Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera en bispecific antikropp GPC3-S-Fab i Escherichia coli. Den renade GPC3-S-Fab har potent cytotoxicitet mot GPC3 positiva levercancer celler.
Abstract
Det här protokollet beskriver konstruktion och funktionella studier av en bispecific antikropp (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs kan känna igen två olika epitoper genom sina två olika vapen. bsAbs har aktivt undersökts för sin förmåga att rekrytera direkt immunceller för att döda tumörceller. För närvarande produceras majoriteten av bsAbs i form av rekombinanta proteiner, antingen som Fc-innehållande bsAbs eller mindre bsAb derivat utan regionen Fc. I denna studie ritades GPC3-S-Fab, en antikropp fragment (Fab) baserat bispecific antikropp, av länka Fab av anti-GPC3 antikropp GC33 med en anti-CD16 enda domän antikropp. GPC3-S-Fab kan vara uttryckt i Escherichia coli och renas genom två affinitet chromatographies. Renat GPC3-S-Fab kan specifikt binda till och döda GPC3 positiva levercancer celler genom rekrytering av naturliga mördarceller, vilket tyder på en potentiell tillämpning av GPC3-S-Fab i levercancer terapi.
Introduction
Monoklonala antikroppar används nu i stort sett för cancer behandling1. På grund av flexibiliteten av antikroppar, har olika antikroppsbaserade format varit aktivt utforskat. BsAbs jämfört med monoklonala antikroppar, och har två olika antigen bindande moduler, så att de kan känna igen två olika mål samtidigt och effektivt utlösa rekrytering av immun effektor celler att rikta och döda tumör celler2.
Nuvarande rekombinant bsAb format allmänhet kan tilldelas till två klasser: Fc-innehållande bsAbs och bsAbs utan ett Fc-regionen. Jämfört med Fc-innehållande format som främst produceras i däggdjursceller, bsAbs utan ett Fc-regionen har fördelarna med mindre storlekar, lättare produceras i mikroorganism uttryck system, och kan tränga igenom tumörvävnad effektivare 3.
bsAbs utan ett Fc-regionen bildas vanligen genom att länka individuella bindande delarna, såsom enda-kedjan variabel fragment (scFvs) eller fjäll3. Utan de stabiliserande domänerna, har bsAbs baserat på scFv fragment ofta komprometterat termisk stabilitet, låga löslighet eller en ökad potential för aggregering4,5. Fab-baserade bsAbs är det däremot mer stabil på grund av heterodimerization av CH1 och CL i native Fab biexponentiellt4,6.
Variabla domänen från heavy-kedja-bara antikroppar (VHHs, också benämnd som enda domän antikroppar) är den aktiva antigen-bindande fragmentet av naturliga tung kedja antikroppar7. VHHs har hög affinitet egenskaper, specificitet av konventionella IgG8, låg immunogenicitet och hög avkastning i bakteriell uttryck9. VHHs jämfört med Fv fragment, och har högre termisk stabilitet10. VHHs jämfört med Fab beståndsdelarna, och har mindre storlekar på grund av CH1 och CL. Således, S-Fab, bsAb formatet erhålls genom att länka Fab med en enda domän antikropp, VHH, ritades och studerade för dess anti-tumör effekt11,12.
I denna studie beskrevs byggandet av GPC3-S-Fab genom att länka Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 . GPC3-S-Fab kan produceras effektivt av periplasmic uttryck i Escherichia coli (E. coli). Funktionella studier av GPC3-S-Fab föreslog att GPC3-S-Fab är en lovande strategi för levercancer terapi. GPC3-S-Fab fördelar jämfört med alternativa tekniker med tillämpliga hänvisningar till tidigare studier inkluderar således lätt produktion, rening och stabilare bsAbs.
