Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre un bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Purificata GPC3-S-Fab ha potente citotossicità contro le cellule di cancro del fegato positivo GPC3.
Abstract
Questo protocollo descrive la costruzione e gli studi funzionali di un bispecifico (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs in grado di riconoscere due epitopi diversi attraverso le due armi diverse. bsAbs sono stati attivamente studiati per la loro capacità di reclutare direttamente le cellule immunitarie per uccidere le cellule del tumore. Attualmente, la maggior parte dei bsAbs è prodotte in forma di proteine ricombinanti, come Fc-contenenti bsAbs o come più piccolo bsAb derivati senza regione Fc. In questo studio, è stato progettato GPC3-S-Fab, un anticorpo frammento (Fab) base bispecifico, collegando il Fab dell'anticorpo anti-GPC3 GC33 con un anticorpo anti-CD16 di singolo dominio. Il GPC3-S-Fab può essere espressa in Escherichia coli e purificato da due cromatografie di affinità. Purificata GPC3-S-Fab in particolare può associare a e uccidere le cellule di cancro del fegato positivo GPC3 reclutando cellule natural killer, suggerendo una potenziale applicazione di GPC3-S-Fab nella terapia del cancro del fegato.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali sono ora ampiamente utilizzati per cancro trattamento1. Grazie alla flessibilità degli anticorpi, vari formati basati su anticorpi sono stati esplorati attivamente. Rispetto agli anticorpi monoclonali, bsAbs hanno due moduli di associazione differenti dell'antigene, consentendo loro di riconoscere due bersagli contemporaneamente e in modo efficiente innescano il reclutamento di cellule immunitarie effettrici per colpire e uccidere le cellule di tumore2.
Formati attuali bsAb ricombinante possono essere generalmente assegnati a due classi: Fc-contenente bsAbs e bsAbs senza una regione Fc. Rispetto ai formati contenenti Fc che sono prodotti principalmente in cellule di mammifero, bsAbs senza una regione Fc hanno i vantaggi di più piccole dimensioni, sono più facilmente prodotti in sistemi di espressione del microorganismo e può penetrare tessuti del tumore in modo più efficiente 3.
bsAbs senza una regione Fc sono formate comunemente collegando moiety singola associazione, ad esempio frammenti di catena singola variabile (scFvs) o Fabs3. Senza i domini stabilizzanti, bsAbs basato su frammenti di scFv spesso hanno compromesso la stabilità termica, bassa solubilità o un potenziale aumento di aggregazione4,5. Al contrario, basati su Fab bsAbs sono più stabili a causa l'eterodimerizzazione del CH1 e CL in nativo frazione Fab4,6.
Dominio variabile da anticorpi solo pesante-catena (VOX, noto anche come anticorpi di singolo dominio) sono il frammento attivo antigene-legante di catena pesante naturale anticorpi7. VOX ha le caratteristiche di alta affinità, specificità del convenzionale IgGs8, bassa immunogenicità e alti rendimenti in espressione batterica9. Rispetto ai frammenti di Fv, Vox hanno maggiore stabilità termica10. Rispetto ai Fab moiety, Vox hanno dimensioni inferiori a causa della mancanza di CH1 e CL. Così, S-Fab, il formato di bsAb ottenuto collegando il favoloso con un anticorpo di singolo dominio, inquinamenti, è stato progettato e studiato per suoi effetti anti-tumorali11,12.
In questo studio, la costruzione di GPC3-S-Fab collegando il Fab di hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 è stata descritta. Il GPC3-S-Fab può essere prodotto in modo efficiente dall'espressione periplasmica in Escherichia coli (Escherichia coli). Gli studi funzionali di GPC3-S-Fab ha suggerito che GPC3-S-Fab è una strategia promettente per la terapia del cancro del fegato. Così, i vantaggi di GPC3-S-Fab su tecniche alternative con riferimenti applicabili agli studi precedenti includono facile produzione e purificazione e bsAbs più stabile.
