Summary
紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。
Abstract
このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。
Introduction
モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。
現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。
Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、5の増加の可能性が侵害します。対照的に、工場ベース bsAbs はネイティブの Fab 部位4,6CH1 と CL の heterodimerization によるより安定しています。
重鎖だけ抗体 (VHHs、単一ドメイン抗体とも呼ばれます) から可変ドメインは、自然の重鎖抗体7のアクティブな抗原結合フラグメントです。VHHs 細菌の表現9に従来の Igg8、低免疫原性、高収率の特異性、親和性が高い特性があります。VHHs Fv 断片と比較して、高い熱安定性10があります。VHHs Fab 部分と比べると、CH1 と CL の不足のための小さいサイズがあります。したがって、S ・ Fab、単一ドメイン抗体、VHH、Fab をリンクすることによって得られる bsAb 形式を設計、その抗腫瘍効果11,12を勉強します。
本研究では抗 CD16a VHH14 hGC3313のファブをリンクすることにより GPC3 S 工場の建設が記述されていた。GPC3 S 工場は、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)のペリプラズム式で効率よく製作できます。GPC3 S 工場の機能調査は、GPC3 S Fab が肝臓癌療法のための有望な戦略であることを提案しました。したがって、簡単な生産と精製より安定した bsAbs 以前の研究に適用可能な参照を持つ代替技術上 GPC3 S 工場の利点があります。
哺乳類発現系と prokaryotic 表現システムは、BsAbs のさまざまな形式を表現するために使用されています。哺乳動物発現システム、大腸菌とは異なり-ベースのタンパク質発現系高収量、低コスト ・省力化、遺伝子操作と高変換効率15の容易さなど多くの利点があります。BsAbsエシェリヒア属大腸菌で、式の 2 つの基本的な戦略があります: 細胞質と細胞質と細胞膜の外側15ペリプラズムに式で表現します。細胞質の還元環境と比較して、ペリプラズムより酸化のフォールディングを促進する環境と共発現タンパク質16の。正しい折りたたみ bsAbs の溶解性、安定性、機能の生成に重要な役割を果たしています。したがって、信号シーケンス pelB はエシェリヒア属大腸菌の17のペリプラズムに分泌を直接に S 工場の N 末端に追加されました。確保するために、折りたたみ、溶解性、熱安定性、構造安定性、複雑さと抗体のサイズを減らすことは正しい頻繁16が採用。S ・ Fab 形式は 1 つの Fab と 1 つ VHH、小型、シンプルな構造により可能性のある細菌のシステムで非常によく表現されるから成っています。
GPC3 は、GPC3 S Fab バイスペシフィック抗体形式で選ばれました。グリピカン 3 (GPC3) 一種 (GPI)18を介して細胞表面に固定されているヘパリン硫酸 (HS) プロテオグリカン家族のメンバーであります。Gpc3 由来は肝臓癌19,20,21,22の大部分を占める肝細胞癌 (HCC) の場合の 70% の発現です。Gpc3 由来がほとんど表されるので正常組織には、gpc3 由来は肝細胞癌に対する潜在的なターゲットとして提案されています。GPC3 に対して複数のマウスのモノクローナル抗体を生産されています。GC33 のみ展示限定の抗腫瘍活性22, し、それは患者の臨床効果を示すことに失敗しました。本研究では GPC3 S 工場は14gpc3 由来腫瘍の細胞を殺す NK 細胞を募集できるように示されました。
NK 細胞を募集、抗 CD16 VHH を使用しました。CD16a は、低親和性 IgG 受容体、ナチュラル キラー (NK) 細胞、マクロファージ、単球、T 細胞のいくつかのサブタイプに主に表現されます。NK 細胞23細胞抗体依存性細胞傷害 (ADCC) にかかわる。ヒト NK 細胞は、CD56 の 2 種類に分類できます - CD16 + と CD56 + CD16-。CD56 + CD16− NK 細胞、CD56 と対照をなして-CD16 + NK 細胞はパーフォリンおよびグランザイム B の高いレベルを解放でき、したがって24強い細胞毒性を提示します。CD16a を表現するクッパー細胞 (KCs) は、肝マクロファージです。クッパー細胞は、肝臓癌25の抑制に重要な役割を果たします。したがって、ターゲット CD16a bsAbs より魅力的な肝臓がんに対する T 細胞より有望な戦略があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