Däggdjur uttryck och prokaryota uttryck system har använts för att uttrycka olika format av BsAbs. Till skillnad från däggdjur uttryck system, E. coli-baserade protein uttryck system har många fördelar, bland annat hög avkastning, låg kostnad och arbetsbesparande, förenklar genetiska manipulationer, och hög förvandling effektivitet15. För bsAbs uttryck i E. coli, finns det två grundläggande strategier: uttryck i cytoplasman och uttryck i periplasm mellan cytoplasman och yttre cellmembran15. Periplasm jämfört med reducerande miljö av cytoplasman, och är en mer oxiderande miljö som främjar den rätta vikningen och samtidig uttryck för proteiner16. Rätt fällbara spelar en nyckelroll i löslighet, stabilitet och funktion generation av bsAbs. Därför lades en signal sekvens pelB till N-terminalen av S-Fab direkt utsöndring till periplasm av E. coli17. För att säkerställa anställda korrekt vikning, löslighet, termisk stabilitet och konfirmerande stabilitet, minska komplexiteten och storleken av en antikropp är ofta16. Formatet S-Fab består av en Fab och en VHH, som uttrycks mycket väl i bakteriell system sannolikt på grund av enkla struktur och liten storlek.
GPC3 valdes i detta GPC3-S-Fab bispecific antikropp format. Glypikan-3 (GPC3) är en medlem av familjen heparin sulfat (HS) proteoglykan som är förankrade till cellytan genom glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 är överuttryckt i 70% av Hepatocellulär cancer (HCC) fall, som står för majoriteten av lever cancer19,20,21,22. Eftersom GPC3 är sällan uttrycks i normala vävnader, har GPC3 föreslagits som ett potentiellt mål för HCC. Flera mus mAbs har producerats mot GPC3. Dock endast GC33 uppvisade begränsade antitumöraktivitet 22, och det lyckades uppvisar klinisk effekt hos patienter. I denna studie visades GPC3-S-Fab för att kunna rekrytera NK-celler för att döda GPC3 tumör celler14.
För att rekrytera NK-celler, användes anti-CD16 VHH. CD16a är en låg affinitet IgG receptor, uttryckte främst på vissa subtyper av T-celler, naturliga mördarceller (NK), makrofager och monocyter. Det är involverade i antikroppsberoende cell cytotoxicitet (ADCC) av NK celler23. Mänskliga NK celler kan delas in i två typer, CD56 - CD16 + och CD56 + CD16-. I motsats till CD56 + CD16− NK-celler, CD56-CD16 + NK-celler kan släppa högre nivåer av perforin och granzym B och därmed presentera en stark cytotoxicitet24. Kupffers celler (KCs), uttrycker CD16a, är bosatta makrofager i levern. Kupffers celler har en viktig roll i undertryckandet av levercancer25. BsAbs inriktning CD16a kan således vara en mer lovande strategi än att engagera T-celler mot levercancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden inklusive blodinsamling godkändes av Sun Yat-Sen University etikkommitté.
1. GPC3-S-Fab designstrategi
- Design GPC3-S-Fab genom att länka en Fab av anti-GPC3 (humaniserad GC3313) med en anti-CD16 VHH14 (figur 1).
- Syntetisera och klona den VH-CH1-CD16-VHH och VL-CL i de pET26b och pET21a vektorerna som tidigare rapporterade12.
2. omvandling och kultur
- Tillsätt 100 ng av pET26b som innehåller VH-CH1-CD16 (figur 1A) och 100 ng av pET21a som innehåller VL-CL (figur 1A) i 100 µL av behöriga BL21 (DE3) celler. Blanda väl och inkubera på is för 30 min. Inkubera i 42 ° C vattenbad för 45-90 s, överföring, och inkubera på is för 3-5 min.
- Tillsätt 500 µL av lysogeny buljong (LB) medium i en tub innehållande BL21 (DE3) celler och sedan Inkubera vid 37 ° C, 150 rpm för 45-60 min. sprida 100 µL av BL21 (DE3) celler på LB-agar plattor innehållande 50 µg/mL kanamycin och 100 µg/mL ampicillin , och sedan Inkubera vid 37 ° C i 12-16 h.
