Summary
Hier presenteren we een protocol om te produceren een antilichaam bispecifieke GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Het gezuiverde GPC3-S-Fab heeft krachtige cytotoxiciteit tegen GPC3 positieve lever kankercellen.
Abstract
Dit protocol beschrijft de bouw en functionele studies van een bispecifieke antilichaam (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs herkent twee verschillende epitopen door hun twee verschillende wapens. bsAbs zijn actief bestudeerd om hun vermogen om direct werven immune cellen te doden tumorcellen. Op dit moment worden de meeste bsAbs geproduceerd in de vorm van recombinante eiwitten, hetzij als bsAbs Fc-bevattende hetzij als kleinere bsAb derivaten zonder de Fc-regio. In deze studie werd GPC3-S-Fab, een antilichaam fragment (Fab) gebaseerde bispecifieke antilichaam, ontworpen door de Fab van anti-GPC3 antistof GC33 met een anti-CD16 één domein antilichaam te koppelen. De GPC3-S-Fab kan worden uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd door twee affiniteit chromatographies. Het gezuiverde GPC3-S-Fab kan specifiek binden aan en GPC3 positieve lever kankercellen doden door de indienstneming van natural killer cellen, hetgeen wijst op een mogelijke toepassing van GPC3-S-Fab in therapie leverkanker.
Introduction
Monoclonal antilichamen zijn nu over het algemeen gebruikt voor kanker behandeling1. Als gevolg van de flexibiliteit van antilichamen, werden diverse antilichaam gebaseerde formaten actief onderzocht. Vergeleken met monoklonale antilichamen, hebben bsAbs twee verschillende antigeen-bindende modules, waardoor ze te herkennen met twee verschillende doelen tegelijk en efficiënt leiden tot de aanwerving van immuun effector cellen te richten en te doden van tumor cellen2.
Huidige recombinante bsAb formaten kunnen over het algemeen worden toegewezen aan twee klassen: Fc-bevattende bsAbs en bsAbs zonder een Fc-regio. Vergeleken met Fc-bevattende indelingen die worden meestal geproduceerd in zoogdiercellen, bsAbs zonder een Fc-regio hebben de voordelen van kleinere, meer gemakkelijk in expressiesystemen micro-organisme worden geproduceerd, en tumor weefsels efficiënter kan doordringen 3.
bsAbs zonder een Fc-regio worden vaak gevormd door individuele bindend wordt, zoals één-keten variabele fragmenten (scFvs) of Fabs3te koppelen. Zonder de stabiliserende domeinen, bsAbs op basis van scFv fragmenten vaak geknoeid thermische stabiliteit, lage oplosbaarheid of een toegenomen potentieel voor aggregatie4,5. Fab gebaseerde bsAbs zijn daarentegen meer stabiel als gevolg van de heterodimerization van de CH1 en CL in de inheemse Fab deel4,6.
Variabele domein van zware-keten-only-antilichamen (VHHs, ook wel aangeduid als één domein antilichamen) zijn de actieve antigeen-bindende fragment van natuurlijke zware-keten antilichamen7. VHHs hebben de kenmerken van hoge affiniteit, specificiteit van conventionele IgGs8, lage immunogeniciteit en hoge opbrengst in bacteriële expressie9. Vergeleken met de Fv fragmenten, hebben VHHs hogere thermische stabiliteit10. Vergeleken met Fab wordt, hebben VHHs kleinere maten als gevolg van het ontbreken van CH1 en CL. S-Fab, de bsAb formaat, verkregen door het koppelen van de Fab met een enkel domein antilichamen, VHH, is zo ontworpen en studeerde voor zijn anti-tumor effecten11,12.
In deze studie werd de bouw van GPC3-S-Fab door het koppelen van de Fab van hGC3313 met een anti-CD16a VHH14 beschreven. De GPC3-S-Fab kan efficiënt worden geproduceerd door periplasmische expressie in Escherichia coli (E. coli). Functionele studies van GPC3-S-Fab suggereerde dat GPC3-S-Fab een veelbelovende strategie voor leverkanker therapie is. Dus, de voordelen van GPC3-S-Fab over alternatieve technieken met toepassing verwijzingen naar eerdere studies zijn gemakkelijk productie en zuivering, en meer stabiele bsAbs.
