10 µg/mL) et incuber sur glace pendant 1 h. Remarque : cette étape, s’il vous plaît garder les cellules de la lumière.
Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA au lavage et centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. répéter trois fois.
Analyser les cellules par cytomètre en flux selon le protocole standard²⁹. Acquisition de cellules avec un laser à 488 nm pour l’excitation.

7. cytotoxiques dosages

Préparer les cellules tumorales.
1. La culture HepG2, Hep3B, Huh7, CSMC - 97H et CHO lignées cellulaires comme décrit aux points 6.1 à 6.5.
2. Diluer les cellules à 0,5 × 105/ml et plaque 100 µL des cellules (5 000 / puits) sur des plaques de 96 puits. 6-8 h pour permettre à des cellules d’attacher la culture.
Préparer les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC).
1. Diluer le sang préparé frais avec un volume égal de PBS dans un tube conique de 50 mL. Par exemple, diluer 10 mL de sang avec 10 mL de PBS.
2. Prendre 15 mL de milieu de séparation de lymphocytes dans un tube conique frais 50 mL. Transférer le sang dilué sur le milieu de séparation de lymphocytes le long du côté de tube lentement.
  Remarque : Maintenez le tube vertical. Ne pas casser la surface du milieu de séparation de lymphocytes.
3. Centrifuger à 400 g pour 35 min à température ambiante avec le frein.
4. Lentement enlever la couche supérieure de plasma et prendre la couche de sang blanc contenant des PBMC à l’interface moyen de séparation plasma-lymphocyte.
5. Diluer les PBMC avec un volume double de PBS + 2 % FBS. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
6. Laver les cellules deux fois avec du PBS + 2 % FBS. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min. compter le nombre de cellules comme indiqué au point 6.5.
Préparer les cellules NK.
1. Préparer la suspension de PBMC à une concentration de 5 x 10⁷ cellules/mL dans du PBS + 2 % FBS et place dans un tube à fond rond 5 mL en polystyrène.
2. Ajouter NK humaine un enrichissement Cocktail à 50 µL/mL de cellules. Bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min.
3. Remettre les particules magnétiques de la cellule NK kit de l’enrichissement et bien mélanger pour s’assurer qu’ils sont uniformément suspendues en pipettant également, haut et bas vigoureusement plus de 5 fois. Transférer les particules remises en suspension magnétique à 100 µL/mL de la suspension cellulaire. Bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.
4. Aligner la suspension cellulaire jusqu'à un volume total de 2,5 mL en ajoutant PBS + 2 % FBS. Mélanger les cellules dans le tube de pipetage doucement et descendre de 2 - 3 fois. Placer le tube (sans un bouchon) dans l’aimant. Laisser les billes magnétiques s’installent pour 2,5 min à température ambiante.
5. Retirer l’aimant. Dans un mouvement continu, il faut inverser le tube, décanter la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube.
6. Compter le nombre de cellules comme indiqué au point 6.5.
Mettre en place la réaction cytotoxique.
1. Diluer les cellules NK à 5 × 10⁵ cellules/mL en utilisant le milieu de culture correspondant. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules NK les cellules tumorales plaqué sur une plaque à 96 puits.
2. Ajouter 10 µL de GPC3-S-Fab à différentes concentrations, avec la dose la plus élevée à une concentration finale de 30 µg/mL, 3 fois dilution, 9 points (trois répétitions).
3. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO₂ pendant 72 h.
4. Après 72 h d’incubation, enlever le milieu et ajouter 100 µL de milieu DMEM contenant 10 µL de réactif de CCK8 dans chaque puits en plaques 96 puits et puis incuber à 37 ° C.
5. Lire la plaque à 450 nm à 1, 2, 3 et 4 heures après l’ajout du réactif de CCK8.
6. Analyser les données. Calculer le taux de survie (DO 450 _{GPC3-S-Fab + effecteur + tumeur} - DO 450 _moyen) / (DO 450 _tumeur - DO 450 _moyen) × 100 % et (DO 450_{GPC3-S-Fab + tumeur} - DO 450 _moyen) / ( _tumeur de la DO 450 - DO 450 _moyen) × 100 %. Les cellules effectrices sont les cellules NK.

