Summary
在此, 我们提出了一种在大肠杆菌中产生双特异性抗体 GPC3-S-Fab 的协议.纯化 GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性肝癌细胞具有较强的细胞毒性作用。
Abstract
该协议描述了双特异性抗体 (bsAb) 的构建和功能研究, GPC3-S-Fab。bsAbs 可以通过两个不同的手臂识别两个不同的表位。bsAbs 已积极研究他们的能力, 直接招募免疫细胞杀死肿瘤细胞。目前, 大多数 bsAbs 是以重组蛋白的形式生产的, 它们要么是含有 fc 的 bsAbs, 要么是没有 fc 区域的较小的 bsAb 衍生物。本研究通过将 anti-GPC3 抗体 GC33 与 anti-CD16 单域抗体相结合, 设计了一种基于抗体片段 (GPC3-S-Fab) 的双特异性抗体。GPC3-S-Fab 可在大肠杆菌中表达, 并经两种亲和 chromatographies 纯化。纯化的 GPC3-S-Fab 可以通过招募自然杀伤细胞来明确地结合和杀死 GPC3 阳性肝癌细胞, 这表明 GPC3-S-Fab 在肝癌治疗中的潜在应用。
Introduction
单克隆抗体现在广泛用于癌症治疗1。由于抗体的柔韧性, 各种基于抗体的格式已经得到了积极的探索。与单克隆抗体相比, bsAbs 有两种不同的抗原结合模块, 能够同时识别两个不同靶点, 有效地触发免疫效应细胞的招募, 以靶向和杀死肿瘤细胞2。
当前的重组 bsAb 格式通常可以分配给两个类: fc 包含 bsAbs 和 bsAbs, 而没有 fc 区域。与大多数哺乳动物细胞中所含 fc 格式相比, 没有 fc 区域的 bsAbs 具有较小尺寸的优点, 更容易在微生物表达系统中产生, 并且能更有效地穿透肿瘤组织。3。
没有 Fc 区域的 bsAbs 通常是通过链接单个绑定基团 (如单链变量片段 (scFvs) 或3) 来形成的。如果没有稳定的域, 基于抗体碎片的 bsAbs 通常会损害热稳定性、低溶解度或增加聚集4、5的潜力。相比之下, 以 bsAbs 为基础的 heterodimerization, 由于 CH1 和 CL 在原生的晶圆4,6, 更稳定。
由重链抗体 (VHHs, 也称为单域抗体) 的可变域是天然重链抗体的活性抗原结合片段7。VHHs 具有亲和力高、常规 IgGs8特异性强、免疫原化低、细菌表达率高的特点9。与抗体片段相比, VHHs 具有较高的热稳定性10。与基团相比, VHHs 的尺寸较小, 因为缺乏 CH1 和 CL。因此, 通过将 bsAb 与单域抗体、VHH 相连接获得的 S 型, 设计并研究了其抗肿瘤作用11、12。
本文介绍了 hGC3313与 anti-CD16a VHH14相结合的 GPC3-S-Fab 结构。周质在大肠杆菌(大肠杆菌)中的表达能有效地产生 GPC3-S-Fab。GPC3-S-Fab 的功能性研究表明 GPC3-S-Fab 是肝癌治疗的一个有前途的策略。因此, GPC3-S-Fab 在替代技术上的优势和适用于以前研究的参考, 包括易于生产和纯化, 以及更稳定的 bsAbs。
哺乳动物表达系统和原核表达系统已被用来表达各种形式的 BsAbs。与哺乳动物表达系统相比,大肠杆菌蛋白表达系统具有产量高、成本低、省力、遗传操作方便、转化效率高15的优点。对于 bsAbs 在大肠杆菌中的表达, 有两种基本策略: 细胞质中的表达和细胞质与外细胞膜之间 periplasm 的表达15。与细胞质的还原环境相比, periplasm 是一种比较氧化的环境, 促进了蛋白质16的正确折叠和共表达。正确的折叠对 bsAbs 的溶解度、稳定性和功能生成起着关键的作用。因此, 在 s--政局的 N 端添加了一个信号序列, 直接分泌到大肠杆菌的 periplasm17。为了确保正确的折叠、溶解度、热稳定性和构象稳定性, 减少抗体的复杂性和大小经常被使用16。S-晶圆的格式包括一个工厂和一个 VHH, 这是表达很好的细菌系统可能由于简单的结构和小规模。