Zoogdieren expressiesystemen en prokaryote expressiesystemen zijn gebruikt om verschillende formaten van BsAbs express. In tegenstelling tot zoogdieren expressiesystemen, E. coli-gebaseerde eiwit expressiesystemen hebben vele voordelen, waaronder hoge opbrengsten, lage kosten en arbeidsbesparende, het gemak van genetische manipulaties, en hoge transformatie efficiëntie15. Voor bsAbs expressie in E. coli, zijn er twee fundamentele strategieën: expressie in het cytoplasma en expressie in het periplasma tussen het cytoplasma en buitenste celmembraan15. Vergeleken met de vermindering omgeving van cytoplasma, is het periplasma een meer oxiderende milieu, dat de juiste vouwen stimuleert en co uitdrukking van eiwitten16. Juiste vouwen speelt een belangrijke rol in de generatie van de oplosbaarheid, stabiliteit en functie van bsAbs. Daarom is een signaal reeks pelB toegevoegd aan de N-terminus van de S-Fab naar directe secretie om het periplasma van E. coli17. Om ervoor te zorgen werkzaam correct vouwing, oplosbaarheid, thermische stabiliteit en conformationele stabiliteit, vermindering van de complexiteit en de omvang van een antilichaam is vaak16. De S-Fab-indeling bestaat uit een Fab en één VHH, die zeer goed wordt uitgedrukt in bacteriële systemen waarschijnlijk te wijten aan de eenvoudige structuur en kleine omvang.
GPC3 werd in dit GPC3-S-Fab bispecifieke antilichaam formaat gekozen. Glypican-3 (GPC3) is een lid van de heparine sulfaat (HS) Proteoglycaan familie die wordt verankerd aan het celoppervlak via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 is overexpressie in 70% van de gevallen van hepatocellulaire carcinoom (HCC), die goed zijn voor de meerderheid van de lever kanker19,20,21,22. Omdat GPC3 zelden in normale weefsels uitgedrukt is, GPC3 voorgesteld als een potentieel doelwit voor HCC. Meerdere muis mAbs zijn geproduceerd tegen GPC3. Echter alleen GC33 tentoongesteld beperkte anti-tumor activiteit 22en zij nagelaten om klinische werkzaamheid bij patiënten tentoon te stellen. In deze studie GPC3-S-Fab bleek te kunnen werven van NK-cellen te doden GPC3 tumor cellen14.
Werven van NK-cellen, werd anti-CD16 VHH gebruikt. CD16a is een lage affiniteit IgG receptor, uitgedrukt voornamelijk op natural killer (NK) cellen, monocyten en macrofagen en enkele subtypen van T-cellen. Het is betrokken bij de cytotoxiciteit (ADCC) van de antilichaam-afhankelijke cel van NK cellen23. Menselijke NK cellen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten, CD56 - CD16 + en CD56 + CD16-. In tegenstelling tot CD56 + CD16− NK-cellen, CD56-CD16 + NK-cellen kunnen vrijgeven van hogere niveaus van Perforine en granzyme B en aldus een sterke cytotoxiciteit24. Kupffer cellen (KCs), uiting van CD16a, zijn de ingezetene macrofagen in de lever. Kupffer cellen spelen een belangrijke rol bij de onderdrukking van leverkanker25. Dus, is bsAbs gericht op CD16a mogelijk een meer belovende strategie dan boeiende T cellen tegen leverkanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van menselijk bloed collectie werden goedgekeurd door de zon Yat-Sen Universiteit ethische commissie.
1. GPC3-S-Fab Design strategie
- GPC3-S-Fab ontwerpen door het koppelen van een Fab van anti-GPC3 (gehumaniseerd GC3313) met een anti-CD16 VHH14 (Figuur 1).
- Synthetiseren en kloon van de VH-CH1-CD16-VHH en VL-CL in de vectoren pET26b en pET21a als eerder gemeld12.