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Representative Results

Purification de GPC3-S-Fab

GPC3-S-Fab a été purifiée d’e. coli par une purification d’affinité en deux étapes, tout d’abord avec Ni-NTA-agarose, suivie de la purification d’affinité IgG-CH1. Après la purification d’affinité en deux étapes, GPC3-S-Fab a été purifiée jusqu'à homogénéité avec les deux chaînes proche de 1:1 (Figure 2 a). La présence de polypeptides fois VHH VH-CH1-CD16 et VL-CL peut être identifiée par leurs étiquettes distinctes de C-terminal, anti-son pour le VL-CL environ de 25 kDa et Anti-Flag pour la VH-CH1-VHH environ 38 kDa (Figure 2 b). Après la purification d’affinité en deux étapes, ~1.2 mg de protéine peut provenir de 1 L de culture de SB. Afin de caractériser la GPC3-S-Fab purifié, filtration sur gel a été réalisée. Selon les marqueurs standards (Figure 2), GPC3-S-Fab a été identifié comme un monomère homogène sous la forme d’un hétérodimère avec une taille moléculaire d’environ 63 kDa (Figure 2).

Activités de liaison GPC3-S-Fab

Afin de déterminer si la GPC3-S-Fab reconnaît les cellules GPC3 positives et les cellules positives CD16, analyse en cytométrie en flux a été réalisée en utilisant les lignées de cellules de cancer du foie GPC3 séropositifs HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 et la lignée de cellules de cancer du foie GPC3 négatif, CSMC - 97H et les cellules CHO. La GPC3-S-Fab pouvant lier à toutes les cellules de GPC3 positifs, bien qu’avec une liaison plus faible à Hep3B (Figure 3 b) et de cellules Huh7 (Figure 3) que HepG2 (Figure 3 a) et CHO/GPC3 (Figure 2F). N’ou liaison minimale aux cellules négatives GPC3 CSMC - 97H et CHO a été observée (Figure 3D, 3E). La GPC3-S-Fab pourrait également lier aux cellules positives CD16, cellules NK92/CD16 (Figure 3). Ces résultats concordent avec les résultats antérieurs à l’aide d’autres anti-GPC3 anticorps³⁰, ce qui suggère que GPC3-S-Fab peut lier spécifiquement les lignées GPC3 séropositifs et cellules CD16 positives.

Pour évaluer la cytotoxicité de GPC3-S-Fab, les cellules tumorales sont incubées avec des cellules NK isolés fraîches avec différentes concentrations de GPC3-S-Fab. Sans les cellules NK, GPC3-S-Fab n’avait aucune cytotoxicité contre les cellules tumorales quel que soit le statut d’expression GPC3 (Figure 4). En présence de cellules NK, GPC3-S-Fab déclenchée forte cytotoxicité contre les cellules HepG2, Hep3B et Huh7 de manière dose-dépendante, mais a montré aucun effet sur les cellules négatives GPC3 CSMC - 97 H (Figure 4), ce qui suggère que la cytotoxicité de GPC3-S-Fab dépend de la GPC3 expression sur la surface des cellules tumorales.

La figure 1. Constructions de GPC3-S-Fab
(A) l’expression bactérienne des constructions de GPC3-S-Fab. Les constructions contiennent une séquence signal pelB , un humanisés anti-GPC3 (CG33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (chaîne lourde), ou un VL-CL (chaînes légères). Pour faciliter la détection de protéines et de purification, un indicateur de balise ou un His8 a été ajouté à l’extrémité C-terminale. (B) Diagramme de GPC3-S-Fab après la co-expression.