GPC3 是在这种 GPC3-S-Fab 双特异性抗体格式中选择的。Glypican-3 (GPC3) 是肝素硫酸盐 (HS) 蛋白多糖家族的成员, 通过 glycosylphosphatidylinositol (GPI)18锚定在细胞表面。GPC3 是抗原70% 肝癌 (HCC) 病例, 占大多数肝癌19,20,21,22。由于 GPC3 在正常组织中很少表达, GPC3 被建议为肝癌的潜在靶向。对 GPC3 产生了多个鼠标抗体。然而, 只有 GC33 显示有限的抗肿瘤活动22, 它没有表现出临床疗效的病人。在这项研究中, GPC3-S-Fab 被证明能够招募 NK 细胞杀死 GPC3 肿瘤细胞14。
为了招募 NK 细胞, 使用了 anti-CD16 VHH。CD16a 是一种低亲和 IgG 受体, 主要表现为自然杀伤细胞、巨噬素、单核和 T 细胞的某些亚型。它涉及抗体依赖性细胞细胞毒性 (ADCC) 的 NK 细胞23。人 NK 细胞可分为两类, CD56-CD16+ 和 CD56+CD16。与 CD56+CD16− nk 细胞相比, CD56-CD16+ nk 细胞可以释放出更高水平的穿孔和颗粒酶 B, 从而呈现出强烈的细胞毒性24。枯否细胞 (KCs), 表达 CD16a, 是肝脏中的巨细胞。枯否细胞在25肝癌的抑癌中起着重要作用。因此, bsAbs 靶向 CD16a 可能是一个更有希望的策略比接触 T 细胞对抗肝癌。
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Protocol
所有的程序, 包括人的血液收集被孙中山大学伦理委员会批准。
1. GPC3-S-Fab 设计策略
- 设计 GPC3-S-Fab 通过链接一个 anti-GPC3 (人性化的 GC3313) 与 anti-CD16 VHH14 (图 1)。
- 将 VH-CH1-CD16-VHH 和 pET26b 和 pET21a 载体合成并克隆为先前报告的12。
2. 变革和文化
- 将含有 VH-CH1-CD16 (图1A) 和 100 pET26b 的 pET21a 的 100 ng 添加到100µL 的主管BL21 (DE3) 细胞中。拌匀, 在冰上孵育30分钟, 在42摄氏度的水浴中孵化 45-九十年代, 转移, 并在冰上孵化 3-5 分钟。
- 将500µL 溶源性汤 (磅) 培养基放入含有 BL21 (DE3) 细胞的管中, 然后在37摄氏度处孵化, 150 rpm 45-60 分钟100µL 的 BL21 (DE3) 细胞在含有50µg/毫升卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林的 LB 琼脂板上的分布, 然后孵育37°c 12-16 小时。
- 准备溶源性肉汤 (磅) 培养基: 1% 磅/卷胰蛋白胨, 0.5% 磅/卷酵母萃取物, 1% 磅/卷氯化钠。
- 接种细胞从一个单一的殖民地成5毫升的超级汤 (锑) 培养基含有50µg/毫升卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林, 和文化在37摄氏度, 220 rpm, 一夜之间。然后, 将1毫升的培养物接种到100毫升的锑培养基中, 其中含有50µg卡那霉素和100µg/毫升氨苄西林, 培养在37摄氏度, 220 rpm 为 4 h。然后, 将10毫升的培养物转移到1升的锑培养基中, 含卡那霉素50 µg/毫升,氨苄西林100 µg/毫升, 培养37摄氏度, 220 rpm。
- 准备超级肉汤培养基: 3.2% 胰蛋白胨/卷, 2% 个/卷酵母萃取物, 0.5% 个/卷氯化钠。