2. transformatie en cultuur
- Voeg 100 ng van pET26b met VH-CH1-CD16 (figuur 1A) en 100 ng van pET21a met VL-CL (figuur 1A) in 100 µL van de bevoegde BL21 (DE3) cellen. Meng goed en incubeer op ijs voor 30 min. Incubate in een waterbad van 42 ° C voor 45-90 s, overdracht, en broeden op het ijs gedurende 3-5 minuten.
- Voeg 500 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium in een buis met BL21 (DE3) cellen en vervolgens Incubeer bij 37 ° C, 150 rpm voor 45-60 min. verspreid 100 µL van BL21 (DE3) cellen op LB-agar platen met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline , en vervolgens Incubeer bij 37 ° C voor 12-16 h.
- Bereiden van lysogenie Bouillon (LB) medium: 1% wt/vol trypton, 0,5% wt/vol gistextract, 1% wt/vol NaCl.
- Inoculeer cellen uit een één kolonie in 5 mL super Bouillon (SB) opslagmedium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicillineen cultuur bij 37 ° C, 220 rpm, 's nachts. Inoculeer vervolgens 1 mL van de cultuur in 100 mL van SB medium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C, 220 rpm voor 4 uur. Daarna Pipetteer 10 mL van de cultuur in 1 L van SB medium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C, 220 rpm.
- Bereiden super Bouillon medium: 3,2% wt/vol trypton, 2% wt/vol gistextract, 0,5% wt/vol NaCl.
- Wanneer de OD600 bereikt 0.6 - wil 0.8, isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) een eindconcentratie van 0,2 mM. Cultuur bij 16 ° C, 180 rpm voor 36-48 h voor periplasmische expressie.
3. GPC3-S-Fab periplasmische zuivering
- Periplasmische breuk voorbereiding
- Verzamelen van cellen door centrifugatie bij 4000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten, negeren van het medium en wegen van de cellen.
- Resuspendeer de cellen grondig in 4 mL ijskoud sacharoseoplossing (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25% (wt/vol) sacharose en 1 mM EDTA) per gram cellen en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer bij 8500 x g (tafelblad centrifuge, vaste hoek rotor), 4 ° C voor 20 min. verwijderen het supernatant (de sacharose breuk) en sla het op ijs.
- Resuspendeer de korrels in een mix van ijskoude 5 mM van MgCl2 en 1 mM van de PMSF (4 mL per gram cellen). Voeg 40 µL van de lysozym voorraad (15 mg/mL) per gram, en uit te broeden op het ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 8500 x g (tafelblad centrifuge, vaste hoek rotor), 4 ° C gedurende 20 min. overdracht het supernatant (de periplasmatische breuk) en sla het op ijs.
- Combineer de sacharose breuk en periplasmische breuk, en centrifugeer bij 30.000 x g, 4 ° C voor 30 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen en op te slaan in een 50 mL conische buis op ijs.
- Ni-NTA affiniteit zuivering
- 1 mL van Ni-NTA agarose resuspendeer door vermenging grondig te bereiken een homogene suspensie, verwijderen 1 mL Ni-NTA agarose aan een conische buis van vers 15 mL en voeg toe 10 kolom volumes (CV) evenwichtsinstelling buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M van NaCl) naar equilibreer.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant zorgvuldig. Vervolgens voegt u de Ni-NTA agarose in de 50 mL-buis met de Fractie van de sucrose en periplasmische breuk. Rock bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 400 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende substantie aan een andere verse ijskoude buis als de niet-afhankelijke breuk. Breng de Ni-NTA agarose in een gravity-kolom.
- Voeg 10 CV buffer te wassen (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M van NaCl; 20 mM, 30 mM of 40 mM van imidazool) naar de kolom en verzamel de elute als de breuk wassen.
Opmerking: Deze oplossingen moeten worden toegevoegd in volgorde van toenemende concentraties van imidazool. - Voeg 3 CV van elutie buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 300 mM van NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 of 400 mM van imidazool) naar de kolom en het verzamelen van de elute als elutie breuk 1, 2, 3 en 4.