人間の血のコレクションを含むプロシージャをすべては、太陽 Yat Sen 大学倫理委員会で承認されました。
1. GPC3 S 工場デザイン戦略
- アンチ GPC3 (ヒト GC3313) を抗 CD16 VHH14 (図 1) の工場にリンクして GPC3 S 工場を設計します。
- 合成し、以前に報告された12として pET26b と pET21a のベクトルに VH CH1-CD16 VHH と VL CL のクローンします。
2. 変換と文化
- 追加 100 100 VH-CH1-CD16 (図 1 a) を含む pET26b の ng 主務 BL21 の 100 μ L に VL CL (図 1 a) を含む pET21a の ng (DE3) 細胞。よく混ぜると氷 45 90 s、転送、42 ° C の水浴中 30 分加温の上を孵化し、氷上 3-5 分の間孵化させなさい。
- BL21 を含むチューブにホストゲノム スープ (LB) 媒体の 500 μ L を追加 (DE3) 細胞し、37 ° c、45-60 分 150 rpm BL21 の広がる 100 μ L をインキュベーションして (DE3) セル LB 寒天培地プレート含む 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンの 100 μ g/mL、12-16 h の 37 ° C で、孵化させなさいと。
- ホストゲノム スープ (LB) メディアの準備: 1 %wt/巻トリプトン、0.5 %wt/巻酵母エキス、1 %wt/巻塩化ナトリウム。
- 一晩 50 μ G/mlカナマイシンの 100 μ g/mL 37 ° c、220 rpm は、アンピシリン、文化を含むスーパー スープ (SB) 培地 5 mL に単一コロニーから細胞を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C、4 h 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 100 mL に文化の 1 mL を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C, 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 1 L に 10 mL の文化を転送します。
- スーパー スープ メディアの準備: 3.2 %wt/巻トリプトン、2 %wt/巻酵母エキス、0.5 %wt/巻塩化ナトリウム。
- 外径600に達する 0.6 - 0.8 は 0.2 mM の最終的な集中にイソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG) を追加します。16 ° c、ペリプラズム式の 36-48 時間 180 rpm 文化。
3. GPC3 S Fab ペリプラズム浄化
- ペリプラズム画分調製
- 4,000 x g、30 分のための 4 ° C で遠心分離によって細胞を収集、媒体を破棄し、セルの重量を量る。
- 冷たいショ糖液 (pH 7.5 トリス-HCl の 20 mM; 25% (重量/巻) ショ糖と 1 mM EDTA の) 細胞の 1 グラムあたり 4 mL を徹底的に細胞を再懸濁し、15 分間氷の上を孵化させなさい。
- 遠心分離機 (テーブル トップ遠心分離機、固定角ロータ) 8,500 x g で 4 ° C 20 分清 (ショ糖の割合) を削除、保存氷の上。
- 冷たい 5 mM MgCl2 PMSF (グラム セルあたり 4 mL) の 1 mM のミックスでペレットを再懸濁します。グラムあたり、リゾチーム株式 (15 mg/mL) 40 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。
- 4 ° C、20 分清 (ペリプラズム画分) の転送 8,500 × g (テーブル トップ遠心、固定角ロータ) で遠心し、氷の上保存します。
- 氷の上の 50 mL の円錐管に 30 分は上澄みを除去、保存 30,000 × g、4 ° C で遠心し、糖画分およびペリプラズム画分を組み合わせます。
- Ni NTA の親和性の浄化
- 均質な懸濁液を達成するため、Ni NTA 寒天新鮮な 15 mL の円錐管に 1 mL を削除および 10 列ボリューム (CV) 平衡バッファーを追加する徹底的に混合することによって Ni NTA agarose の 1 mL を再懸濁します (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M NaCl の) 平衡に。