- 当外径600达到 0.6-0.8, 加入异丙基 d-硫 galactopyranoside (IPTG) 到最终浓度为0.2 毫米。文化在16°c, 180 转每分钟为 36-48 h 为周质表示。
3. GPC3-S-Fab 周质纯化
- 周质分数准备
- 收集细胞通过离心在 4000 x g, 4 °c 30 分钟, 丢弃培养基, 并权衡细胞。
- 并用重悬在4毫升的冰冷蔗糖溶液 (20 毫米的三盐酸, pH 7.5; 25% (重量/卷) 蔗糖和1毫米 EDTA) 每克细胞, 并在冰上孵育15分钟。
- 离心机在 8500 x g (桌上部离心机, 固定的角度转子), 4 °c 为20分钟. 去掉上清 (蔗糖分数) 并将其保存在冰上。
- 并用重悬在冰冷的5毫米氯化镁2和1毫米的 PMSF (每克细胞4毫升) 混合的颗粒。添加40µL 的溶菌酶的股票 (15 毫克/毫升) 每克, 并在冰上孵化30分钟。
- 离心机在 8500 x g (桌上部离心机, 固定角度转子), 4 °c 为20分钟. 转移上清 (周质分数), 并保存在冰上。
- 结合蔗糖分数和周质分数, 离心机在 3万 x g, 4 °c 30 分钟. 取出上清, 并将其保存在冰上的50毫升锥形管中。
- 镍 NTA 亲和纯化
- 并用重悬1毫升的镍 NTA 琼脂糖通过混合彻底达到均匀悬浮, 除去1毫升的镍 NTA 琼脂糖到一个新鲜的15毫升圆锥管, 并增加10柱容积 (CV) 平衡缓冲 (25 毫米的三 HCl, pH 7.5; 1 米氯化钠) 到平衡。
- 离心机在 400 x g 的5分钟, 并仔细清除上清。然后, 将镍 NTA 琼脂糖加入含有蔗糖分数和周质分数的50毫升管中。岩石在4°c 为 2 h。
- 离心机的混合物在 400 x g, 4 °c 为5分钟. 小心地将上清液移至另一条新鲜冰冷的管子作为未绑定的分数。将镍 NTA 琼脂糖转移到重力柱上。
- 添加10个洗涤缓冲器 (25 毫米的三盐酸, pH 7.5; 1 米的氯化钠; 20 毫米, 30 毫米或40毫米咪唑) 到列, 并收集洗脱作为洗涤分数。
注意: 这些解决方案应添加到增加咪唑浓度的顺序。 - 添加3个洗脱缓冲液 (25 毫米的三盐酸, pH 7.5; 300 毫米氯化钠; 100 毫米, 200 毫米, 300 毫米或400毫米咪唑) 到专栏并且收集洗脱作为洗脱分数 1, 2, 3 和4。
注意: 这些解决方案应添加到增加咪唑浓度的顺序。 - 透析洗脱2升的 PBS (137 毫米氯化钠, 2.7 毫米的氯化钾, 10 毫米的 Na2HPO4, 2 毫米的第 2 PO4,pH 7.4) 使用透析油管 (12.4 kDa) 在4°c 为 2 h. 检查是否存在 GPC3-S-Fab 由 12% SDS 页, 然后通过考马斯蓝染色。
- IgG-CH1 亲和纯化
- 将1毫升的 IgG-CH1 亲和树脂转化为50毫升圆锥管, 首先用 PBS 清洗珠子。然后, 在步骤3.2.6 后添加包含 GPC3-S-Fab 的透析解决方案。岩石在4°c 为 2 h。
- 离心机在 400 x g 为5分钟, 4 °c。小心地将上清液移到另一条新鲜冰冷的管子上, 将树脂转移到重力柱上。
- 将洗涤缓冲器 (PBS) 的10个 CV 添加到柱上, 并将洗脱作为洗涤分数。
- 通过添加1米的三 pH 值 9.0 (每个洗脱分数的每毫升0.1 毫升) 准备收集管。洗脱 3 CV 洗脱缓冲器 (0.1 米甘氨酸盐酸盐, pH 2.7), 并收集洗脱分数;重复3次。
- 用透析油管 (12.4 kDa) 在4摄氏度洗脱2升的 PBS 进行透析. 重复两次。
- 用 ultramicrospectrophotometer 测定蛋白质浓度 (摩尔消光系数: 91105. 1 A280 = 0.69 毫克/升)。
4. SDS 页和西方印迹分析
- 将10µL 的样品放入 5x SDS 加载缓冲器中, 混合均匀。将蛋白质混合物煮沸100摄氏度, 5 分钟。
