Summary
여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.
Abstract
이 프로토콜 건설과 bispecific 항 체 (bsAb), GPC3-S-팹의 기능 연구에 설명합니다. bsAbs는 그들의 두 개의 서로 다른 무기를 통해 두 개의 다른 epitopes를 인식할 수 있습니다. bsAbs는 직접 종양 세포를 죽 일 면역 세포를 보충 하는 그들의 기능에 대 한 적극적으로 연구 되었습니다. 현재, bsAbs의 대부분은 재조합 단백질, Fc 포함 된 bsAbs 또는 Fc 지역 없이 작은 bsAb 파생 상품의 형태로 생산 됩니다. 이 연구에서는 GPC3-S-팹, 항 체 단편 (팹) 기반된 bispecific 항 체, 안티-GPC3 항 체 GC33 안티 CD16 단일 도메인 항 체의 Fab을 연결 하 여 설계 되었다. GPC3-S-팹 대장균 에 표현 고 두 선호도 chromatographies에 의해 순화 될 수 있습니다. 순화 GPC3-S-팹 구체적으로 바인딩할 하 고 세포를 죽 일 GPC3 긍정적인 간 암 자연 킬러 세포를 모집 하 여 간 암 치료에 GPC3-S-팹의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 수 있습니다.
Introduction
단일 클론 항 체는 이제 암 치료1광범위 하 게 사용 된다. 항 체의 유연성으로 인해 다양 한 항 체 기반 형식을 적극적으로 탐험 있다. 단일 클론 항 체와 비교, bsAbs 두 개의 다른 항 원 바인딩 모듈, 2 개의 다른 목표 동시에 고 효율적으로 방 아 쇠를 목표 하 고 종양 세포2를 죽 일 면역 효과 기 세포의 채용을 인식 하는.
현재 재조합 bsAb 형식을 일반적으로 두 개의 클래스에 할당할 수 있습니다: bsAbs 포함 하는 Fc와 Fc 지역 없이 bsAbs. 대부분 포유류 세포에서 생성 되는 Fc 포함 된 형식에 비해, bsAbs Fc 지구는 작은 크기의 장점을 하지 않고 더 쉽게 미생물 식 시스템에서 생산 되 고 보다 효율적으로 종양 조직에 침투 수 있습니다 3.
bsAbs Fc 지역 없이 일반적으로 개별 바인딩 moieties 단일 체인 변수 조각 (scFvs) 또는 팹3등을 연결 하 여 형성 된다. 안정적인 도메인 없이 bsAbs 자주 scFv 조각에 따라 열 안정성, 낮은 용 해도, 또는 집계4,5에 대 한 증가 잠재력 손상 있다. 반면, bsAbs 팹 기반 네이티브 팹 moiety4,6CH1 및 CL의 heterodimerization 때문에 안정 되어 있다.
무거운-체인 전용 항 체 (VHHs, 단일 도메인 항 체로 라고도 함)에서 변수 도메인은 자연 무거운 체인 항 체7의 활성 항 원 바인딩 조각. VHHs에 있는 높은 선호도의 특성, 기존의 IgGs8, 낮은 immunogenicity 및 높은 수익률의 특이성 세균성 식9. Fv 조각에 비해, VHHs 높은 열 안정성10있다. 팹 moieties와 비교해, VHHs는 CH1 및 CL의 부족으로 인해 작은 크기. 따라서, S-팹, 단일 도메인 항 체, VHH와 팹을 연결 하 여 얻은 bsAb 형식 설계 하 고 그것의 항 종양 효과11,12에 대 한 공부.
이 연구에서는 hGC3313 안티 CD16a VHH14 의 팹을 연결 하 여 GPC3-S-팹 건설은 설명 했다. GPC3-S-팹 periplasmic 식 대장균 (대장균)에 효율적으로 제작 될 수 있습니다. GPC3-S-팹의 기능 연구 GPC3-S-팹은 간 암 치료를 위한 유망한 전략 제안. 따라서, 쉽게 생산 및 정화, 그리고 안정 되어 있는 bsAbs는 이전 연구에 대 한 해당 참조를 대체 기술을 통해 GPC3-S-팹의 장점이 있습니다.