- 5 分 400 x g で遠心し、上清を慎重に削除します。その後、糖画分およびペリプラズム画分を含む 50 mL のチューブに Ni NTA アガロースを追加します。2 h の 4 ° C でロック。
- 400 x g で混合物を遠心分離機、4 ° C、5 分は、非連結の一部として別の新鮮な冷たいチューブに上清を慎重に取り外します。重力列に Ni NTA アガロースを転送します。
- 10 を追加バッファーを洗浄の CV (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M 塩化ナトリウム; 20 mM、30 mM か 40 mM のイミダゾール) 列、および収集、洗濯分数として想定し, 浸出液に。
注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。 - 3 追加溶出の CV バッファー列を (pH 7.5; 300 mM NaCl のトリス塩酸 25 mM; 100 mM、200 mM、300 mM や 400 mM のイミダゾール) と溶出画分 1、2、3、および 4 として、想定し, 浸出液を収集します。
注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。 - 透析 2 l PBS (137 mM nacl、KCl、2.7 mM、Na2HPO4KH2PO4、pH 7.4 の 2 mM の 10 mM) の溶出画分 12% GPC3 S 工場の存在を確認 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して SDS ページし、次にCoomassie 青い染色。
- IgG CH1 の親和性の浄化
- IgG CH1 の親和性の樹脂の 1 mL を 50 mL の円錐管に転送し、まず PBS とビーズを洗ってください。3.2.6 のステップ後透析液 GPC3 S Fab を追加します。2 h の 4 ° C でロック。
- 400 x g で 5 分間遠心、4 ° C慎重に別の新鮮な冷たいチューブに上清を除去し、樹脂を重力列に転送します。
- 10 追加洗濯の CV バッファー列を (PBS) と洗浄分数として溶出を収集します。
- 1 M トリス pH 9.0 (各溶出画分の mL あたり 0.1 mL) を追加することによって、コレクション チューブを準備します。3 CV 溶出バッファー (pH 2.7 グリシン塩酸 0.1 M) で溶出し、溶出の端数を収集3 回繰り返します。
- 透析 2 l 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して PBS の溶出画分を 2 回繰り返します。
- Ultramicrospectrophotometer によるタンパク質濃度を測定 (分子吸光係数: 91105。 1 A280 = 0.69 mg/L)。
4. SDS-PAGE および西部のしみが付く分析
- 5 x SDS 読み込みバッファーにサンプルの 10 μ L を取るし、よく混ぜます。5 分間 100 ° C で蛋白質の混合物を沸かしなさい。
- 5 x SDS 読み込みバッファーを準備: トリス-HCl、pH 6.8, 10 %wt/巻 SDS の 250 mM、0.5 %wt/巻ブロモフェノールの青、5% 巻/巻 β-メルカプトエタノール、巻/集グリセリン 50%。
- 前述の26,27,28として読み込みゲル (5%) と分離ゲル (12%) の SDS-PAGE ゲルを準備します。
- ゆで蛋白質の混合物とタンパク質マーカーの 10 μ L を読み込み、SDS のページを実行します。
- Coomassie 鮮やかな青色の溶液に 20 分間揺れでゲルを染色し、染め色を行います。
- PVDF 膜に転送した後、西部のしみの tbst (20 mM トリス-HCl の nacl 0.1% 巻/巻トゥイーン 20 150 mM) 膜をブロック + 5 %wt/巻の揺れながら室温で 1 h のスキムミルクします。
- 一次抗体を持つ膜を孵化させなさい (反彼または反フラグ) TBST + 5% スキムミルク 1 h の 1:2,000 を希釈します。
- Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。
- TBST + 5 %1 h のスキムミルクで希釈した二次抗体 (HRP リンク抗マウス Fc 抗体) 1:2,000 で膜を孵化させなさい。
- Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。
- 映画 1 本あたりの HPR 基板の 1 mL を追加し、開発と画像を撮影。
5. ゲルろ過分析