Sistemi di espressione dei mammiferi e sistemi di espressione procariotici sono stati utilizzati per esprimere vari formati di BsAbs. Contrariamente ai sistemi di espressione dei mammiferi, e. coli-sistemi di espressione della proteina di base hanno molti vantaggi, tra cui alti rendimenti, basso costi e risparmio di lavoro, la facilità di manipolazioni genetiche e di trasformazione ad alta efficienza15. Per bsAbs espressione in e. coli, ci sono due strategie di base: espressione nel citoplasma ed espressione nel Periplasma tra il citoplasma e membrane cellulari esterno15. Rispetto per l'ambiente riducente di citoplasma, il Periplasma è un ambiente, che promuove il corretto ripiegamento più ossidanti e la co-espressione di proteine16. Piegatura corretta svolge un ruolo chiave nella generazione di solubilità, stabilità e funzione di bsAbs. Di conseguenza, un pelB di sequenza segnale è stato aggiunto al N-terminale della S-Fab per dirigere la secrezione per il Periplasma di e. coli17. Per garantire la corretta pieghevole, solubilità, stabilità termica e stabilità conformazionale, riducendo la complessità e la dimensione di un anticorpo è frequentemente impiegato16. Il formato S-Fab è costituito da un Fab e uno VHH, che si esprime molto bene in sistemi batterici probabilmente dovuto la struttura semplice e di piccole dimensioni.
GPC3 è stato scelto in questo formato di anticorpo anticorpo GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) è un membro della famiglia di proteoglycan solfato (HS) di eparina che è ancorata alla superficie delle cellule attraverso glicosilfosfatidilinositolo (GPI)18. GPC3 è iperespresso nel 70% dei casi di carcinoma (HCC) epatocellulare, che rappresentano la maggior parte dei tumori del fegato19,20,21,22. Poiché GPC3 è raramente espresse in tessuti normali, GPC3 è stato proposto come un potenziale bersaglio per HCC. Più anticorpi monoclonali di topo sono state prodotte contro GPC3. Tuttavia, solo GC33 ha esibito un'attività anti-tumorale limitata 22, e non è riuscito a mostrare l'efficacia clinica in pazienti. In questo studio, GPC3-S-Fab è stato indicato per essere in grado di reclutare le cellule NK per uccidere GPC3 tumore cellule14.
Per reclutare le cellule NK, anti-CD16 VHH è stato utilizzato. CD16a è un recettore a bassa affinità IgG, espresso principalmente sulle cellule natural killer (NK), macrofagi, monociti e alcuni sottotipi di cellule T. È coinvolto nella citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) di cellule NK23. Cellule NK umane possono essere suddivise in due tipi, CD56 - CD16 + e CD56 + CD16-. Contrariamente alle cellule NK CD56 + CD16−, CD56-cellule CD16 + NK possono rilasciare livelli più elevati di perforina e granzyme B e presentano quindi una forte citotossicità24. Cellule di Kupffer (KCs), esprimendo CD16a, sono i macrofagi residenti nel fegato. Cellule di Kupffer giocano un ruolo importante nella soppressione di cancro del fegato25. Quindi, bsAbs CD16a di targeting può essere una strategia più promettente rispetto coinvolgente cellule T contro il cancro del fegato.
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Protocol
Tutte le procedure, compresa la raccolta di sangue umano sono state approvate dal comitato etico di Sun Yat-Sen University.
1. strategia di progettazione GPC3-S-Fab
- Progettare GPC3-S-Fab collegando un Fab di anti-GPC3 (umanizzato GC3313) con un anti-CD16 VHH14 (Figura 1).
- Sintetizzare e clonare il VH-CH1-CD16-VHH e VL-CL nei vettori pET26b e pET21a come precedentemente segnalati12.
2. trasformazione e cultura
- Aggiungere 100 ng di pET26b contenenti VH-CH1-CD16 (Figura 1A) e 100 ng di pET21a contenente VL-CL (Figura 1A) in 100 µ l di competenti BL21 (DE3) cellule. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min. Incubare a bagnomaria a 42 ° C per 45-90 s, trasferimento e incubare in ghiaccio per 3-5 min.