- 准备 5x SDS 装载缓冲器: 250 毫米的三盐酸, pH 值 6.8, 10% 量/卷 SDS, 0.5% 溴酚/卷蓝色, 50% 卷/卷甘油, 5% 卷/卷 beta 巯基乙醇。
- 准备一个 SDS 页凝胶与加载凝胶 (5%) 和分离凝胶 (12%), 如前所述26,27,28。
- 加载10µL 的煮蛋白质混合物和蛋白质标记, 并运行 SDS 页。
- 用考马斯亮蓝溶液晃动20分钟, 然后执行脱色。
- 对于西方印迹, 转移到 PVDF 膜后, 用 TBST (20 毫米的三 HCl、150毫米氯化钠、0.1% 卷/卷补 20) + 5% 小时脱脂牛奶在室温下, 在震动时将膜堵塞。
- 用原抗体 (反他或反旗) 孵育膜, 稀释 1:2, 000 TBST + 5% 脱脂奶1小时。
- 在室温下用 TBST 洗5分钟, 重复3次。
- 在二级抗体中孵化膜 (与酶联的抗小鼠 Fc 抗体) 稀释 1:2, 000 TBST + 5% 脱脂牛奶1小时。
- 在室温下用 TBST 洗5分钟, 重复3次。
- 每片添加1毫升 HPR 基片, 开发并拍摄图像。
5. 凝胶过滤分析
- 使用以下栏: 列容积为24毫升;PBS pH 值7.4 的平衡缓冲器;室温下0.5 毫升/分的流动速率;样品体积为200µL。
- 使用以下蛋白质体积和浓度: 500 µL 1.2 毫克/毫升 GPC3-S-Fab。离心机在 2万 x g 30 分钟, 并采取200µL 加载。
- 对于蛋白质标记的体积和浓度, 采取100µL 细胞色素 C (2 毫克/毫升, 12.4 kDa), 140 µL 的酸酐酶 (3 毫克/毫升, 29 kDa), 140 µL 的白蛋白 (10 毫克/毫升, 66 kDa) 和200µL 酒精脱氢 (5 毫克/毫升, 150 kDa) 成一管。离心机在 2万 x g 30 分钟, 并采取200µL 加载。
- 每次运行前, 以0.5 毫升/分钟的流速清洗至少2的蒸馏水。
- 平衡至少有 2 CV 的平衡缓冲器 (PBS, pH 值 7.4), 流速为0.5 毫升/分钟。
- 自动注入0.5 毫升/分钟的样品来装载样品。
- 洗脱与平衡缓冲器在0.5 毫升/分钟, 并检测在280和 215 nm。
6. 流式细胞仪分析
- 文化 HepG2 (GPC3 阳性), Hep3B (GPC3 阳性), Huh7 (GPC3 阳性), MHCC-97H (GPC3 阴性) 细胞在100毫米 x 20 毫米的塑料菜肴含有 DMEM 培养基10% 胎牛血清 (血清), 青霉素 (100 µg/毫升) 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37°c,5% CO2。
- 培养的 CHO (GPC3 阴性) 细胞和 CHO/GPC3 细胞窝藏全长人类 GPC3 cDNA (GPC3 阳性) 在100毫米 x 20 毫米塑料菜肴含有 RPMI 1640 培养基10% 血清, 青霉素 (100 µg/毫升), 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37摄氏度, 5% CO2。
- 在 25cm2瓶含有 RPMI 1640 培养基10% 血清, 青霉素 (100 µg/毫升), 和链霉素 (50 µg/毫升) 在37摄氏度, 5% CO2的 NK92/CD16 中, 培养全长人 CD16 cDNA (CD16 阳性)。
- 当细胞 70-90% 汇合时, 丢弃培养基, 用2毫升的 PBS 冲洗细胞。添加1毫升0.25% 胰蛋白酶和孵育37°c 2-3 分钟 (或直到细胞开始从表面分离)。添加1毫升的完全生长培养基, 以中和胰蛋白酶和重新暂停细胞通过轻轻吹打上下。
- 用 Neubauer hemocytometer 计数细胞数, 用台盼蓝检测细胞活力。