Opmerking: Deze oplossingen moeten worden toegevoegd in volgorde van toenemende concentraties van imidazool. - Dialyse de eluted breuken in 2 L van PBS (137 mM van NaCl, 2,7 mM van KCl, 10 mM voor Na2HPO4, 2 mM van KH2PO4, pH 7.4) met behulp van dialyse buis (12.4 kDa) bij 4 ° C voor 2 h. Controleer de aanwezigheid van GPC3-S-Fab met 12% SDS-pagina en vervolgens op Coomassie blue kleuring.
- IgG-CH1 affiniteit zuivering
- 1 mL van de IgG-CH1 affiniteit hars overboeken naar een conische tube van 50 mL, en de kralen met PBS eerst wassen. Voeg vervolgens de dialyzed oplossing met GPC3-S-Fab na stap 3.2.6. Rock bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min, 4 ° C. Zorgvuldig verwijderen van het supernatans dat aan een ander vers ijskoude buis, en breng het hars aan een kolom van de zwaartekracht.
- Voeg 10 CV van wassen buffer (PBS) naar de kolom, en het verzamelen van de elutie als de breuk wassen.
- Bereiden de collectie buizen door toevoeging van 1 M van Tris pH 9.0 (0,1 mL / mL van elk eluted breuk). Elueer met 3 CV elutie buffer (0,1 M glycine-HCl, pH 2.7), en het verzamelen van de eluted Fractie; Herhaal dit 3 keer.
- Dialyse de eluted breuken in 2 L van PBS met behulp van dialyse buis (12.4 kDa) bij 4 ° C voor 2 h. Herhaal tweemaal.
- Bepaal de eiwitconcentratie ultramicrospectrophotometer (molaire extinctie coëfficiënt: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).
4. SDS-pagina en analyse van het westelijke bevlekken
- Een 10 µL van het monster rekening 5 x SDS laden buffer en meng goed. Kook het mengsel van eiwit bij 100 ° C gedurende 5 minuten.
- 5 x SDS laden buffer bereiden: 250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromophenol blauw, 50% vol/vol glycerol, 5% vol/vol bèta-mercaptoethanol.
- Voorbereiden van een SDS-pagina gel met een lading gel (5%) en de scheiding gel (12%) als eerder beschreven26,27,28.
- 10 µL van het mengsel van gekookte eiwit en eiwit marker laden en uitvoeren van de SDS-pagina.
- Vlekken van de gel door schudden voor 20 min met Coomassie briljant blauw oplossing, en vervolgens uit te voeren destaining.
- Voor het westelijke bevlekken, na het overbrengen naar een membraan PVDF, blokkeren van het membraan met TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20 150 mM) + 5% wt/vol afgeroomde melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur tijdens het schudden.
- Incubeer het membraan met primaire antilichamen (anti-zijn of Anti-Flag) verdund 1:2,000 in TBST + 5% afgeroomde melk gedurende 1 uur.
- Wassen met TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en herhaal 3 keer.
- Incubeer de membraan in secundair antilichaam (HRP-linked anti-muis Fc antilichaam) verdund 1:2,000 in TBST + 5% afgeroomde melk gedurende 1 uur.
- Wassen met TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en herhaal 3 keer.
- Voeg 1 mL HPR substraat per film, ontwikkelen en nemen van beelden.
5. gel filtratie analyse
- Gebruik de volgende kolom: kolom volume van 24 mL; Evenwichtsinstelling buffer van PBS pH 7.4; Debiet van 0,5 mL/min bij room gematigde; Monstervolume van 200 µL.
- Gebruik de volgende eiwit volume en concentratie: 500 µL van 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten, en neem 200 µL te laden.
- Voor het eiwit marker volume en de concentratie, wordt 100 µL van cytochroom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL van anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL van albumine (10 mg/mL, 66 kDa) en 200 µL van alcoholdehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) rekening door één buis. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten, en neem 200 µL te laden.
- Vóór elke run, wassen met ten minste 2 CV gedestilleerd water op een debiet van 0,5 mL/min.
- De kolom met ten minste 2 equilibreer CV van evenwichtsinstelling buffer (PBS, pH 7.4) op een debiet van 0,5 mL/min.
- Automatisch injecteren het monster bij 0,5 mL/min voor het laden van het monster.