- Aggiungere 500 µ l di terreno di brodo (LB) di Lisogenesi in una provetta contenente BL21 (DE3) cellule e poi incubare a 37 ° C, 150 giri/min per 45-60 min sviluppa 100 µ l di BL21 (DE3) cellule su LB-agar piastre contenenti 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e poi incubare a 37 ° C per 12-16 ore.
- Preparare Lisogenesi supporto di brodo (LB): tryptone wt/vol 1%, 0,5% wt/vol di Estratto di lievito, 1% wt/vol NaCl.
- Inoculare le cellule da una singola Colonia in 5 mL di terreno di brodo super (SB) contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillinae coltura a 37 ° C, 220 giri/min, durante la notte. Quindi, inoculare 1 mL di coltura in 100 mL di mezzo di SB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C, 220 giri/min per 4 h. Quindi, trasferire 10 mL della cultura in 1 L di terreno di SB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C, 220 giri/min.
- Preparare il supporto di brodo super: 3,2% wt/vol tryptone, Estratto di lievito 2% wt/vol, 0,5% wt/vol NaCl.
- Quando raggiunge il OD600 0.6 - 0.8, aggiungere isopropilico-b-D-thio-galattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 giri/min per 36-48 h per espressione periplasmica.
3. GPC3-S-Fab periplasmico purificazione
- Preparazione di frazione periplasmico
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g, 4 ° C per 30 min, eliminare il terreno e pesano le cellule.
- Risospendere le cellule accuratamente in 4 mL di soluzione di saccarosio ghiacciata (20 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 25% (wt/vol) di saccarosio e 1 mM di EDTA) per grammo di cellule e incubare in ghiaccio per 15 min.
- Centrifugare a 8.500 x g (piano tavolo centrifuga, rotore ad angolo fisso), 4 ° C per 20 min. eliminare il surnatante (la frazione di saccarosio) e salvarlo sul ghiaccio.
- Risospendere il pellet in un mix di 5mm ghiacciata di MgCl2 e 1 mM PMSF (4 mL per grammo di cellule). Aggiungere 40 µ l dello stock di lisozima (15 mg/mL) per grammo e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 8.500 x g (centrifuga piano tavolo, angolo rotore fissata), 4 ° C per 20 min. trasferimento il surnatante (la frazione periplasmico) e salvarlo sul ghiaccio.
- Combinare la frazione di saccarosio e la frazione periplasmico e centrifugare a 30.000 x g, 4 ° C per 30 min. eliminare il surnatante e salvarlo in una provetta conica da 50 mL su ghiaccio.
- Purificazione di affinità NI-NTA
- Risospendere 1 mL di Ni-NTA agarosio mescolando accuratamente per ottenere una sospensione omogenea, rimuovere 1 mL di agarosio Ni-NTA a un tubo conico di fresco da 15 mL e aggiungere 10 buffer di equilibrazione volumi (CV) colonna (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 1 M di NaCl) per equilibrare.
- Centrifugare a 400 x g per 5 min e rimuovere il surnatante con attenzione. Quindi, aggiungere l'agarosio Ni-NTA nella provetta 50 mL contenente la frazione di saccarosio e la frazione periplasmico. Roccia a 4 ° C per 2 h.
- Centrifugare la miscela a x 400 g, 4 ° C per 5 min. rimuovere con attenzione il sovranatante in un'altra provetta ghiacciata fresca come la frazione non legata. Trasferire l'agarosio Ni-NTA in una colonna di gravità.
- Aggiungere 10 CV del tampone di lavaggio (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 1 M di NaCl; 20 mM, 30 mM o 40 mM di imidazolo) per la colonna e raccogliere il elute come la frazione di lavaggio.
Nota: Queste soluzioni devono essere aggiunto al fine di aumentare le concentrazioni di imidazolo. - Aggiungere 3 CV di eluizione buffer (25 mM di Tris-HCl, pH 7.5; 300 mM di NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 o 400 mM di imidazolo) alla colonna e raccogliere il elute come frazione di eluizione 1, 2, 3 e 4.