- Förbereda lysogeny buljong (LB) medium: 1% wt/vol trypton, 0,5% wt/vol jästextrakt, 1% wt/vol NaCl.
- Inokulera cellerna från en enda koloni i 5 mL super buljong (SB) medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och 100 µg/mL av ampicillinoch kultur vid 37 ° C, 220 rpm, över natten. Sedan Inokulera 1 mL av kultur i 100 mL SB medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och ampicillin och kultur vid 37 ° C, 220 rpm för 4 h 100 µg/mL. Sedan över 10 mL av kulturen till 1 L av SB medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och ampicillin och kultur vid 37 ° C, 220 rpm 100 µg/mL.
- Förbereda super buljong medium: 3,2% wt/vol trypton, 2% wt/vol jästextrakt, 0,5% wt/vol NaCl.
- När OD600 når 0,6 - lägga 0,8, isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,2 mM. Kultur på 16 ° C, 180 rpm för 36-48 h för periplasmic uttryck.
3. GPC3-S-Fab Periplasmic rening
- Periplasmic fraktion förberedelse
- Samla celler genom centrifugering vid 4000 x g, 4 ° C i 30 min, kassera medium och väga cellerna.
- Att resuspendera cellerna noggrant i 4 mL iskallt sackaroslösning (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25% (wt/vol) sackaros och 1 mM EDTA) per gram celler och inkubera på is för 15 min.
- Centrifugera 8.500 x g (bordsskiva centrifug, fast vinkel rotor), 4 ° C för 20 min. avlägsna supernatanten (andelen sackaros) och spara det på is.
- Återsuspendera pellets i en blandning av iskall 5 mM MgCl2 och 1 mM av PMSF (4 mL per gram celler). Tillsätt 40 µL lysozym beståndet (15 mg/mL) per gram och inkubera på is i 30 min.
- Centrifugera 8.500 x g (bordsskiva centrifug, fast vinkel rotor), 4 ° C i 20 min. Transfer supernatanten (den periplasmic fraktionen) och spara den på is.
- Kombinera sackaros fraktionen och periplasmic fraktion och centrifugera vid 30 000 x g, 4 ° C för 30 min. avlägsna supernatanten och spara det i en 50 mL konisk tub på is.
- Ni-NTA affinitet rening
- Återsuspendera 1 mL agaros som Ni-NTA genom att blanda grundligt för att uppnå en homogen suspension, avlägsna 1 mL av Ni-NTA agaros till ett färskt 15 mL koniska rör och Lägg 10 kolumn volymer (CV) Jämviktstiden buffert (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl) temperera.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min, och avlägsna supernatanten försiktigt. Lägg sedan till Ni-NTA Agarens i 50 mL röret som innehåller sackaros fraktionen och periplasmic fraktion. Rock på 4 ° C i 2 h.
- Centrifugera blandningen vid 400 x g, 4 ° C i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten till en annan frisk iskall röret som den obundna fraktionen. Över Ni-NTA Agarens till en gravitation kolumn.
- Lägg till 10 CV av tvätt buffert (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM eller 40 mM av Imidazol) till kolumn och samla elute som den tvätt-fraktionen.
Obs: Dessa lösningar bör läggas i ökande koncentrationer av Imidazol. - Lägga till 3 CV för eluering buffert (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl, 100 mM, 200 mM, 300 mM eller 400 mM av Imidazol) till kolumnen och samla elute som eluering bråk 1, 2, 3 och 4.
Obs: Dessa lösningar bör läggas i ökande koncentrationer av Imidazol. - Dialys eluerade fraktioner i 2 L av PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM av KCl, 10 mM av Na2HPO4, 2 mM av KH2PO4, pH 7,4) med dialys slangar (12,4 kDa) vid 4 ° C för 2 h. Kontrollera förekomsten av GPC3-S-Fab med 12% SDS-PAGE och sedan av Coomassie blå färgning.