- Elueer met evenwichtsinstelling buffer op 0,5 mL/min en op 280 en 215 nm te sporen.
6. Stroom Cytometry analyse
- Cultuur van de HepG2 (GPC3 positieve), Hep3B (GPC3 positieve), Huh7 (GPC3 positief), en MHCC - 97-H (GPC3 negatief) cellen in kunststof gerechten 100 x 20 mm met DMEM medium met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline (100 µg/mL), streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2.
- Cultuur CHO (GPC3 negatief) cellen en CHO/GPC3 cellen full-length menselijke GPC3 cDNA (GPC3 positief) in 100 x 20 mm kunststof gerechten met RPMI 1640 medium met 10% FBS (100 µg/mL) penicilline en streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2herbergen.
- Cultuur van de NK92/CD16 herbergen full-length menselijke CD16 cDNA (CD16 positief) in 25cm2 kolf met RPMI 1640 medium met 10% FBS (100 µg/mL) penicilline en streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2.
- Wanneer de cellen zijn 70-90% confluente, negeren de medium en wassen van de cellen met 2 mL PBS. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min (of totdat de cellen beginnen om los van het oppervlak te maken). Voeg 1 mL van het volledige groeimedium te neutraliseren de trypsine en resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer.
- De getallen van de cel met behulp van een Neubauer-hemocytometer tellen en de levensvatbaarheid van de cellen door Trypan Blue detecteren.
- Verzamelen van 3 x 106 cellen voor elke regel van de cel. Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA om resuspendeer de cellen. Centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. tweemaal herhalen.
- Voeg 0.3 mL PBS + 0,2% BSA om resuspendeer de cellen, en breng 100 µL (ongeveer 1 miljoen) aan elke 5 mL polystyreen ronde-onderkant-buis.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle stappen hiervandaan de buizen moeten koud worden gehouden op het ijs. Wanneer het antilichaam aan de cel oppervlakte-antigeen bindend is, zal het complex beginnen te internaliseren. Doordat het koud, is het proces aanzienlijk vertraagd. - Voeg 10 µL van primaire antilichamen (GPC3-S-Fab of menselijke IgG1, eindconcentratie 5 µg/mL) toe aan elke buis en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
- Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA te wassen, en centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Herhaal dit drie keer.
- Resuspendeer in 100 µL van PBS + 0,2% BSA, Voeg 0,5 µL van secundair antilichaam (anti-menselijk IgG(H+L)-488, definitieve concentratie 10 µg/mL) en incubeer op ijs voor 1 h. nota: vanaf dit stap, gelieve te houden de cellen van het licht.
- Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA te wassen, en centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Herhaal dit drie keer.
- Het analyseren van de cellen door stroom cytometer volgens het standaardprotocol29. Verwerven van cellen met een 488 nm laser voor excitatie.
7. cytotoxische Assays
- Bereiden van tumorcellen.
- Cultuur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H en CHO cellijnen zoals beschreven in stappen 6.1-6.5.
- Cellen naar 0,5 × 105/mL Verdun en plaat 100 µL cellen (5.000 cellen per putje) op 96-wells-platen. Cultuur 6-8 h zodat de cellen te koppelen.
- Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bereiden.
- Verdun vers bereid bloed met een gelijk volume van PBS in een conische tube van 50 mL. Bijvoorbeeld, Verdun 10 mL bloed met 10 mL PBS.
- 15 mL lymfocyt scheiding voedingsbodem rekening een conische buis van verse 50 mL. Breng langzaam het verdunde bloed op de lymfocyt scheiding medium langs de kant van de buis.
Opmerking: Houd de buis verticaal. Breek niet het oppervlak van de lymfocyt scheiding medium. - Centrifugeer bij 400 x g gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur met de rem af.
- Langzaam verwijderen de bovenste plasma laag, en nemen de laag van de witte bloed met PBMCs op het plasma-lymfocyt scheiding middellange raakvlak.
- Verdun de PBMCs met een dubbel volume van PBS + 2% FBS. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
- Wassen van de cellen tweemaal met PBS + 2% FBS. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. tellen de cel nummers, zoals beschreven in stap 6.5.
- Bereiden van NK-cellen.