Nota: Queste soluzioni devono essere aggiunto al fine di aumentare le concentrazioni di imidazolo. - Dialisi le frazioni eluite in 2 L di PBS (137 millimetri di NaCl, 2,7 millimetri di KCl, 10 millimetri di Na2HPO4, 2mm di KH2PO4, pH 7.4) utilizzando tubi di dialisi (12,4 kDa) a 4 ° C per 2 h. verificare la presenza di GPC3-S-Fab 12% SDS-PAGE e quindi di Colorazione blu di Coomassie.
- Purificazione di affinità di igG-CH1
- Trasferire 1 mL di resina di affinità di IgG-CH1 in una provetta conica da 50 mL e lavare le perle con PBS in primo luogo. Quindi, aggiungere la soluzione dializzata contenente GPC3-S-Fab dopo passo 3.2.6. Roccia a 4 ° C per 2 h.
- Centrifuga a 400 x g per 5 min, 4 ° C. Con attenzione rimuovere il surnatante in un'altra provetta ghiacciata fresca e trasferire la resina a una colonna di gravità.
- Aggiungere 10 CV di lavaggio buffer (PBS) alla colonna e raccogliere l'eluizione come la frazione di lavaggio.
- Preparare i tubi di raccolta aggiungendo 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL di ciascuna frazione eluite per mL). Eluire con tampone di eluizione 3 CV (0,1 M di glicina-HCl, pH 2,7) e raccogliere la frazione eluita; Ripetere 3 volte.
- Dialisi le frazioni eluite in 2 L di PBS utilizzando tubi di dialisi (12,4 kDa) a 4 ° C per 2 h. Ripetere due volte.
- Determinare la concentrazione di proteina di ultramicrospectrophotometer (coefficiente di estinzione molare: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).
4. SDS-PAGE e Western blotting analisi
- Prendere un 10 µ l del campione in 5 x buffer di caricamento SDS e mescolare bene. Far bollire la miscela di proteine a 100 ° C per 5 min.
- Preparare il tampone di caricamento SDS: 5x: 250 mM di Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromofenolo, glicerolo vol/vol di 50%, 5% vol/vol beta-mercaptoetanolo.
- Preparare un gel di SDS-PAGE con un gel di caricamento (5%) e gel di separazione (12%) come descritto in precedenza26,27,28.
- Caricare 10 µ l della miscela proteica bollito e indicatore di proteina ed eseguire la SDS-PAGE.
- Macchiare il gel agitando per 20 min con soluzione di blu brillante Coomassie e quindi eseguire decolorante.
- Per macchiarsi occidentale, dopo aver trasferito ad una membrana PVDF, bloccare la membrana con TBST (20 mM di Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol schiumare il latte per 1 h a temperatura ambiente agitando.
- Incubare la membrana con gli anticorpi primari (anti-sua o Anti-Flag) diluito 1:2,000 in TBST + 5% latte scremato per 1 h.
- Lavare con TBST per 5 min a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte.
- Incubare la membrana in 1:2,000 di anticorpo secondario (HRP-collegata di anticorpo anti-topo Fc) diluito in TBST + 5% latte scremato per 1 h.
- Lavare con TBST per 5 min a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte.
- Aggiungere 1 mL di substrato HPR per ogni film, sviluppare e prendere le immagini.
5. gel filtrazione analisi
- Utilizzare la seguente colonna: volume di colonna di 24 mL; Buffer di equilibrazione di PBS pH 7.4; Portata di 0,5 mL/min a camera temperato; Volume di campione di 200 µ l.
- Utilizzare il seguente volume di proteine e concentrazione: 500 µ l di 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min e prendere 200 µ l per caricare.
- Per la proteina marker volume e concentrazione, prendere 100 µ l del citocromo C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µ l di anidrasi carbonica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µ l di albumina (10 mg/mL, 66 kDa) e 200 µ l di alcol deidrogenasi (5 mg/mL, 150 kDa) in una provetta. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min e prendere 200 µ l per caricare.
- Prima di ogni esecuzione, lavare con almeno 2 CV di acqua distillata a una portata di 0,5 mL/min.
- Equilibrare la colonna con almeno 2 CV del buffer di equilibrazione (PBS, pH 7.4) ad una portata di 0,5 mL/min.