- 为每个细胞线收集 3 x 106细胞。添加1毫升 PBS + 0.2% BSA, 以重新悬浮细胞。离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复两次。
- 添加0.3 毫升 PBS + 0.2% BSA, 以重新悬浮细胞, 并转移100µL (约 100万) 到每5毫升聚苯乙烯圆底管。
注意: 请确保从这里到管道的所有步骤都应在冰上保持冷。当抗体与细胞表面抗原结合时, 复合体将开始内部化。通过保持寒冷, 这个过程会大大减慢。 - 添加10µL 的主要抗体 (GPC3-S-Fab 或人类 IgG1, 最终浓度5µg/毫升) 每管, 并在冰上孵化1小时。
- 添加1毫升 PBS + 0.2% BSA 清洗, 离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复三次。
- 在100µL 的 PBS + 0.2% BSA 中重新暂停, 然后添加0.5 µL 的二级抗体 (抗人 IgG (H + L)-488, 最后浓度10µg/毫升) 和在冰上孵育1小时. 注: 从这一步, 请保持细胞不受光线的影响。
- 添加1毫升 PBS + 0.2% BSA 清洗, 离心机在 200 x g, 4 °c 为5分钟. 重复三次。
- 根据标准协议29, 用流式细胞仪对单元进行分析。用488纳米激光获取细胞激发。
7. 细胞毒性化验
- 准备肿瘤细胞。
- 文化 HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC-97H 和 CHO 细胞系, 如步骤 6.1-6.5 所述。
- 稀释细胞到 0.5 x 105/毫升, 和板材100µL 细胞 (每井5000个细胞) 在96井板材。文化 6-8 h 允许细胞附加。
- 制备人外周血单个核细胞 (PBMCs)。
- 用50毫升锥形管中的 PBS, 稀释新鲜的准备好的血液。例如, 用10毫升的 PBS 稀释10毫升血液。
- 将15毫升淋巴细胞分离培养基转化为新鲜的50毫升圆锥管。慢慢将稀释后的血液转移到淋巴细胞分离培养基上。
注意: 保持管子垂直。不要破坏淋巴细胞分离培养基的表面。 - 离心机在 400 x g 为35分钟在室温下与刹车。
- 慢慢移除上血浆层, 并采取在血浆淋巴细胞分离培养基界面中含有 PBMCs 的白血层。
- 稀释 PBMCs 的双卷 PBS + 2% 的血清。离心机在 400 x g 5 分钟。
- 用 PBS + 2% 的血清冲洗细胞两次。离心机在 400 x g 的5分钟. 计算步骤6.5 中所述的单元格数。
- 准备 NK 细胞。
- 准备 PBMCs 悬浮在 5 x 107细胞/毫升的 PBS + 2% 的血清, 并把它们放在一个5毫升聚苯乙烯圆底管。
- 添加人类 NK 细胞浓缩鸡尾酒在50µL/毫升细胞。混合好, 室温孵育10分钟。
- 从 NK 细胞浓缩试剂盒中并用重悬磁性颗粒, 混合均匀, 确保吹打向上和向下一致悬浮5倍以上。将悬浮磁性粒子转移到100µL/毫升到细胞悬浮。混合好, 室温孵育5分钟。
- 通过增加 PBS + 2% 的血清, 使细胞悬浮量达到2.5 毫升的总体积。通过轻轻吹打 2-3 倍, 将管中的细胞混合在一起。把管子 (没有盖子) 放进磁铁里。让磁性珠子在室温下安定下来2.5 分钟。
- 卸下磁铁。在一个连续的运动中, 将管子倒置, 将富细胞悬浮液倒入新管中。
- 按步骤6.5 中的说明计算单元格数。
- 建立细胞毒性反应。
- 使用相应的培养基将 NK 细胞稀释为 5 x 105细胞/毫升。将 NK 细胞悬浮液中的100µL 添加到96井板上镀的肿瘤细胞中。
- 添加10µL 的 GPC3-S-Fab 在不同浓度, 最高剂量的最终浓度为30µg/毫升, 3 倍稀释, 9 点 (三复制)。