- 次の列を使用する: 列量 24 mL。PBS pH 7.4; の平衡バッファー温帯; ルームで 0.5 mL/min の流速200 μ L のサンプル量。
- 次のタンパク質の量と濃度を使用して: 1.2 mg/mL GPC3 S 工場の 500 μ L。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。
- タンパク質マーカーの量と濃度は、1 つの管にシトクロム C の 100 μ L (2 mg/mL、12.4 kDa)、脱水 (3 mg/mL, 29 kDa) の 140 μ L、アルブミン (10 mg/mL、66 kDa) の 140 μ L、200 μ L アルコール脱水素酵素 (5 mg/mL, 150 kDa) を取る。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。
- 各実行する前に、少なくとも 2 で洗って 0.5 mL/min の流速で蒸留水の CV。
- 少なくとも 2 列を平衡平衡バッファー (PBS、pH 7.4) 0.5 mL/min の流量での CV。
- サンプルをロードする 0.5 mL/min でサンプルを自動的に挿入します。
- 0.5 mL/min で平衡バッファーで溶出し、280 と 215 nm で検出します。
6. 流れのフローサイトメトリー解析
- 文化、HepG2 (GPC3 陽性)、Hep3B (GPC3 陽性)、Huh7 (GPC3 陽性) および切除例が少ない-97 H (GPC3 負) 細胞 10% 牛胎児血清 (FBS)、(100 μ g/mL)、ペニシリン、ストレプトマイシン (50 μ g/mL) 37 ° c に DMEM 培地を含む 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器5% CO2。
- 文化町 (GPC3 負) 細胞と町/gpc3 由来細胞の 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器で実物大の人間 gpc3 由来 cDNA (GPC3 陽性)。
- 25 cm2フラスコ 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる実物大の人間の CD16 cDNA (CD16 陽性) をかくまっている NK92/CD16 を文化します。
- セルは 70-90% 合流、培地を除去、2 ml の PBS のセルを洗浄します。0.25% トリプシンの 1 mL を追加し、37 ° C で 2-3 分 (またはセルを開始表面からデタッチするまで) で孵化させなさい。トリプシンを中和し、再上下に軽くピペッティングにより細胞を停止する完全な成長培地 1 mL を追加します。
- ノイバウアー検定を使用してセル数をカウントし、トリパン ブルーによる細胞生存率を検出します。
- 3 x 106セルの各セルの行を収集します。1 mL の PBS + 0.2 %bsa 再度セルを中断するを追加します。200 × g で遠心分離、4 ° C、5 分 2 回の繰り返し。
- セルを再停止する PBS + 0.2 %bsa の 0.3 mL を追加し、100 μ L (約 100 万) を各 5 mL ポリスチレン丸底チューブに転送します。
注: 氷で、チューブにここからすべての手順を実行する必要があります保たれる寒さを確認してください。細胞表面抗原に抗体をバインドすると、複雑な内面化する開始されます。寒さそれを維持し、プロセスが著しく遅くなります。 - すべてのチューブに一次抗体 (GPC3 S Fab やヒト IgG1、最終濃度 5 μ G/ml) の 10 μ L を追加し、氷上で 1 時間インキュベートします。
- 1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。
- 100 μ L の PBS + 0.2 %bsa で再停止し、二次抗体 (抗ひと IgG(H+L) 488、最終濃度 10 μ g/mL) の 0.5 μ L を追加し、注 1 における氷の上を孵化させなさい: このステップから光からセルがください。
- 1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。
- 標準プロトコル29によるとフローサイト メーターによる細胞を分析します。488 nm レーザー励起用のセルを取得します。
7. 細胞毒性の試金
- 腫瘍細胞を準備します。
- 町、切除例が少ない-97 H、Huh7 Hep3B 文化 HepG2 細胞 6.1 6.5 の手順で説明するよう。
- 0.5 × 105/mL に細胞を希釈し、100 μ L 細胞 (ウェルあたり 5,000 細胞) 96 ウェルのプレート上にプレートします。セルを添付するように 6 ~ 8 h の文化.