포유류 식 시스템 및 간결한 식 시스템 BsAbs의 다양 한 포맷을 표현 하기 위해 사용 되었습니다. 포유류 식 시스템, 대장균과 달리-기반된 단백질 식 시스템은 높은 수율, 낮은 비용과 노동 절약, 유전자 조작, 높은 변환 효율15의 용이성을 포함 하 여 많은 혜택. 대장균에서 bsAbs 식에 대 한 두 가지 기본 전략: 세포질과 세포질 사이 세포 막 외부15periplasm에 식 식. 세포질의 감소 환경에 비해는 periplasm 더 산화 환경, 올바른 접는 촉진 및 단백질16의 공동 식 이다. 올바른 접는 bsAbs의 용 해도, 안정성과 기능 생성에 주요 역할을 하고있다. 따라서, 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 S 팹의 N-말단에 추가 되었습니다. 되도록 정확한 접는, 용 해도, 열 안정성 및 구조적 안정성, 복잡성 및 항 체의 크기 감소는 자주 고용16. 한 팹과 세균성 시스템 가능성이 간단한 구조와 작은 크기 때문에 아주 잘 표현 한 VHH S 팹 형식에 의하여 이루어져 있다.
GPC3은 GPC3-S-팹 bispecific 항 체 형식으로 선정 되었다. Glypican-3 (GPC3) glycosylphosphatidylinositol (GPI)18을 통해 세포 표면에 고정 되는 헤 파 린 황산 염 (HS) proteoglycan 가족의 구성원입니다. GPC3 70%의 간세포 암 (HCC) 경우, 간 암19,20,,2122의 대부분에 대 한 어떤 계정에 overexpressed입니다. GPC3는 정상 조직에 거의 표현 된다, 때문에 GPC3 HCC에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 하고있다. 여러 마우스 mAbs GPC3에 대 한 제작 되었습니다. 그러나,만 GC33 전시 제한 안티 종양 활동 22, 그리고 환자에서 임상 효능을 전시 하는 데 실패. 이 연구에서는 GPC3-S-팹 모집 GPC3 종양 세포14를 죽 일 NK 세포 수를 표시 했다.
NK 세포를 모집, 안티 CD16 VHH 사용 되었다. CD16a 낮은 친 화력 IgG 수용 체, T 세포의 일부 하위, monocytes, 대 식 세포, 자연 킬러 (NK) 세포에 주로 표현 이다. 그것은 항 체 의존 세포 세포 독성 (ADCC) NK 세포23에 의해 포함 된다. 인간 NK 세포 CD56 두 종류로 분류 될 수 있다-CD16 +, CD56 + CD16-. 달리 CD56 + CD16− NK 세포, CD56-CD16 + NK 세포 수 perforin와 granzyme B 놓고 따라서 강한 세포 독성24제시. Kupffer 세포 (관세), CD16a, 표현 간에서 상주 대 식 세포는. Kupffer 세포 간 암25의 억제에 중요 한 역할을 한다. 따라서, bsAbs CD16a를 대상으로 T 세포 간 암에 대 한 매력 보다는 더 유망한 전략을 수 있습니다.
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Protocol
모든 인간의 혈액 수집 절차는 Sun 야만 센 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. GPC3-S-팹 디자인 전략
- 안티-GPC3 (humanized GC3313)는 안티 CD16 VHH14 (그림 1)의 공장을 연결 하 여 GPC3-S-팹을 디자인 합니다.
- 합성 하 고 이전에 보고 된12VH-CH1-CD16-VHH 및 VL-CL pET26b 및 pET21a 벡터에 복제.
2. 변환 및 문화
- 추가 100 VH-CH1-CD16 (그림 1A) 및 100를 포함 하는 pET26b의 ng의 유능한 BL21 100 µ L에 VL-CL (그림 1A)를 포함 하는 pET21a의 ng (DE3) 세포. 잘 혼합 하 고 30 분 품 45-90 s, 전송, 42 ° C 물 목욕에 대 한 얼음에 품 어 3-5 분 동안 얼음에 품 어.