- IgG-CH1 affinitet rening
- Överför 1 mL av IgG-CH1 affinitet harts i en 50 mL konisk tub och tvätta pärlorna med PBS först. Lägg sedan till dialyzed lösningen innehållande GPC3-S-Fab efter steg 3.2.6. Rock på 4 ° C i 2 h.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min, 4 ° C. Noggrant avlägsna supernatanten till en annan frisk iskall röret, och för över jonbytarmassan till en kolumn av gravitation.
- Lägg till 10 CV av tvätt buffert (PBS) till kolumnen, och samla elueringen som tvätta fraktionen.
- Förbereda samling rören genom att lägga till 1 M Tris pH 9,0 (0,1 mL per mL respektive eluerade fraktion). Eluera med 3 CV eluering buffert (0.1 M glycin-HCl, pH 2,7), och samla de eluerade bråkdel; Upprepa 3 gånger.
- Dialys eluerade fraktioner i 2 L av PBS med dialys slangar (12,4 kDa) vid 4 ° C för 2 h. Upprepa två gånger.
- Bestämma proteinkoncentration med ultramicrospectrophotometer (Molar extinktionskoefficient: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).
4. SDS-PAGE och Western-analys analys
- Ta en 10 µL av provet i 5 x SDS lastning buffert och blanda väl. Koka protein blandningen vid 100 ° C i 5 min.
- Förbereda 5 x SDS lastning buffert: 250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromophenol blå, 50% vol/vol glycerol, 5% vol/vol beta-merkaptoetanol.
- Förbereda en SDS-PAGE gel med en lastning gel (5%) och separationsgelen (12%) som tidigare beskrivits26,27,28.
- Ladda 10 µL av kokt protein blandning och protein markör, och kör den SDS-PAGE.
- Fläcken gelen genom att skaka i 20 min med Coomassie brilliant blå lösning, och sedan utföra avfärgning.
- För western blotting, efter överföring till en PVDF membran, blockera membranet med TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol skumma mjölk för 1 h i rumstemperatur under omskakning.
- Inkubera membranet med primära antikroppar (anti hans eller anti-Flag) utspädd 1:2,000 i TBST + 5% lättmjölk för 1 h.
- Tvätta med TBST för 5 min i rumstemperatur, och upprepa 3 gånger.
- Inkubera membranet i sekundär antikropp (HRP-länkade Fc antimus-antikropp) utspädd 1:2,000 i TBST + 5% lättmjölk för 1 h.
- Tvätta med TBST för 5 min i rumstemperatur, och upprepa 3 gånger.
- Tillsätt 1 mL HPR substrat per film, utveckla och ta bilder.
5. gel filtrering analys
- Använd kolumnen följande: kolumn volym 24 ml; Jämviktstiden buffert av PBS pH 7,4; Flöde av 0,5 mL/min vid rum tempererade; Provvolymen av 200 µL.
- Använd följande volym för protein och koncentration: 500 µL av 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugera vid 20 000 x g i 30 min och ta 200 µL till lasta.
- För protein markör volym och koncentration, ta 100 µL av cytokrom C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL av anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL av albumin (10 mg/mL, 66 kDa) och 200 µL alkoholdehydrogenas (5 mg/mL, 150 kDa) en tub. Centrifugera vid 20 000 x g i 30 min och ta 200 µL till lasta.
- Före varje körning, tvätta med minst 2 CV destillerat vatten med en flödeshastighet på 0,5 mL/min.
- Jämvikta kolonnen med minst 2 CV Jämviktstiden buffert (PBS, pH 7,4) med en flödeshastighet på 0,5 mL/min.
- Automatiskt injicera provet vid 0,5 mL/min att ladda provet.
- Eluera med Jämviktstiden buffert på 0,5 mL/min och upptäcka vid 280 och 215 nm.