- 孵育在37°c, 5% CO2为 72 h。
- 经过72小时的孵化, 去除培养基, 并添加100µL 的 DMEM 培养基含有10µL 的 CCK8 试剂, 每个井在96井板, 然后孵化在37摄氏度。
- 添加 CCK8 试剂后, 在1、2、3和 4 h 上读出 450 nm 的板材。
- 分析数据。计算存活率为 (OD450 GPC3-S-Fab + 效应 + 肿瘤OD450培养基)/(OD450肿瘤-OD450培养基) x 100% 和 (OD450 GPC3-S-Fab + 肿瘤-OD450培养基)/(OD450肿瘤-OD450中等) x 100%。效应细胞为 NK 细胞。
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Representative Results
GPC3-S-Fab 净化
GPC3-S-Fab 从大肠杆菌中纯化, 经两步亲和纯化, 先用镍 NTA 琼脂糖, 其次 IgG-CH1 亲和纯化。两步亲和纯化后, GPC3-S-Fab 被纯化为同质性, 两链接近 1:1 (图 2A)。VH-CH1-CD16 VHH 和 cl 多肽的存在可以通过它们独特的 C 终端标记来识别, 反他的大约 25 kDa, 以及 VH-CH1-VHH 大约 38 kDa 的反旗 (图 2B)。在两步亲和纯化后, 可从某种培养物的1升中获得1.2 毫克蛋白质。为进一步表征纯化 GPC3-S-Fab, 进行了凝胶过滤。根据标准标记 (图 2C), GPC3-S-Fab 被确定为一个均匀单体的形式的 heterodimer 与分子大小约 63 kDa (图 2C)。
GPC3-S-Fab 绑定活动
为评价 GPC3-S-Fab 是否识别 GPC3-positive 细胞和 CD16-positive 细胞, 采用 GPC3-positive 肝癌细胞系 HepG2、Hep3B、Huh7、CHO/GPC3 和 GPC3-negative 肝癌细胞系进行流式细胞仪分析,MHCC-97H 和 CHO 细胞。GPC3-S-Fab 可以绑定到所有 GPC3-positive 单元格, 尽管绑定到 Hep3B (图 3B) 和 Huh7 单元格 (图 3C) 比 HepG2 (图3A) 和 CHO/GPC3 (图2F) 更弱。没有或最小绑定到 GPC3-negative MHCC-97H 和 CHO 细胞被观察 (图 3D, 3E)。GPC3-S-Fab 还可以绑定到 CD16-positive 单元格, NK92/CD16 单元格 (图 3G)。这些结果与以前使用其他 anti-GPC3 抗体30的结果一致, 表明 GPC3-S-Fab 可以专门约束 GPC3-positive 细胞系和 CD16-positive 细胞。
为评价 GPC3-S-Fab 的细胞毒性, 用不同浓度的 GPC3-S-Fab 的新鲜孤立 NK 细胞培养肿瘤细胞。没有 NK 细胞, GPC3-S-Fab 对肿瘤细胞没有细胞毒性, 不管 GPC3 表达状态 (图 4)。在 NK 细胞存在的情况下, GPC3-S-Fab 以剂量依赖性方式对 HepG2、Hep3B 和 Huh7 细胞产生强烈的细胞毒性, 但对 GPC3-negative MHCC-97H 细胞没有影响 (图 4), 表明 GPC3-S-Fab 的细胞毒性取决于肿瘤细胞表面的 GPC3 表达。
图1。GPC3-S-Fab 的构造
GPC3-S-Fab的细菌表达结构。这些构造包含一个政局信号序列, 一个人性化的 anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (重链), 或一个 "光链"。为便于蛋白质检测和纯化, 在 C 终点添加了标志标签或 His8 标记。(B) 共同表达后的 GPC3-S-Fab 图。
图2。GPC3-S-Fab 纯化大肠杆菌.