- BL21 포함 된 튜브에 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L를 추가 (DE3) 세포와 다음 37 ° C, 45-60 분에 대 한 150 rpm에서 확산 100 µ L BL21의 품 어 파운드-한 천 (DE3) 셀 플레이트 포함 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 그리고 다음 37 ° C 12-16 h에서 품 어.
- Lysogeny 국물 (파운드) 매체를 준비: 1 %wt / 집 tryptone, 0.5 %wt / 권 효 모 추출 물, 1 %wt / 권 NaCl.
- 하룻밤 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 슈퍼 국물 (SB) 매체의 5 mL로 단일 식민지에서 세포를 접종. 다음, 대 의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 4 h 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 100 mL으로 문화의 1 mL를 접종. 다음, 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 1 리터에 10 mL 문화의 전송.
- 슈퍼 국물 매체 준비: 3.2 %wt / 집 tryptone, 2 %wt / 권 효 모 추출 물, 0.5 %wt / 권 NaCl.
- OD600 에 도달 하면 0.6-0.8, 0.2 m m의 최종 농도에 이소프로필-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 추가 합니다. 16 ° C, periplasmic 식 36-48 h에 대 한 180 rpm에서 문화.
3. GPC3-S-팹 Periplasmic 정화
- Periplasmic 분수 준비
- 4000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 매체, 삭제 셀 무게.
- Resuspend 셀 셀의 그램 당 차가운 자당 해결책 (pH 7.5 Tris HCl의 20 m m, 25% (wt/vol) 자당 및 EDTA의 1 m m)의 4 mL에 철저 하 게 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.
- 원심 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정된 각으로 터)에서 4 ° C 20 분 제거 상쾌한 (자당 분수)와 저장 얼음에.
- 얼음 처럼 차가운 5mm MgCl2 의 그리고 1 밀리미터 PMSF (4 mL 당 그램 셀)의 혼합에 산 탄을 resuspend. 그램, 당 lysozyme 주식 (15 mg/mL)의 40 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.
- 20 분 전송 상쾌한 (periplasmic 분수) 4 ° C에서 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정 각으로 터), centrifuge 고 얼음에 저장 합니다.
- 자당 분수와 periplasmic 분수, 결합 하 고 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에 30000 x g, 4 ° C에서 30 분 제거는 상쾌한 고 저장 원심.
- Ni NTA 친 화력 정화
- 균질 정지 달성, 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 Ni NTA agarose의 1 mL을 제거 하 고 10 열 볼륨 (CV) 평형 버퍼 추가를 철저 하 게 혼합 하 여 Ni NTA agarose의 1 mL를 resuspend (25mm Tris HCl, pH 7.5;의 NaCl의 1 M) equilibrate에.
- 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다. 그런 다음, 자당 분수와 periplasmic 분수를 포함 하는 50 mL 튜브에 Ni NTA agarose를 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.
- 400 x g에서 혼합물을 원심, 4 ° C 5 분에 대 한 신중 하 게 상쾌한 언바운드 분수 다른 신선한 얼음 튜브를 제거. 중력 열에 Ni NTA agarose를 전송 합니다.
- 10 추가 버퍼 세척의 이력서 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 1 M NaCl의; 20 m m, 30mm 또는 이미의 40 m m) 열을 수집 세척 분수 elute.
참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다. - 3 추가 차입의 이력서 열 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 300 mM NaCl의, 100mm, 200mm, 300mm 또는 이미의 400 m m)를 버퍼링 하 고 차입 분수 1, 2, 3, 및 4는 elute 수집.
참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다. - 투 석 PBS (137 mM NaCl, 2.7 m m의 KCl, 10mm 나2HPO4, KH2포4, pH 7.4의 2 mM)의 2 L에 eluted 분수 12 %GPC3-S-팹의 존재를 확인 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 SDS 페이지 다음에 의해 Coomassie 파란 얼룩입니다.