6. Flödesanalys flödescytometri
- Kultur i HepG2 (GPC3 positiv), Hep3B (GPC3 positiv), Huh7 (GPC3-positiva), och MHCC - 97H (GPC3 negativa) celler i 100 x 20 mm plast rätter som innehåller DMEM medium med 10% fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 µg/mL) och streptomycin (50 µg/mL) vid 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur CHO (GPC3 negativa) och CHO/GPC3 celler hysa den fullängds mänskliga GPC3 cDNA (GPC3 positiv) 100 x 20 mm plast rätter som innehåller RPMI 1640 medium med 10% FBS, penicillin (100 µg/mL) och streptomycin (50 µg/mL) vid 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur den NK92/CD16 härbärgerat den fullängds mänskliga CD16 cDNA (CD16 positiv) i 25cm2 kolv som innehåller RPMI 1640 medium med 10% FBS, penicillin (100 µg/mL) och streptomycin (50 µg/mL) vid 37 ° C, 5% CO2.
- När cellerna är 70-90% konfluenta, kassera medium och tvätta cellerna med 2 mL PBS. Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin och inkubera vid 37 ° C under 2-3 minuter (eller tills cellerna börjar lossna från ytan). Tillsätt 1 mL komplett odlingsmedium att neutralisera trypsin och Slamma upp cellerna genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Räkna den cell nummer med hjälp av en Neubauer hemocytometer och upptäcka cellernas viabilitet av Trypan blå.
- Samla 3 x 106 celler för varje cellinje. Tillsätt 1 mL PBS + 0,2% BSA för att resuspendera cellerna. Centrifugera vid 200 x g, 4 ° C i 5 min. Upprepa två gånger.
- Tillsätt 0,3 mL PBS + 0,2% BSA att Slamma upp cellerna och överföra 100 µL (cirka 1 miljon) till varje 5 mL polystyren runda-botten rör.
Obs: Kontrollera att alla steg från här till rören bör hållas kallt på is. När antikroppen är bindande till cell surface antigen, startar anläggningen att internalisera. Genom att hålla det kallt, saktas processen avsevärt. - Tillsätt 10 µL av primära antikroppar (GPC3-S-Fab eller humant IgG1, slutlig koncentration 5 µg/mL) i varje rör och inkubera på is för 1 h.
- Tillsätt 1 mL PBS + 0,2% BSA att tvätta, och centrifugera vid 200 x g, 4 ° C i 5 min. Upprepa tre gånger.
- Återsuspendering i 100 µL av PBS + 0,2% BSA, tillsätt 0,5 µL av sekundära antikroppar (anti-humant IgG(H+L)-488, slutliga koncentration 10 µg/mL) och sedan ruva på is för 1 h. Obs: från detta steg, vänligen hålla cellerna från ljuset.
- Tillsätt 1 mL PBS + 0,2% BSA att tvätta, och centrifugera vid 200 x g, 4 ° C i 5 min. Upprepa tre gånger.
- Analysera cellerna genom flödescytometer enligt standardprotokoll29. Förvärva celler med en 488 nm laser för magnetisering.
7. cytotoxiska analyser
- Förbereda tumörceller.
- Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H och CHO cellinjer som beskrivs i steg 6.1-6.5.
- Späd cellerna till 0,5 ×10/5ml, och platta 100 µL celler (5 000 celler per brunn) på 96 brunnar. Kultur 6-8 h så att cellerna att bifoga.
- Förbereda människans perifera mononukleära blodceller (PBMC).
- Späda färska förberedda blod med en lika stor volym av PBS i en 50 mL konisk tub. Till exempel Späd 10 mL blod med 10 mL PBS.
- Ta 15 mL av lymfocyter separation medium till en färsk 50 mL koniska rör. Överföra det utspädda blodet till de lymfocyter separation mediet längs röret sakta.
Obs: Håll röret vertikalt. Inte bryta ytan av lymfocyter separation medium. - Centrifugera vid 400 x g i 35 min i rumstemperatur med broms.
- Långsamt bort lagrets övre plasma, och ta vita blodkroppar lagret som innehåller PBMC vid plasma-lymfocyter separation medium gränssnitt.