- Automaticamente iniettare il campione a 0,5 mL/min per caricare il campione.
- Eluire con buffer di equilibrazione a 0,5 mL/min e rilevare a 280 e 215 nm.
6. analisi di citometria a flusso di
- Cultura la HepG2 Hep3B (GPC3 positivo), (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivo) e le cellule MHCC - 97H (GPC3 negativo) in piatti di plastica 100 x 20 mm contenente mezzo DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- Cultura CHO (GPC3 negativo) e cellule CHO/GPC3 che harboring il full-length cDNA umano GPC3 (GPC3 positivo) in piatti di plastica 100 x 20 mm contenente medium RPMI 1640 con 10% FBS, penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- Coltura del NK92/CD16 che harboring il full-length cDNA umano CD16 (CD16 positivo) in bottiglia di2 25cm contenente medium RPMI 1640 con 10% FBS, penicillina (100 µ g/mL) e streptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- Quando le cellule sono 70-90% confluenti, eliminare il terreno e lavare le cellule con 2 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% e incubare a 37 ° C per 2-3 minuti (o fino a quando le cellule iniziano a staccare dalla superficie). Aggiungere 1 mL di mezzo di sviluppo completo per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù.
- Contare i numeri di cellulare utilizzando un emocitometro Neubauer e rilevare l'attuabilità delle cellule da Trypan Blue.
- Raccogliere 3 x 106 cellule per ogni linea cellulare. Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA per risospendere le cellule. Centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, Ripeti due volte.
- Aggiungere 0,3 mL di PBS + 0,2% di BSA per risospendere le cellule e trasferire 100 µ l (circa 1 milione) in ogni provetta da 5 mL di turno-fondo in polistirolo.
Nota: Si prega di assicurarsi di tutte le misure da qui per i tubi dovrebbero essere tenute a fredde su ghiaccio. Quando l'anticorpo è vincolante per l'antigene di superficie delle cellule, il complesso inizierà a interiorizzare. Da mantenerlo freddo, il processo è rallentato in modo significativo. - Aggiungere 10 µ l di anticorpi primari (GPC3-S-Fab o umana IgG1, concentrazione finale 5 µ g/mL) ad ogni tubo e incubare in ghiaccio per 1 h.
- Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA a lavare e centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, ripetere tre volte.
- Risospendere in 100 µ l di PBS + 0,2% di BSA e quindi aggiungere 0,5 µ l di anticorpo secondario (anti-umano IgG(H+L)-488, finale concentrazione 10 µ g/mL) e incubare in ghiaccio per 1 h. Nota: da questo passaggio, si prega di tenere le cellule dalla luce.
- Aggiungere 1 mL di PBS + 0,2% di BSA a lavare e centrifuga a 200 x g, 4 ° C per 5 min, ripetere tre volte.
- Analizzare le cellule da citometro a flusso secondo il protocollo standard29. Acquisire le cellule con un laser di 488 nm per l'eccitazione.
7. citotossici saggi
- Preparare le cellule del tumore.
- Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H e CHO linee cellulari come descritto ai punti 6.1-6.5.
- Diluire le cellule a 0,5/ml di5× 10 e 100 µ l cellule (5.000 per pozzetto) su piastre a 96 pozzetti della lastra. 6-8 h per consentire alle cellule di collegare la cultura.
- Preparare cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC).
- Diluire il sangue fresco preparato con un volume uguale di PBS in una provetta conica da 50 mL. Ad esempio, diluire 10 mL di sangue con 10 mL di PBS.
- Prendere 15 mL di terreno di separazione dei linfociti in un tubo conico di fresca 50 mL. Trasferire lentamente il sangue diluito sul supporto del linfocita separazione lungo il lato del tubo.
Nota: Tenere il tubo verticale. Non rompere la superficie del mezzo di separazione del linfocita. - Centrifugare a 400 x g per 35 min a temperatura ambiente con il freno fuori.
- Lentamente rimuovere lo strato superiore del plasma e prendere il livello di sangue bianco contenente PBMCs presso l'interfaccia media di separazione del plasma del linfocita.