- ひと末梢血単核球 (PBMCs) を準備します。
- 50 mL の円錐管に PBS の等しいボリュームと新鮮な準備ができて血液を希釈します。たとえば、10 mL を 10 mL の PBS で血液を希釈します。
- 新鮮な 50 mL の円錐管にリンパ球分離培地 15 mL を入れます。ゆっくりとチューブ側に沿ってリンパ球分離媒体に希釈血液を転送します。
注意: はチューブを垂直に注意します。リンパ球分離媒体の表面を壊さない。 - オフ ブレーキ部屋の温度で 35 分の 400 × g で遠心分離機します。
- ゆっくりと上部のプラズマ層を削除し、プラズマ リンパ球分離媒体界面 PBMCs を含む白血球層を取る。
- PBS + 2% の二重ボリュームの PBMCs を希釈 FBS。5 分間 400 × g で遠心分離機します。
- PBS + 2% で 2 回細胞を洗う FBS。手順 6.5 で説明したセル数字をカウントして 400 × g で 5 分間遠心します。
- NK 細胞を準備します。
- 5 x 107セル/mL の PBS + 2 %fbs、場所での濃度の PBMCs 懸濁液の準備に 5 mL ポリスチレン丸底チューブで。
- 50 μ L/mL の細胞にヒト NK 細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し 10 分間室温でインキュベートします。
- 彼らは一様にピペッティングによって中断されるように NK 細胞濃縮キットとよく混ぜるから、磁性粒子を上下に 5 回以上も精力的に再懸濁します。細胞懸濁液を 100 μ L/mL で再懸濁の磁性粒子を転送します。よく混ぜ、5 分間室温で孵化させなさい。
- PBS + 2% を追加することにより 2.5 mL の容量まで細胞懸濁液をもたらす政府短期証券。優しく上下に 2 - 3 回をピペッティングによりチューブに細胞をミックスします。磁石に (キャップ) なし管を配置します。落ち着く 2.5 分間室温磁気ビーズをしましょう。
- 磁石を削除します。1 つの連続的な動きで新しい管に濃縮細胞懸濁液を注いで、チューブを反転します。
- 6.5 の手順で説明されているように細胞数をカウントします。
- 細胞傷害性の反応を設定します。
- 5 × 105セル/mL に対応する培養培地を使用して NK 細胞を希釈します。96 ウェル プレートにメッキ腫瘍細胞に NK 細胞懸濁液 100 μ L を追加します。
- 30 μ g/mL、3 倍希釈、9 ポイント (3 つレプリケートします) の最終的な集中に最高用量と異なる濃度で GPC3 S 工場の 10 μ L を追加します。
- 37 ° c、5% CO2 72 時間インキュベートします。
- 培養 72 時間後、培地を取り除き、CCK8 試薬を各ウェルの 96 ウェル プレートでの 10 μ L を含む DMEM 培地を 100 μ l 添加し、37 ° c. で孵化し
- プレートが 450 nm で 1、2、3、および 4 h CCK8 試薬を追加した後。
- データを分析します。(OD450 GPC3 S Fab + エフェクター + 腫瘍- OD450媒体) として生存率を計算する/(OD450腫瘍- OD450媒体) × 100%、(OD450 GPC3 S Fab + 腫瘍- OD450中)/(OD450腫瘍-OD450媒体) × 100%。エフェクター細胞は、NK 細胞です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3 S 工場浄化
GPC3 S 工場から精製した大腸菌2 段階アフィニ ティー精製で最初 Ni-国税庁-アガロース、IgG CH1 の親和性の浄化が続くと.2 段階の親和性の浄化後 GPC3 S 工場は 1:1 (図 2 a) に近い 2 つのチェーンとの同質性を精製しました。VH CH1 CD16 VHH と VL CL ポリペプチドの存在は、別個の C 末端タグで識別できる反彼 VL CL 約 25 kDa と反フラグ VH-CH1-VHH 約 38 kDa (図 2 b)。2 段階の親和性の浄化後 ~1.2 mg タンパク質は SB 文化の 1 L から入手できます。さらに精製 GPC3 S Fab を特徴付ける、ゲルろ過を行った。標準的なマーカー (図 2) に基づき、GPC3 S 工場は約 63 kDa (図 2) の分子サイズでは heterodimer の形で同種の単量体として同定されました。