- IgG CH1 친 화력 정화
- IgG CH1 선호도 수 지의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 PBS 가진 구슬을 먼저 씻어. 그런 다음 단계 3.2.6 후 GPC3-S-팹을 포함 된 dialyzed 솔루션을 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.
- 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기, 4 ° c. 조심 스럽게 상쾌한 다른 신선한 얼음 튜브를 제거 하 고 중력의 열 수 지를 전송.
- 10 추가 세척의 이력서는 열 (PBS)를 버퍼링 하 고 세척 분수 차입을 수집.
- 트리 스 pH 9.0 (각 eluted 분수의 mL 당 0.1 mL)의 1m를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 3 이력서 차입 버퍼 (글리신-HCl, pH 2.7의 0.1 m M)와 함께 elute 및 수집 eluted 분수; 3 회 반복 한다.
- 투 석 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 PBS의 2 L에 eluted 분수를 두 번 반복 합니다.
- Ultramicrospectrophotometer에 의해 단백질 농도 결정 (어 금 니 소 광 계수: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).
4. SDS 페이지와 서 부 럽 분석
- SDS 로딩 버퍼 x 5 샘플의 10 µ L를 고려 하 고 잘 섞으십시오. 5 분 동안 100 ° C에서 단백질 혼합물을 끓인 다.
- SDS 로딩 버퍼 x 5를 준비: Tris HCl, pH 6.8, 10 %wt / 집 SDS의 250 m m, 0.5 %wt / 집 bromophenol 블루, 50 %vol / vol 글리세롤, 5 %vol / vol 베타-mercaptoethanol.
- 앞에서 설명한26,,2728는 SDS 페이지 젤 로드 젤 (5%)와 분리 젤 (12%)를 준비 합니다.
- 삶은 단백질 혼합물의 단백질 마커, 10 µ L을 로드 하 고 실행 SDS 페이지.
- 젤 Coomassie 화려한 블루 솔루션, 20 분 동안 흔들어 하 여 얼룩 하 고 destaining을 수행 합니다.
- PVDF 막에 전송 후 서 부 럽 TBST (20 mM Tris HCl의 NaCl, 0.1 %vol / vol 트윈 20의 150 m m)와 막 차단 + 5 %wt / vol 흔들어 동안 실 온에서 1 h 동안 우유를 탈지 합니다.
- 1 차 항 체를 막 품 어 (반대로 그의 또는 반대로 플래그) 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에 희석.
- TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.
- 이차 항 체 (HRP 연결 방지 마우스 Fc 항 체) 희석 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에에서 막 품 어.
- TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.
- 영화 당 HPR 기판의 1 mL을 추가 하 고 개발 이미지.
5. 젤 여과 분석
- 다음 열을 사용 하 여: 열 양의 24 mL; 재래식 버퍼 PBS pH 7.4;의 온화한; 룸에서 0.5 mL/min의 유량 200 µ L의 샘플 볼륨입니다.
- 다음 단백질의 양과 농도 사용 하 여: 1.2 mg/mL GPC3-S-팹의 500 µ L. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.
- 단백질 마커 볼륨 및 농도 대 한 하나의 튜브 (2 mg/mL, 12.4 kDa)는 시 토 크롬 C의 100 µ L, 탈수 (3 mg/mL, 29 kDa)의 140 µ L, 알 부 민 (10mg/mL, 66 kDa)의 140 µ L 및 알콜 효소 (5 mg/mL, 150 kDa)의 200 µ L 걸릴. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.
- 각 실행 하기 전에 적어도 2 씻고 증류수 0.5 mL/min 흐름 속도로 이력서.
- 적어도 2 열 equilibrate 평형 버퍼 (PBS, pH 7.4) 0.5 mL/min 유량의 이력서.
- 자동으로 샘플을 로드 0.5 mL/min에서 샘플을 주입.
- 0.5 mL/min에서 재래식 버퍼 elute 고 280 그리고 215 nm에서 검출.