- Diluire il PBMCs con un doppio volume di PBS + 2% FBS. Centrifugare a 400 x g per 5 min.
- Lavare le cellule due volte con PBS + 2% FBS. Centrifuga a 400 x g per 5 min, contare il numero di cellulare come descritto al punto 6.5.
- Preparare le cellule NK.
- Preparare la sospensione di PBMCs ad una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL in PBS + 2% FBS e posto loro in una provetta da 5 mL di turno-fondo in polistirolo.
- Aggiungere delle cellule NK umane arricchimento Cocktail a 50 µ l/mL delle cellule. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Risospendere le particelle magnetiche dalla cellula NK kit di arricchimento e mescolare bene per garantire in modo uniforme sono sospese pipettando su e giù con forza più di 5 volte. Trasferire il sedimento particelle magnetiche a 100 µ l/mL sospensione delle cellule. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Portare la sospensione cellulare fino a un volume totale di 2,5 mL aggiungendo PBS + 2% FBS. Mescolare le cellule nel tubo pipettando delicatamente su e giù per 2 - 3 volte. Inserire il tubo (senza cap) il magnete. Lasciate che i branelli magnetici stabilirsi per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il magnete. In un movimento continuo, capovolgere la provetta, versando fuori la sospensione cellulare arricchito in un nuovo tubo.
- Contare i numeri di cellulare come descritto al punto 6.5.
- Impostare la reazione citotossica.
- Diluire le cellule NK a 5 × 105 cellule/mL utilizzando il terreno di coltura corrispondente. Aggiungere 100 µ l della sospensione di cellule NK alle cellule del tumore placcate su una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 10 µ l di GPC3-S-Fab a differenti concentrazioni, con la più alta dose ad una concentrazione finale di 30 µ g/mL, 3 volte diluizione, 9 punti (tre repliche).
- Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 72 h.
- Dopo 72 h di incubazione, rimuovere il mezzo e aggiungere 100 µ l di terreno DMEM contenente 10 µ l di reagente CCK8 in ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e poi incubare a 37 ° C.
- Leggere la piastra a 450 nm a 1, 2, 3 e 4 h dopo l'aggiunta del reagente di CCK8.
- Analizzare i dati. Calcolare il tasso di sopravvivenza come (OD450 GPC3-S-Fab + effettrici + tumore - OD450 medio) / (OD450 tumore - OD450 medio) × 100% e (OD450 GPC3-S-Fab + tumore - OD450 medio) / (OD450 tumore - OD450 medio) × 100%. Le cellule effettrici sono cellule NK.
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Representative Results
Purificazione di GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab è stato purificato da e. coli mediante una purificazione di affinità in due fasi, prima con Ni-NTA-agarosio, seguita da purificazione di affinità di IgG-CH1. Dopo la purificazione di affinità in due fasi, GPC3-S-Fab è stato purificato per omogeneità con le due catene vicino a 1:1 (Figura 2A). La presenza di polipeptidi sia VHH VH-CH1-CD16 e VL-CL possa essere identificata dal loro tag distinti del C-terminale, anti-sua per il VL-CL circa 25 kDa e Anti-Flag per il VH-CH1-VHH circa 38 kDa (Figura 2B). Dopo la purificazione di affinità in due fasi, ~1.2 mg di proteina sono ottenibili da 1 L di cultura SB. Per caratterizzare ulteriormente purificata GPC3-S-Fab, gel filtrazione è stato effettuato. Basato su marcatori standard (Figura 2), GPC3-S-Fab è stato identificato come un monomero omogeneo sotto forma di un eterodimero con un formato molecolare di circa 63 kDa (Figura 2).