GPC3 S Fab 結合活性
GPC3 S Fab GPC3 陽性細胞と CD16 陽性細胞を認識するかどうかを評価するには、流れフローサイトメトリー分析を行った GPC3 負肝臓癌細胞ライン、町/GPC3 Huh7 Hep3B GPC3 陽性肝癌細胞株 hepg2 細胞を使用して切除例が少ない 97 H および CHO 細胞。GPC3 S 工場は Hep3B に弱い結合とすべての GPC3 陽性細胞にバインドでした (図 3 b) と Huh7 細胞 (図 3) より hepg2 細胞 (図 3 a) と町/GPC3 (図 2 f)。いいえ GPC3 負切除例が少ない-97 H と町のセルに最小限のバインディングが観察された (図 3 D 3E)、または。GPC3 S 工場はまた CD16 陽性細胞、NK92/CD16 細胞 (図 3) にバインドでした。これらの結果は、以前の結果を使用して他アンチ gpc3 由来抗体30GPC3 S 工場の GPC3 陽性細胞と CD16 陽性細胞がバインドできる具体的に示唆するいると一致しています。
GPC3 S Fab の細胞毒性を評価するには、腫瘍細胞 GPC3 S Fab の濃度の異なる新鮮な孤立した NK 細胞を培養されました。GPC3 S 工場は NK 細胞なし GPC3 式状態 (図 4) に関係なく腫瘍細胞に対する細胞毒性はなかった。NK 細胞の存在下で GPC3 S Fab HepG2、Hep3B、Huh7 細胞に対する強い細胞毒性を用量依存的にトリガーものの GPC3 負切除例が少ない-97 H 細胞 (図 4) に影響しないことを示唆する GPC3 S Fab の細胞毒性gpc3 由来腫瘍細胞の表面に表現に依存します。
図 1。GPC3 S 工場の構造
GPC3 S 工場の (A) 細菌の表現を構築します。構成要素には、ヒト化抗 GPC3 (GC33) VH CH1-抗 CD16 VHH (重鎖) または VL CL (軽鎖) pelB信号シーケンスが含まれています。蛋白質の検出そして浄化のため、フラグ タグや His8 タグは、C 末端に追加されました。(B) 図の GPC3-S-ファブ共同式の後。
図 2。GPC3 S 工場精製大腸菌。
Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの後 (A) 左側のパネル抗 IgG CH1 アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー; 後、右側のパネルM 分子量の梯子;Coomassie 青い染色。Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー; 後、(B) 左側のパネル抗 IgG CH1 アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー; 後、右側のパネルM 分子量の梯子;西部のしみが付きます。(C) ゲルの GPC3 S Fab のろ過分析。上部パネル、標準的なマーカー。底板、GPC3 S 工場。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。GPC3 S 工場は、GPC3 陽性細胞と CD16 陽性細胞を認識します。
Hepg2 細胞のフローサイトメトリー解析 (A) Hep3B (B) Huh7 (C) 切除例が少ない-97 H (D)、(E) 町町/GPC3 (F)、(G) の NK92/CD16 細胞がプロトコルで説明されているように行われました。赤線: 腫瘍細胞;グリーン ライン: アイソタイプ コントロール、腫瘍細胞 + ヒト IgG1 + 抗ひと IgG(H+L)-488;ブルーライン: 抗ひと IgG (H + L)-488 + GPC3 S Fab 腫瘍細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。GPC3 S 工場は、GPC3 陽性癌細胞の細胞死を促進します。