(A) 左面板, 经过镍-NTA 亲和层析;右面板, 后 anti-IgG-CH1 亲和层析;M, 分子量阶梯;考马斯蓝染色。(B) 左面板, 经过镍 NTA 亲和层析;右面板, 后 anti-IgG-CH1 亲和层析;M, 分子量阶梯;西方印迹。(C) GPC3-S-Fab 的凝胶过滤分析。顶部面板, 标准标记;底部面板, GPC3-S-Fab。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。GPC3-S-Fab 识别 GPC3 阳性细胞和 CD16-positive 细胞。
HepG2 (A)、Hep3B (B)、Huh7 (C)、MHCC-97H (D)、CHO (E)、CHO/GPC3 (F) 和 NK92/CD16 (G) 细胞的流式细胞术分析是按照议定书的规定进行的。红色线: 仅肿瘤细胞;绿线: 同种控制, 肿瘤细胞 + 人 IgG1 + 抗人 IgG (H + L)-488;蓝线: 肿瘤细胞 + GPC3-S-Fab + 抗人 IgG (H + L)-488。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。GPC3-S-Fab 促进细胞 GPC3-positive 癌细胞的死亡。
根据 HepG2 (A)、Hep3B (B)、Huh7 (C) 和 MHCC-97H (D) 的协议, 对剂量依赖性细胞毒性测定进行了说明。GPC3-S-Fab 的浓度从0.0045 µg/毫升到30µg/毫升。数据是 triplicates 的平均值,误差条表示标准偏差。实心圆, 只 GPC3-S-Fab;实心正方形,GPC3-S-Fab+ nk, nk 细胞 (每井 5万) 和靶细胞 (5000 每井)。这些混合物在细胞毒性测量前孵化72小时。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这项研究中, 我们提出了一个新的格式 bsAbs, GPC3-S-Fab, 它可以招募 NK 细胞靶向 GPC3 阳性肿瘤细胞。s-工厂是基于自然的晶圆格式, 添加一个 anti-CD16 VHH11,12。与含 Fc 区的 bsAbs 相比, GPC3-S-Fab 可以很容易地在细菌 periplasm 中产生。
利用该协议中描述的表达式和纯化策略, 得到了大量的可溶性和功能 GPC3-S-Fab。为便于周质表达, 政局在 N 终点添加了信号序列, 直接分泌到大肠杆菌的 periplasm17。与细胞质相比, 胞质和外层膜之间周质空间中的氧化环境越多, 蛋白质的折叠和组装就有许多重要的蛋白质, 从而促进了矫正褶皱和重组蛋白的溶解度16。然而, 蛋白质折叠和出口到大肠杆菌的 periplasm 的机器容量有限。高表达重组蛋白往往导致不溶性产品的积累在 periplasm16。为了避免蛋白质在短时间内的高表达, 在本议定书中采用了低 IPTG (0.2 毫米) 和低温 (16 °c) 的营养培养基, 以避免不溶蛋白的积累。本研究从1升培养基中提取出1.2 毫克蛋白质, 比以前的工作12提高了至少2倍的产量。
为了避免蛋白质降解, 所有含有 GPC3-S-Fab 的分数应保持在冰上。用他的标记在 NTA 的 C 末端, 镍-琼脂糖被用于纯化。然而, 单一的镍-NTA 琼脂糖纯化不足以去除不需要的蛋白质, 如未配对的 CL 蛋白。为了纯化均匀 heterodimeric GPC3-S-Fab, 采用了 anti-IgG-CH1 亲和纯化的第二步。纯化后的蛋白质纯度高, 两个多肽接近 1:1 (图 2A-2B)。
凝胶过滤层析可以根据分子大小和形状确定蛋白质的分子量;分析纯度的程度;确定纯化蛋白是否为单体、二聚体, 或由骨料15组成。通过凝胶过滤层析, GPC3-S-Fab 被确定为大约 63 kDa 的分子大小, 这是以单体的形式与 heterodimerization GPC3-S-Fab (图 2C)。
流式细胞术可以确定抗体是否能将其抗原与传统的西方印迹和 ELISA 相结合, 只检测抗原抗体结合反应。通过流式细胞仪分析, GPC3-S-Fab 识别细胞膜上的 GPC3, 提示 GPC3-Fab 基团功能。在进行流式细胞术分析时, 在添加抗体后, 将所有步骤保持在冰上或4摄氏度是至关重要的。当抗体与细胞表面抗原结合时, 抗体抗原复合体将开始内化。通过保持它的冷, 内部化过程大大减慢。
采用淋巴细胞分离培养基, 用离心法高效分离人外周血 PBMCs 和 NK 细胞, 其次为磁性活化细胞分选策略。当 nk 细胞与靶细胞 (肿瘤细胞) 的比值为10:1 时, GPC3-S-Fab 对 GPC3 阳性细胞有较强的细胞毒性, nk 细胞与靶细胞的比值可从50:1 到5:1 不等。
总之, GPC3-S-Fab, 可以在微生物表达系统中产生, 提供了一个新的途径, 以创建功能型 bsAbs 抗肿瘤。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了广东省 (2016A050503028) 研究 & 开发计划的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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