6. 교류 Cytometry 분석
- 문화는 HepG2 (긍정적인 GPC3) Hep3B (긍정적인 GPC3), Huh7 (GPC3 양수), 및 MHCC-97 H (GPC3 제외) 셀 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 µ g/mL), 및 37 ° C에서 스 (50 µ g/mL) 5% CO2.
- 문화 조 (GPC3 제외) 세포와 조/GPC3 세포는 전체 길이 인간의 GPC3 cDNA (GPC3 긍정적인) 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2RPMI 1640 매체에에서 은닉.
- NK92/CD16 전체 길이 인간의 CD16 cDNA (CD16 긍정적인) 은닉 RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2를 포함 하는 25 c m2 플라스 크에 문화.
- 셀 70-90% 합칠 때, 매체를 삭제 하 고 2 mL의 PBS로 세포를 씻어. 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 2-3 분 (또는 때까지 세포 표면에서 분리를 시작) 37 ° C에서 품 어. 중화 하는 트립 신 고 다시 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 중단 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 Trypan 블루 세포 생존 능력을 감지.
- 각 셀 라인 3 x 106 셀을 수집 합니다. 1 mL의 PBS + 0.2 %BSA 다시 셀을 일시 중지를 추가 합니다. 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분 두 번 반복에 대 한.
- 0.3 mL PBS + 0.2 %BSA 다시 셀, 일시 중지를 추가 하 고 각 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브를 100 µ L (약 1 백만)를 전송.
참고: 여기에서 모든 단계는 튜브를 얼음에 차가운 유지 한다 있는지 확인 하십시오. 항 체를 세포 표면 항 원에 바인딩할 때 복잡 한 내 면화 하기 시작 합니다. 유지 함으로써 그것은 감기, 과정은 크게 둔화. - 모든 튜브에 1 차 항 체 (GPC3-S-팹 또는 인간 IgG1, 최종 농도 5 µ g/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.
- PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.
- 다시 PBS + 0.2 %BSA 100 µ L에서 중단 하 고 이차 항 체 (반대로 인간 IgG(H+L)-488, 최종 농도 10 µ g/mL)의 0.5 µ L을 추가 1 헤 주 ice에 품 어:이 단계에서 하십시오 빛에서 세포를 유지.
- PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.
- 29표준 프로토콜 따라 교류 cytometer 세포 분석. 여기 488 nm 레이저로 세포를 획득 합니다.
7. 세포 독성 분석 실험
- 종양 세포를 준비 합니다.
- 문화 HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97 H, 그리고 조 세포 라인 단계 6.1-6.5에에서 설명 된 대로.
- 0.5 × 105/mL, 셀을 희석 하 고 100 µ L 셀 (5000 잘 당) 96 잘 접시에 접시. 연결할 셀 수 있도록 6-8 h 문화.
- 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 준비 합니다.
- 50 mL 원뿔 튜브에 PBS의 동등한 양 가진 신선한 준비 된 혈액을 희석. 예를 들어 혈액의 PBS의 10 mL와 10 mL 희석.
- 신선한 50 mL 원뿔 관으로 림프 구 분리 매체의 15 mL를 가져가 라. 천천히 희석된 혈액 튜브 측면을 따라 림프 구 분리 매체에 전송 합니다.
참고: 수직 튜브를 유지. 림프 구 분리 매체의 표면을 휴식 하지 않습니다. - 브레이크에서 실 온에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.
- 천천히 위 플라즈마 레이어를 제거 하 고 플라즈마-림프 구 분리 매체 인터페이스에서 PBMCs를 포함 하는 백색 혈액 레이어.
- PBS + 2% 더블 볼륨 PBMCs 희석 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.
- 씻어 PBS + 2%로 두 번 셀 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기 단계 6.5에서에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.
- NK 세포를 준비 합니다.
- 5 x 107 셀/mL PBS + 2 %FBS, 및 장소에서의 농도 PBMCs 정지 준비 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 그들.