La figure 2. Purification de GPC3-S-Fab de e. coli.
Panneau de gauche (A), après une chromatographie d’affinité Ni-NTA ; Panneau de droite, après la chromatographie d’affinité anti-IgG-CH1 ; M, échelle de poids moléculaire ; Une coloration bleu de Coomassie. Panneau de gauche (B), après une chromatographie d’affinité Ni-NTA ; Panneau de droite, après la chromatographie d’affinité anti-IgG-CH1 ; M, échelle de poids moléculaire ; Western-Blot. (C) Gel analyse de filtration de GPC3-S-Fab. Panneau supérieur, marqueurs standards ; panneau inférieur, GPC3-S-Fab. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. GPC3-S-Fab reconnaît GPC3 cellules positives et CD16 séropositifs.
Analyse d’écoulement cytometry de HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), CSMC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) et les cellules NK92/CD16 (G) a été exécuté comme décrit dans le protocole. Ligne rouge : tumeur des cellules uniquement ; Ligne verte : isotype contrôle, cellule tumorale humain IgG1 + anti-humain IgG(H+L)-488 ; ligne bleue : cellule tumorale + GPC3-S-Fab + anti-IgG (H + L)-488 humaines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 4. GPC3-S-Fab favorise l’apoptose des cellules cancéreuses GPC3 séropositifs.
Analyses de cytotoxicité dépendante de la dose ont été réalisées comme décrit dans le protocole pour HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C) et la CSMC - 97 H (D). Les concentrations de GPC3-S-Fab provenaient de 0,0045 µg/mL à 30 µg/mL. Les données sont la moyenne de géométrie avec des barres d’erreur qui représente l’écart-type. Cercle plein, seulement GPC3-S-Fab ; place du solide, GPC3-S-Fab+ NK, cellules NK (50 000 / puits) et des cellules cibles (5 000 / puits). Les mélanges ont été incubées pendant 72 h avant la mesure de la cytotoxicité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons une stratégie visant à construire un nouveau format de bsAbs, GPC3-S-Fab, qui peut recruter des cellules NK, ciblant les cellules tumorales positif GPC3. Le S-Fab est basé sur la Fab naturel format en ajoutant un anti-CD16 VHH¹¹^,¹². Par rapport à la région de Fc contenant bsAbs, GPC3-S-Fab peut facilement être produit dans le périplasme des bactéries sur une grande échelle.

À l’aide de la stratégie d’expression et purification décrite dans le protocole, nous avons obtenu un soluble et fonctionnelle GPC3-S-Fab en grandes quantités. Pour faciliter l’expression périplasmique, un signal séquence pelB a été ajouté à l’extrémité N de diriger la sécrétion pour le périplasme des e. coli¹⁷. Par contraste avec le cytoplasme, l’environnement plus oxydant dans l’espace périplasmique entre les membranes cytoplasmiques et externes est équipé d’un certain nombre de protéines importantes pour le repliement des protéines et de l’Assemblée et favorise ainsi le correcteur pliage et solubilité des protéines recombinantes,¹⁶. Toutefois, le mécanisme de repliement des protéines et de l’exportation vers le périplasme chez e. coli a capacité limitée. Haute expression de protéines recombinantes souvent entraîne l’accumulation d’un produit insoluble dans le périplasme¹⁶. Pour éviter la forte expression de la protéine sur une courte période de temps, l’IPTG faible (0,2 mM) et à basse température (16 ° C) dans un milieu nutritif ont été appliqués dans le présent protocole pour éviter l’accumulation de protéines insolubles. Dans cette étude, ~1.2 mg de protéine a été obtenue de 1 L de milieu, améliorer les rendements au moins 2 fois par rapport aux précédentes œuvres¹².

Pour éviter la dégradation des protéines, toutes les fractions contenant GPC3-S-Fab dans différentes étapes devraient être gardées sur glace. Avec son tag au C-terminal de VL-CL, Ni-NTA-agarose a été utilisé pour la purification. Cependant, seul Ni-NTA-agarose purification n’est pas suffisante pour éliminer les protéines indésirables, comme la protéine de VL-CL non apparié. Pour purifier l’hétérodimère homogène GPC3-S-Fab, la deuxième étape, purification d’affinité anti-IgG-CH1, a été appliqué. La protéine purifiée avait deux polypeptides proche de 1:1 et haute pureté (Figure 2 a-2 b).

Chromatographie de filtration sur gel permet de déterminer le poids moléculaire des protéines selon leur tailles moléculaires et les formes ; analyser le degré de pureté ; et déterminer si la protéine purifiée est un monomère, dimère, ou composés de granulats¹⁵. Par chromatographie par filtration sur gel, GPC3-S-Fab a été identifié avec la taille moléculaire attendue d’environ 63 kDa, qui prend la forme d’un monomère avec l’hétérodimérisation de GPC3-S-Fab (Figure 2).

Cytométrie en flux peut déterminer si un anticorps peut lier son antigène sur la membrane cellulaire, par rapport aux traditionnel western-blot et ELISA, qui seulement détecter les réactions de liaison antigène-anticorps. Par analyse en cytométrie en flux, GPC3-S-Fab reconnu la GPC3 sur la membrane cellulaire, ce qui suggère que la portion GPC3-Fab était fonctionnelle. Lorsque vous effectuez l’analyse en cytométrie en flux, il est essentiel de garder toutes les étapes sur la glace ou à 4 ° C après ajout de l’anticorps. Lorsque l’anticorps se lie à l’antigène de surface de cellules, le complexe antigène-anticorps amorcera internalisation. En le gardant froid, le processus d’internalisation est considérablement ralenti.