- Maak de PBMCs suspensie met een concentratie van 5 x 107 cellen/mL in PBS + 2% FBS, en plaats hen in een polystyreen ronde-bodem-tube van 5 mL.
- Menselijke NK cel verrijking Cocktail bij 50 µL/mL van cellen toevoegen. Meng goed en laat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten inwerken.
- Resuspendeer de magnetische deeltjes uit de NK-cel verrijking kit, en meng goed zodat ze gelijkmatig worden opgeschort door pipetteren op en neer krachtig meer dan 5 keer. De geresuspendeerde magnetische deeltjes bij 100 µL/mL overbrengen in de celsuspensie. Meng goed en laat bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten inwerken.
- Brengen van de celsuspensie tot een totaal volume van 2.5 mL door toevoeging van PBS + 2% FBS. Meng de cellen in de buis door pipetteren zachtjes op en neer 2 - 3 keer. Plaats de buis (zonder een cap) in de magneet. Laat de magnetische kralen settelen gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de magneet. Omkeren in een continue beweging, de buis, een nieuwe buis uit de verrijkte celsuspensie binnenstromen.
- Tellen de cel nummers, zoals beschreven in stap 6.5.
- Instellen van de cytotoxische reactie.
- Verdun de NK-cellen tot 5 × 105 cellen/mL met behulp van het bijbehorende kweekmedium. Voeg 100 µL celsuspensie NK aan de tumorcellen op een 96-wells-plaat verzinkt.
- Voeg 10 µL van GPC3-S-Fab in verschillende concentraties, met de hoogste dosis op een eindconcentratie van 30 µg/mL, 3-voudig verdunning, 9 punt (drie wordt gerepliceerd).
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 72 uur.
- Na 72 uur incubatie, verwijderen van het medium, voeg 100 µL van DMEM medium met 10 µL van CCK8 reagens aan elk putje in 96-wells-platen en vervolgens Incubeer bij 37 ° C.
- Lees de plaat bij 450 nm bij 1, 2, 3 en 4 uur na het toevoegen van het CCK8-reagens.
- Het analyseren van de gegevens. Berekenen van de overlevingskansen als (OD450 GPC3-S-Fab Effector + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100% en (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100%. De effector cellen zijn NK-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab zuivering
GPC3-S-Fab was gezuiverd van E. coli door een tweestaps affiniteit zuivering, eerst met Ni-NTA-agarose, gevolgd door IgG-CH1 affiniteit zuivering. Na de zuivering van de affiniteit in twee stappen, was GPC3-S-Fab gezuiverd tot homogeniteit met de twee kettingen dicht bij 1:1 (figuur 2A). De aanwezigheid van zowel VH-CH1-CD16 VHH en VL-CL polypeptiden kan worden geïdentificeerd door hun verschillende C-terminal tags, anti-zijn voor de VL-CL ongeveer 25 kDa en Dizzee Rascal voor de VH-CH1-VHH ongeveer 38 kDa (figuur 2B). Na de twee stappen affiniteit zuivering, kan ~1.2 mg eiwit worden verkregen bij 1 L van SB cultuur. Verder karakteriseren de gezuiverde GPC3-S-Fab, werd gel filtratie uitgevoerd. Gebaseerd op de standaard markers (figuur 2C), werd GPC3-S-Fab geïdentificeerd als een homogene monomeer in de vorm van een heterodimer met een moleculaire grootte van ongeveer 63 kDa (figuur 2C).
GPC3-S-Fab bindende activiteiten
Om te beoordelen of de GPC3-S-Fab de GPC3-positieve cellen en CD16-positieve cellen herkent, werd stroom cytometry analyse uitgevoerd met behulp van de GPC3-positieve leverkanker cellijnen HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 en de GPC3-negatieve leverkanker cellijn, MHCC - 97H en CHO cellen. De GPC3-S-Fab kon binden naar alle GPC3-positieve cellen, hoewel met zwakkere binding aan Hep3B (figuur 3B) en Huh7 cellen (Figuur 3 c) dan naar HepG2 (Figuur 3 bis) en CHO/GPC3 (figuur 2F). Geen of minimale binding aan GPC3-negatieve MHCC - 97H en CHO cellen werd waargenomen (figuur 3D, 3E). De GPC3-S-Fab kon ook binden aan de CD16-positieve cellen, NK92/CD16 cellen (Figuur 3 g). Deze resultaten komen overeen met de resultaten van de vorige met behulp van andere anti-GPC3 antilichamen30, suggereren dat GPC3-S-Fab specifiek GPC3-positieve cellijnen en CD16-positieve cellen kunt binden.