Hepg2 細胞のプロトコルに従って用量依存的細胞毒性試験を行った (A) Hep3B (B) Huh7 (C)、および切除例が少ない-97 H (D)。GPC3 S Fab の濃度は、30 μ G/ml 0.0045 μ G/ml から。データは、誤差範囲の標準偏差を表すトリプリケートの意味です。固体円のみ GPC3-S-工場;四角GPC3-S-Fab+ NK、NK 細胞 (ウェルあたり 50,000) と標的細胞 (ウェルあたり 5,000)。細胞毒性測定前に 72 時間培養し, 混合物。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。
プロトコルで説明されている発現と精製方法を使用すると、機能的な可溶性 GPC3-S-ファブ大量に得た。ペリプラズム発現を促進する、信号シーケンス pelB大腸菌17ペリプラズムに分泌を直接に N 末端に追加されました。細胞質とは対照的細胞と外側の膜の間ペリプラズム空間におけるより酸化環境タンパク質フォールディングとアセンブリのいくつかの重要な蛋白質が装備され従って訂正フォールディングを促進して16組換え蛋白質の容解性。ただし、タンパク質の折り畳みと大腸菌ペリプラズムへの輸出用機械には、容量が限られています。組換え蛋白質の高い表現はよくペリプラズム16で不溶性の製品の蓄積で起因します。時間の短い期間での高発現を避けるためには、低 IPTG (0.2 mM)、低温 (16 ° C) 栄養培地では、不溶性蛋白の蓄積を避けるためにこのプロトコルで適用されました。本研究では ~1.2 mg タンパク質は少なくとも倍前の作品12と比較して利回りを向上させる媒体の 1 L から得られました。
蛋白質の分解を避けるためには、さまざまなステップの GPC3 S 工場を含むすべての画分を氷の上保管してください。VL-の CL の C 末端タグ、彼の Ni-国税庁-アガロースは精製に使用されました。ただし、単一の Ni-国税庁-アガロース複合体の精製は不対 VL CL タンパク質などの不要な蛋白質を削除するのに十分ではありません。同種の二足 GPC3-S-ファブ、2 番目のステップを浄化するには、抗 IgG CH1 の親和性の浄化が適用されました。精製した高純度と 1:1 に近い 2 つのポリペプチド (図 2 a-2B)。
ゲルろ過クロマトグラフィーは、分子サイズと形状に基づく蛋白質の分子量を決定できます。純度の度を分析します。浄化された蛋白質が、単量体であるかどうかを決定して二量体、または集計15で構成します。ゲルろ過クロマトグラフィーによる GPC3 S Fab が予想される GPC3 ・ S-Fab (図 2) の heterodimerization と単量体の形では約 63 kDa の分子サイズで確認されました。
フローサイトメトリー抗体が伝統的なウエスタンブロットおよび ELISA、のみ抗原抗体結合反応を検出と比較して、細胞膜上の抗原をバインドできるかどうかを判断できます。流れ cytometry による GPC3 S Fab が細胞膜、gpc3 由来を認識し、GPC3 Fab 部位が機能を示唆しています。フローサイトメトリー解析を実行すると、抗体が追加された後、氷の上または 4 ° C での手順のすべてを保つために重要です。細胞表面抗原に結合する抗体、抗体-抗原複合体は内部化を開始します。寒さそれを維持し、内面化プロセスが著しく遅くなります。
PBMCs と NK 細胞リンパ球分離遠心沈降法によるひと末梢血から効率的に分離した媒体戦略を並べ替え磁気活性化細胞が続きます。NK 細胞が標的細胞 (腫瘍細胞) の比は 10:1 と 5:1 50: 1 から NK 細胞が標的細胞の比率が異なる場合、GPC3 S 工場は GPC3 陽性細胞に対して強力な細胞毒性を示した。
要約すると、gpc3 由来-S-ファブ、微生物式システムで作り出すことができる、腫瘍に対する bsAbs の機能的なフォーマットを作成する新たな手段を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