- 셀의 50 µ L/mL에서 농축 칵테일 인간 NK 세포를 추가 합니다. 잘, 그리고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- Resuspend 그들은 균일 하 게 pipetting으로 일시 중단 되도록 NK 세포 농축 키트, 잘 믹스에서 자석 입자 고 아래 5 번 보다 더 적극적으로. 세포 현 탁 액에 100 µ L/mL에서 resuspended 자석 입자를 전송. 잘, 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- PBS + 2% 추가 하 여 최대 2.5 mL의 총 볼륨 세포 현 탁 액을가지고 FBS. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 튜브에 세포를 혼합. 자석으로 (모자) 없이 튜브를 놓습니다. 마그네틱 구슬 실 온에서 2.5 분에 대 한 진정 하자.
- 자석을 제거 합니다. 한 연속 움직임에 새로운 튜브에 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 튜브 반전.
- 6.5 단계에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.
- 세포 독성 반응을 설정 합니다.
- 5 × 105 셀/ml 해당 문화 매체를 사용 하 여 NK 세포를 희석. 96 잘 접시에 도금 하는 종양 세포를 NK 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.
- 30 µ g/mL, 3 희석, 9 포인트 (3 복제)의 최종 농도에 높은 복용량과 함께 다른 농도에서 GPC3-S-팹 10 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.
- 외피의 72 h 후 매체, 제거 그리고 DMEM 매체 포함 하는 CCK8 시 약 96 잘 접시에 잘 각 하의 10 µ L의 100 µ L를 추가 하 고 37 ° c.에 품 어
- 450에 접시를 읽고 1, 2, 3, 및 4 h CCK8 시 약을 추가한 후에 nm.
- 데이터를 분석 합니다. 생존 율을 계산 하는 (OD450 GPC3-S-팹 + 이펙터 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 -OD450 매체) × 100%, (OD450 GPC3-S-팹 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 - OD450 매체) × 100%. 효과 기 세포는 NK 세포 이다.
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Representative Results
GPC3-S-팹 정화
GPC3-S-팹은 정화 대장균 에서 2 단계 선호도 정화에 의해 먼저 Ni-주권-agarose, IgG CH1 친 화력 정화 다음으로. 2 단계 선호도 정화 후 GPC3-S-팹 1:1 (그림 2A)에 가까운 두 개의 체인으로 동질성을 정화 했다. VH-CH1-CD16 VHH와 VL-CL polypeptides의 존재 그들의 뚜렷한 C 터미널 태그에 의해 확인 될 수 있다 반대로 그의 VL-CL 대략 25 kDa, VH-CH1-VHH 약 38 kDa (그림 2B)에 대 한 반대로 플래그에 대 한. 2 단계 선호도 정화 후 ~1.2 mg 단백질 SB 문화 1 리터에서 얻어질 수 있다. 더 정화 GPC3-S-팹 특성, 젤 여과 수행 되었다. 표준 마커 (그림 2C)을 바탕으로, GPC3-S-팹 약 63 kDa (그림 2C)의 분자 크기는 heterodimer 형태로 동종 단위체로 확인 되었다.
GPC3-S-팹 바인딩 활동
GPC3-S-팹 GPC3-긍정적인 세포와 CD16-긍정적인 세포 인식 여부를 평가 하려면 흐름 cytometry 분석 GPC3 양성 간 암 세포 선 HepG2, Hep3B, Huh7, 조/GPC3 및 GPC3 부정적인 간 암 세포 선를 사용 하 여 실시 했다 MHCC-97 H, 그리고 조 셀입니다. GPC3-S-팹 모든 GPC3-긍정적인 세포 비록 바인딩으로 약한 Hep3B에 바인딩할 수 있는 (그림 3B)와 Huh7 세포 (그림 3C) 보다 HepG2 (그림 3A)와 조/GPC3 (그림 2F). 아니 또는 GPC3-네거티브 MHCC-97 H와 조 셀에 최소한의 바인딩 (그림 3D, 3E) 관찰 되었다. GPC3-S-팹 또한 CD16-긍정적인 세포, NK92/CD16 셀 (그림 3)에 바인딩할 수 있습니다. 이러한 결과 다른 안티-GPC3 항 체30, GPC3-S-팹 GPC3 양성 세포 선 및 CD16-긍정적인 세포에 특히 묶는 수 제안를 사용 하 여 이전 결과와 일치 합니다.