Attività obbligatorie GPC3-S-Fab
Per valutare se il GPC3-S-Fab riconosce le cellule GPC3-positive e cellule CD16-positive, analisi di citometria a flusso è stata condotta utilizzando le linee cellulari di cancro del fegato GPC3-positivi HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 e la linea di cellule di cancro del fegato GPC3-negativo, MHCC - 97H e cellule CHO. GPC3-S-Fab potrebbe associare a tutte le celle GPC3-positiva, anche se con più debole associazione a Hep3B (Figura 3B) e cellule Huh7 (Figura 3) rispetto a HepG2 (Figura 3A) e CHO/GPC3 (Figura 2F). No o minimo che lega alle cellule GPC3-negativo MHCC - 97H e CHO è stato osservato (Figura 3D, 3E). Il GPC3-S-Fab anche potuto effettuare il binding le cellule CD16-positive, le cellule NK92/CD16 (Figura 3). Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti usando altri anti-GPC3 anticorpi30, suggerendo che GPC3-S-Fab può legare specificamente linee cellulari GPC3-positive e cellule CD16-positive.
Per valutare la citotossicità di GPC3-S-Fab, le cellule del tumore sono state incubate con fresco isolate cellule NK con differenti concentrazioni di GPC3-S-Fab. Senza le cellule NK, GPC3-S-Fab ha avuto nessuna citotossicità contro le cellule del tumore indipendentemente dallo stato di espressione GPC3 (Figura 4). In presenza di cellule NK, GPC3-S-Fab innescato forti citotossicità contro le cellule HepG2, Hep3B e Huh7 in maniera dose-dipendente ma ha mostrato alcun effetto sulle cellule GPC3-negativo MHCC - 97 H (Figura 4), suggerendo che la citotossicità di GPC3-S-Fab dipende GPC3 espressione sulla superficie delle cellule del tumore.
Figura 1. Costrutti di GPC3-S-Fab
(A) l'espressione batterica costrutti di GPC3-S-Fab. I costrutti contengono una sequenza segnale pelB , un umanizzato anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (catena pesante), o un VL-CL (catena leggera). Per facilitare la rilevazione di proteine e purificazione, un tag di bandiera o un His8 è stato aggiunto al C-terminale. (B) diagramma di GPC3-S-Fab dopo co-espressione.
Nella figura 2. GPC3-S-Fab purificazione da e. coli.
Pannello di sinistra (A), dopo la cromatografia di affinità Ni-NTA; Pannello di destra, dopo la cromatografia di affinità anti-IgG-CH1; M, peso molecolare scaletta; Colorazione blu di Coomassie. Pannello di sinistra (B), dopo la cromatografia di affinità Ni-NTA; Pannello di destra, dopo la cromatografia di affinità anti-IgG-CH1; M, peso molecolare scaletta; Western-blot. (C) analisi di filtrazione di GPC3-S-Fab del Gel. Pannello superiore, marcatori standard; pannello inferiore, GPC3-S-Fab. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. GPC3-S-Fab riconosce le cellule positive GPC3 e cellule CD16-positive.
Analisi di flusso cytometry delle HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), (E), CHO CHO/GPC3 (F) e le cellule NK92/CD16 (G) è stata eseguita come descritto nel protocollo. Linea rossa: le cellule del tumore solo; Linea verde: isotipo controllo, cellula tumorale umana IgG1 + + anti-umano IgG(H+L)-488; linea blu: cellula del tumore + GPC3-S-Fab + anti-IgG (H + L)-488 umane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. GPC3-S-Fab promuove la morte delle cellule delle cellule di cancro GPC3-positive.
Analisi di citotossicità dose-dipendente sono state eseguite come descritto nel protocollo per HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C) e MHCC - 97 H (D). Le concentrazioni di GPC3-S-Fab erano da 0,0045 µ g/mL a 30 µ g/mL. I dati sono la media dei triplici copie con le barre di errore che rappresenta la deviazione standard. Cerchio pieno, solo GPC3-S-Fab; quadrato a tinta unita, GPC3-S-Fab+ NK, cellule NK (50.000 per pozzetto) e cellule bersaglio (5.000 per pozzetto). Le miscele sono state incubate per 72 h prima misurazione di citotossicità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, presentiamo una strategia per costruire un nuovo formato di bsAbs, GPC3-S-Fab, che possono reclutare cellule NK mirare alle cellule del tumore positivo GPC3. La S-Fab è basato sul Fab naturale formato con l'aggiunta di un anti-CD16 VHH11,12. Confrontato con la regione di Fc contenente bsAbs, GPC3-S-Fab possono essere prodotte facilmente nel Periplasma dei batteri su larga scala.