Om te beoordelen van de cytotoxiciteit van GPC3-S-Fab, werden tumorcellen geïncubeerd met verse geïsoleerde NK-cellen met verschillende concentraties van GPC3-S-Fab. Zonder NK-cellen had GPC3-S-Fab geen cytotoxiciteit tegen tumorcellen ongeacht de GPC3 expressie status (Figuur 4). In aanwezigheid van NK-cellen, GPC3-S-Fab sterke cytotoxiciteit tegen HepG2, Hep3B en Huh7 cellen geactiveerd op een dosis-afhankelijke manier maar toonden geen effect op cellen van de GPC3-negatieve MHCC - 97 H (Figuur 4), wat suggereert dat de cytotoxiciteit van GPC3-S-Fab afhankelijk van GPC3 expressie op het celoppervlak tumor.
Figuur 1. Constructies van GPC3-S-Fab
(A) de bacteriële expressie constructies van GPC3-S-Fab. De constructies bevatten een pelB signaal reeks, een gehumaniseerd anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (zware ketting), of een VL-CL (lichte keten). Ter vergemakkelijking van eiwit detectie en zuivering, is een vlag-tag of een His8-tag toegevoegd aan de C-terminus. (B) Diagram van GPC3-S-Fab na co expressie.
Figuur 2. GPC3-S-Fab zuivering van E. coli.
Het linker paneel (A), na de chromatografie van de affiniteit van de Ni-NTA; Rechter paneel, na de chromatografie van de affiniteit van de anti-IgG-CH1; M, moleculair gewicht ladder; Coomassie blue kleuring. Het linker paneel (B), na de chromatografie van de affiniteit van de Ni-NTA; Rechter paneel, na de chromatografie van de affiniteit van de anti-IgG-CH1; M, moleculair gewicht ladder; Westelijke-bevlekken. (C) Gel filtratie analyse van GPC3-S-Fab. BOVENPANEEL, standaard merkers; onderste paneel, GPC3-S-Fab. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. GPC3-S-Fab herkent GPC3 positieve cellen en CD16-positieve cellen.
Stroom cytometry analyse van HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) en (G) NK92/CD16 cellen werd uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Rode lijn: tumor cellen alleen; Groene lijn: isotype controle, tumor cel menselijke IgG1 + anti-menselijke IgG(H+L)-488; blauwe lijn: tumor cel + GPC3-S-Fab + anti-menselijke IgG (H + L)-488. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. GPC3-S-Fab bevordert de dood van de cel van de GPC3-positieve kankercellen.
Dosis-afhankelijke cytotoxiciteit testen werden uitgevoerd zoals beschreven in het protocol voor HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), en MHCC - 97 H (D). De concentraties van GPC3-S-Fab waren afkomstig uit 0.0045 µg/mL tot 30 µg/mL. De gegevens zijn het gemiddelde van de triplicates met de foutbalken die vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Gevulde cirkel, alleen GPC3-S-Fab; vierkantje, GPC3-S-Fab+ NK, NK-cellen (50.000 per putje) en doelcellen (5.000 per putje). Het mengsel werden gedurende 72 uur voor meting van de cytotoxiciteit geïncubeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie, presenteren wij een strategie voor de bouw van een nieuwe indeling van bsAbs, GPC3-S-Fab, die NK cellen gericht op GPC3 positieve tumorcellen kan aanwerven. De S-Fab is gebaseerd op de natuurlijke Fab formaat door toevoeging van een anti-CD16 VHH11,12. Vergeleken met de bsAbs met Fc regio, kan GPC3-S-Fab gemakkelijk worden geproduceerd in het periplasma van bacteriën op grote schaal.