GPC3-S-팹의 세포 독성을 평가 하기 위해 종양 세포 GPC3-S-팹의 다른 농도와 신선한 고립 된 NK 세포와 인 큐베이 팅 했다. NK 세포, 없이 GPC3-S-팹 GPC3 식 상태 (그림 4)에 종양 세포에 대 한 아무 세포 독성을 했다. NK 세포, 존재 GPC3-S-팹 복용량 의존 방식에서 Hep3B, Huh7, HepG2 세포에 대하여 강한 세포 독성을 유발 하지만 GPC3 부정적인 MHCC-97 H 세포 (그림 4)에 영향을 주지 않습니다 그 제안 GPC3-S-팹의 세포 독성 종양 세포 표면에 GPC3 식에 따라 다릅니다.
그림 1입니다. GPC3-S-팹의 구조
GPC3-S-팹의 (A) 세균성 식 구조. 구문을 포함 pelB 신호 순서, 인간 답게 된 안티-GPC3 (GC33) VH-CH1-안티-CD16 VHH (무거운 사슬), 또는 VL-CL (경 쇄). 단백질 검출 및 정화를 촉진 하기 위하여 플래그 태그 또는 His8 태그 C-말단에 추가 되었습니다. (B) 다이어그램의 GPC3-S-팹 공동 식 후.
그림 2입니다. GPC3-S-팹 정화 대장균.
Ni NTA 친화성 크로마토그래피; 후 (A) 왼쪽된 패널 안티 IgG CH1 친화성 크로마토그래피; 후 오른쪽 패널 M, 분자량 사다리; Coomassie 파란 얼룩입니다. Ni NTA 친화성 크로마토그래피; 후 (B) 왼쪽된 패널 안티 IgG CH1 친화성 크로마토그래피; 후 오른쪽 패널 M, 분자량 사다리; 서 부 럽. (C) GPC3-S-팹의 여과 분석 젤. 상위 패널, 표준 마커; 하단 패널, GPC3-S-팹입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 세포 CD16-긍정적인 세포 인식합니다.
HepG2 cytometry 분석 흐름 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC-97 H (D), (E), 조 조/GPC3 (F) 및 NK92/CD16 (G) 세포 프로토콜에 설명 된 대로 수행 했다. 레드 라인: 종양 세포만; 녹색 선: isotype 제어, 종양 세포 인간 IgG1 + 안티 인간 IgG(H+L)-488; 블루 라인: 종양 세포 + GPC3-S-팹 + 안티 인간 IgG (H + L)-488. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. GPC3-S-팹 GPC3-긍정적인 암 세포의 세포 죽음을 승진 시킨다.
복용량-의존 세포 독성 분석 실험 HepG2 프로토콜에 설명 된 대로 수행 했다 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), 및 MHCC-97 H (D). GPC3-S-팹의 농도 0.0045 µ g/mL에서 30 µ g/mL 이었다. 데이터는 표준 편차를 나타내는 오차 막대 와 triplicates의 평균. 단단한 원형만 GPC3-S-팹; 단색 정사각형 GPC3-S-Fab+ NK, NK 세포 (잘 당 50000) 및 대상 셀 (잘 당 5000). 섞어 세포 독성 측정 전에 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 bsAbs의 새로운 형식을 구성 하는 전략 소개 GPC3 긍정적인 종양 세포를 대상으로 하는 NK 세포를 모집 할 수 있는 GPC3-S-팹. S-팹 자연 팹 기반 안티 CD16 VHH11,12를 추가 하 여 형식. BsAbs 포함 된 Fc 지역에 비해, GPC3-S-팹 쉽게 생산 수 있습니다 큰 규모에 박테리아의 periplasm에서.