Utilizzando la strategia di espressione e purificazione descritta nel protocollo, abbiamo ottenuto un solubile e funzionale GPC3-S-Fab in grandi quantità. Per facilitare l'espressione periplasmica, un pelB di sequenza segnale è stato aggiunto al N-terminale per dirigere la secrezione per il Periplasma di e. coli17. In contrasto con il citoplasma, l'ambiente più ossidante nello spazio periplasmico tra le membrane citoplasmiche ed esterne è dotato di un numero di proteine importanti per il protein folding e assemblaggio e promuove così la correzione di piegatura e solubilità delle proteine ricombinanti16. Tuttavia, i macchinari per la piegatura della proteina e di esportazione verso il Periplasma in e. coli ha una capacità limitata. Alta espressione di proteine ricombinanti spesso provoca l'accumulazione del prodotto insolubile nel Periplasma16. Per evitare l'alta espressione di proteine in un breve periodo di tempo, IPTG bassa (0,2 mM) e bassa temperatura (16 ° C) in mezzo nutriente sono state applicate nel presente protocollo per evitare l'accumulo di proteina insolubile. In questo studio, ~1.2 mg di proteina è stata ottenuta da 1 L del mezzo, del miglioramento dei rendimenti almeno 2 volte rispetto a precedenti opere12.
Per evitare la degradazione della proteina, tutte le frazioni contenenti GPC3-S-Fab in vari passi dovrebbero essere tenute su ghiaccio. Con la sua etichetta al C-terminale di VL-CL, Ni-NTA-agarosio è stato usato per la purificazione. Tuttavia, singole Ni-NTA-agarosio purificazione non è sufficiente a rimuovere le proteine indesiderate, come la proteina spaiata VL-CL. Per purificare l'omogenea heterodimeric GPC3-S-Fab, il secondo passo, purificazione di affinità anti-IgG-CH1, è stato applicato. La proteina purificata aveva elevata purezza e due polipeptidi vicino a 1:1 (Figura 2A-2B).
Cromatografia di gel filtrazione può determinare i pesi molecolari delle proteine basati sulle loro dimensioni molecolari e forme; analizzare il grado di purezza; e determinare se la proteina purificata è un monomero, dimero, o composte da aggregati15. Da cromatografia di gel filtrazione, GPC3-S-Fab è stato identificato con la dimensione molecolare prevista di circa 63 kDa, che è sotto forma di un monomero con eterodimerizzazione di GPC3-S-Fab (Figura 2).
Citometria a flusso può determinare se un anticorpo può legare suo antigene sulla membrana cellulare, rispetto ai tradizionali western-blot ed ELISA, che rilevano solo reazioni antigeni-anticorpi associazione. Dall'analisi di citometria a flusso, GPC3-S-Fab riconosciuto il GPC3 sulla membrana cellulare, suggerendo che la frazione GPC3-Fab era funzionale. Quando si esegue l'analisi di citometria a flusso, è fondamentale per mantenere tutti i passaggi su ghiaccio o a 4 ° C dopo l'aggiunta dell'anticorpo. Quando l'anticorpo si lega all'antigene di superficie delle cellule, il complesso antigene-anticorpo avvierà interiorizzazione. Da mantenerlo freddo, il processo di internalizzazione è rallentato in modo significativo.
PBMC e cellule NK sono state efficacemente isolate da sangue periferico umano mediante centrifugazione mediante separazione dei linfociti medio, seguita da magnetico attivato cella ordinamento strategie. GPC3-S-Fab ha mostrato citotossicità potente contro le cellule positive GPC3 quando il rapporto delle cellule NK alle cellule bersaglio (cellule tumorali) era di 10:1, ed il rapporto delle cellule NK alle cellule bersaglio potrebbe variare da 50: 1 a 5:1.
In sintesi, GPC3-S-Fab, che può essere prodotto in un sistema di espressione del microorganismo, offre una nuova strada per creare formati funzionale di bsAbs contro i tumori.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal R & D piano della provincia di Guangdong (Cina) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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