Met behulp van de strategie van het expressie en zuivering zoals beschreven in het protocol, kregen we een oplosbare en functionele GPC3-S-Fab in grote hoeveelheden. Om te vergemakkelijken periplasmische expressie, is een signaal reeks pelB toegevoegd aan de N-terminus tot directe secretie om het periplasma van E. coli17. In tegenstelling tot het cytoplasma, het meer oxiderende milieu in de periplasmatische ruimte tussen de cytoplasmatische en buitenste membranen is uitgerust met een aantal belangrijke eiwitten voor vouwing van eiwitten en vergadering en dus bevordert de corrigeren vouwen en oplosbaarheid van recombinante eiwitten16. Echter, de machines voor de vouwing van eiwitten en uitvoer naar het periplasma in E. coli heeft beperkte capaciteit. Hoge expressie van recombinante eiwitten vaak resulteert in de accumulatie van onoplosbare product in het periplasma16. Om te voorkomen dat de hoge uitdrukking van eiwit over een korte periode van tijd, werden lage IPTG (0.2 mM) en lage temperatuur (16 ° C) in voedzame medium toegepast in dit protocol om te voorkomen dat de accumulatie van onoplosbare eiwitten. In deze studie was ~1.2 mg eiwit verkregen door 1 L van medium, verbetering van de opbrengsten ten minste 2-fold in vergelijking met eerdere werken12.
Om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit, moeten alle breuken met GPC3-S-Fab in verschillende stappen worden bewaard op het ijs. Met zijn label bij de C-terminal van VL-CL, Ni-NTA-agarose werd gebruikt voor de zuivering. Enkele Ni-NTA-agarose zuivering is echter niet voldoende voor het verwijderen van ongewenste eiwitten, zoals ongepaarde VL-CL eiwit. Om te zuiveren van de homogene heterodimeric GPC3-S-Fab, de tweede stap, werd de zuivering van de anti-IgG-CH1 affiniteit, toegepast. De gezuiverde proteïne had hoge zuiverheid en twee polypeptiden dicht bij 1:1 (figuur 2A-2B).
Gel filtratie chromatografie kunt bepalen van het molecuulgewicht van eiwitten op basis van hun moleculaire grootte en vormen; analyseren van de mate van zuiverheid; en bepalen of de gezuiverde proteïne een monomeer is, dimeer, of samengesteld van aggregaten15. Door de chromatografie van de filtratie van gel, werd GPC3-S-Fab geïdentificeerd met de verwachte moleculaire grootte van ongeveer 63 kDa, die is in de vorm van een monomeer met heterodimerization van GPC3-S-Fab (figuur 2C).
Stroom cytometry kunt bepalen of een antilichaam zijn antigeen aan de celmembraan binden kan, in vergelijking met traditionele westelijke-bevlekken en ELISA, die alleen het detecteren van antigeen-antilichaam binding reacties. Stroom cytometry analyse erkend GPC3-S-Fab de GPC3 op de celmembraan, suggereert dat het GPC3-Fab-groep was functionele. Bij het uitvoeren van stroom cytometry analyse, is het essentieel om te houden van alle stappen op het ijs of bij 4 ° C na het antilichaam wordt toegevoegd. Wanneer het antilichaam aan de cel-oppervlakte-antigeen bindt, zal het antilichaam-antigeen complex internalisering initiëren. Doordat het koud, is het proces van internalisatie aanzienlijk vertraagd.
PBMCs en NK-cellen werden efficiënt geïsoleerd uit menselijk perifere bloed door centrifugeren lymfocyt scheiding met medium, gevolgd door magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën. GPC3-S-Fab toonde krachtige cytotoxiciteit tegen de positieve cellen van de GPC3 toen de verhouding van NK-cellen aan de doelcellen (de tumorcellen) 10:1 was, en de verhouding van NK-cellen naar doelcellen van 50: 1 tot 5:1 variëren kan.
Kortom biedt GPC3-S-Fab, die kan worden geproduceerd in een micro-organisme expressie systeem, een nieuwe laan te maken van functionele indelingen van bsAbs tegen tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de R & D plannen van Guangdong Province (PR China) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