프로토콜에 설명 된 식과 정화 전략을 사용 하 여, 우리는 가용성과 기능 GPC3-S-팹에에서 얻은. Periplasmic 식, 촉진 하기 위하여 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 N-말단에 추가 되었습니다. 세포질, 달리 더 산화 세포질 및 외부 세포 막 사이의 periplasmic 공간에 단백질 폴딩 및 어셈블리에 대 한 중요 한 단백질의 수를 장착 하는 환경과 따라서 수정 접는 촉진 및 재조합 형 단백질16의 가용성입니다. 그러나, 단백질 폴딩 및 대장균 에서 periplasm 수출 기계 용량을 제한 했다. 종종 재조합 단백질의 높은 식 periplasm16에 불용 성 제품의 축적에 발생합니다. 시간의 짧은 기간 동안 단백질의 높은 표현을 피하기 위해, 낮은 IPTG (0.2 m m) 및 저온 (16 ° C) 영양가 있는 매체에는 불용 성 단백질의 축적을 피하기 위해이 프로토콜에 적용 되었다. 이 연구에서 ~1.2 mg 단백질은 적어도 2-fold 이전 작품12에 비해 수율을 향상 하는 매체의 1 L에서 얻은 했다.
단백질 저하를 방지 하려면 다양 한 단계에서 GPC3-S-팹을 포함 하는 모든 분수는 얼음에 보관 한다. 그의 VL-CL의 C-터미널에서 태그 Ni NTA agarose 정화를 위해 사용 되었다. 그러나, 단일 Ni NTA agarose 정화 홀된 VL-CL 단백질 등 원치 않는 단백질을 제거 하려면 충분 하지 않습니다. 균질 heterodimeric GPC3-S-팹, 두 번째 단계 정화 안티 IgG CH1 친 화력 정화, 적용 했다. 순화 된 단백질 고 순도 1: 1에 가까운 두 polypeptides 했다 (그림 2A-2B).
젤 여과 착 색 인쇄기는 그들의 분자 크기와 모양의;에 따라 단백질의 분자 중량을 확인할 수 있습니다. 순도;의 정도 분석 순화 된 단백질 단위체, 인지 확인 하 고 이합체, 또는 집계15의 구성. 젤 여과 크로마토그래피에 의해 GPC3-S-팹 GPC3-S-팹 (그림 2C)의 heterodimerization와 모노 머의 형태로 약 63 kDa의 예상 분자 크기 확인 되었습니다.
Cytometry 전통적인 서 부 럽 고 애 란만 항 원-항 체 바인딩 반응을 감지에 비해 세포 막에 항 체의 항 원에 바인딩할 수 있습니다 여부를 확인할 수 있습니다. 교류 cytometry 분석, GPC3-S-팹 GPC3 팹 moiety는 기능 제안 세포 막에는 GPC3를 인식. 교류 cytometry 분석을 수행할 때 그것은 항 체를 추가한 후 모든 단계 또는 얼음에 4 ° C에서 유지 하는 중요 한. 항 체를 세포 표면 항 원에 바인딩하는 경우 항 체 항 원 복합물 국제화를 시작 합니다. 유지 함으로써 그것은 감기, 국제화 과정은 크게 둔화.
PBMCs 및 NK 세포 림프 구 분리를 사용 하 여 원심 분리 하 여 인간 주변 혈액에서 효율적으로 고립 되었다 매체, 뒤에 자석 활성화 셀 전략을 정렬. GPC3-S-팹 대상 세포 (종양 세포) NK 세포의 비율은 10:1, 대상 세포를 NK 세포의 비율 50: 1에서 5: 1로 다를 수 때 GPC3 긍정적인 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 보여주었다.
요약 하자면, GPC3-S-팹, 미생물 식 시스템에서 생산 될 수 있는 종양에 대 한 bsAbs의 기능 형식을 만들 새로운 길을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 R & D 계획의 광 동성 (중국 홍보) (2016A050503028)에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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