PBMC et les cellules NK ont été efficacement isolés de sang périphérique humain par centrifugation par séparation lymphocytes moyen, suivie de la cellule magnétique activé tri des stratégies. GPC3-S-Fab a montré puissante cytotoxicité contre les cellules positives GPC3 lorsque le ratio des cellules NK pour cibler les cellules (cellules tumorales) était de 10:1, et le ratio des cellules NK pour cibler les cellules pourrait varier de 50 : 1 à 5:1.

En résumé, GPC3-S-Fab, qui peut être produit dans un système d’expression de micro-organisme, fournit une nouvelle voie pour créer des formats fonctionnelles de bsAbs contre les tumeurs.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu financièrement par la R & D Plan de la Province du Guangdong (Chine) (2016A050503028).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaking incubator	Thermo Fisher	MAXQ 4000
Shaking incubator	Zhicheng	ZWYR-D2402
Centrifuge	Cence	GL-10MD
Centrifuge	Beckman coulter	Avanti j-26S XPI
Centrifuge	eppendorf	5810R
Ultraviolet spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Mini-PROTEAN® Tetra	Bio-rad
Trans-blot apparatus	Criterion	Bio-rad
Imaging system	Bio-rad	chemidoc tm XRS+
Fast Protein Liquid chromatogram	GE Healthcare	AKTA avant
GF column	GE Healthcare	28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow Cytometer	Beckman coulter	FC500
Centrifuge	eppendorf	5702R
Envision plate reader	TECAN	Infinite F50
Anti His-tag	eBioscience	14-6657-82
anti-Flag-tag	Sigma	F1804
anti-human(H&L)-488	A11013	Invitrogen
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody	Cell Signaling	7076S
Ni-NTA-Agarose	Tribioscience	TBS9202-100
IgG-CH1 affinity resin	Thermo Fisher	194320005
Ficoll-Plaque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
NK cell enrichment kit	Stemcell	19055
Magnet	Stemcell	18000
CCK8 kit	Dojindo	CK04
DMEM	Gibco	C11995500CP
RPMI-1640	Gibco	C11875500CP
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F2442
Trypsin	Gibco	15050-057
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Cell culture
Standard marker	Sigma Aldrich	MWGF200	Gel filtration
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)	VWR chemicals	VWRC0487-100G
Dialysis tubing	Sigma Aldrich	D0655-100FT
Knanamycine	VWR	VWRC0408-100G
Ampicillin	VWR	VWRC0339-100G
Tryptone	Thermo Fisher	LP0042B
Yeast Extract	Thermo Fisher	LP0021B
NaCl	Sangon Biotech	A100241
Trizma base	Sigma Aldrich	T6791-1KG
EDTA	Sigma Aldrich	V900106
Glycine	aladdin	A110752-500g
KCl	aladdin	P112134-500g
MgCl	Sigma Aldrich	V900020
Agar	Sangon Biotech	A505255-0250
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	VWR	7778-77-0
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)	VWR	7558-79-4
2-Mercaptoethanol	VWR	60-24-2
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)	VWR	329-98-6
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250	VWR	VWRC0472-50G
Bromophenol blue	Sangon Biotech	A500922-25G
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	VWRC0332-100G
Glycerol	Sigma Aldrich	V900122
100mm x 20mm plastic dish	Corning	430167
25cm2 flask	Corning	430639
96 well cell culture cluster	Corning	3599
Sucrose	Sangon Biotech	A610498-0005
CHO	the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences	GNHa 3
MHCC-97H	the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences	SCSP-528
HepG2	the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences	TCHu 72
Huh7	the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences	TCHu182
Hep3B	the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences	TCHu106
NK92	ATCC	CRL2408

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References

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Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité

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Wang, Y., Liu, J., Pan, H., Xing,… More

Wang, Y., Liu, J., Pan, H., Xing, J., Wu, X., Li, Q., Wang, Z. A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (137), e57588, doi:10.3791/57588 (2018).

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