- Späd PBMC med en dubbel volym av PBS + 2% FBS. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS + 2% FBS. Centrifugera vid 400 x g för 5 min. räkna den cell nummer som beskrivs i steg 6,5.
- Förbereda NK-celler.
- Förbereda PBMC suspensionen vid en koncentration på 5 x 107 celler/mL i PBS + 2% FBS och ställe dem i en 5 mL polystyren runda-botten rör.
- Lägga till mänskliga NK cell anrikning Cocktail på 50 µL/mL av celler. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Återsuspendera magnetiska partiklar från NK cell anrikning kit och blanda väl att säkerställa de enhetligt avbryts av pipettering upp och ner kraftigt mer än 5 gånger. Överföra den återsuspenderade magnetiska partiklar vid 100 µL/mL till cellsuspension. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Ta upp till en total volym på 2,5 mL cellsuspension genom att lägga till PBS + 2% FBS. Blanda cellerna i röret genom pipettering försiktigt upp och ner 2 - 3 gånger. Placera röret (utan badmössa) in i magneten. Låt de magnetiska pärlorna bosätta sig för 2,5 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort magneten. I en kontinuerlig rörelse, Invertera röret, hälla bort berikad cellsuspensionen i en ny tub.
- Räkna den cell nummer som beskrivs i steg 6,5.
- Ställa in cytotoxisk reaktion.
- Späd NK-celler till 5 × 105 celler/mL med hjälp av motsvarande odlingssubstratet. Tillsätt 100 µL av NK cellsuspension till tumörcellerna pläterade på en plattan med 96 brunnar.
- Tillsätt 10 µL av GPC3-S-Fab vid olika koncentrationer, med den högsta dosen med en slutlig koncentration på 30 mikrog/mL, 3-faldig utspädning, 9 punkt (tre replikat).
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 72 h.
- Efter 72 h inkubation, ta bort mediet, tillsätt 100 µL av DMEM medium innehållande 10 µL CCK8 reagens till varje brunn i 96 brunnar och sedan Inkubera vid 37 ° C.
- Läs plattan vid 450 nm vid 1, 2, 3 och 4 h efter att ha lagt CCK8 reagens.
- Analysera data. Beräkna överlevnaden som (OD450 GPC3-S-Fab + effektor + tumör - OD450 medium) / (OD450 tumör - OD450 medium) × 100% och (OD450 GPC3-S-Fab + tumör - OD450 medium) / (OD450 tumör - OD450 medium) × 100%. Effektor cellerna är NK-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab rening
GPC3-S-Fab renades från E. coli genom en två-stegs affinitet rening, först med Ni-NTA-agaros, följt av IgG-CH1 affinitet rening. Efter två steg affinitet rening renades GPC3-S-Fab till homogenitet med två kedjor nära 1:1 (figur 2A). Förekomsten av både VH-CH1-CD16 VHH och VL-CL polypeptider kan identifieras genom sin distinkta C-terminal taggar, anti hans för VL-CL cirka 25 kDa och anti-Flag för VH-CH1-VHH cirka 38 kDa (figur 2B). Efter två steg affinitet rening, kan ~1.2 mg protein erhållas från 1 L av SB kultur. För att ytterligare karakterisera renat GPC3-S-Fab, utfördes gelfiltrering. Baserat på standard markörer (figur 2 c), identifierades GPC3-S-Fab som en homogen monomer i form av en heterodimer med en molekylär storlek på cirka 63 kDa (figur 2 c).
GPC3-S-Fab bindande aktiviteter
För att utvärdera om GPC3-S-Fab erkänner den GPC3-positiv och CD16-positiva celler, utfördes flödescytometri Flödesanalys med hjälp av de GPC3-positiva lever cancer cellinjer HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 och GPC3-negativa levercancer cell-linjen, MHCC - 97H och CHO-celler. GPC3-S-Fab kunde binda till alla GPC3-positiva celler, men med svagare bindning till Hep3B (figur 3B) och Huh7 celler (figur 3 c) än till HepG2 (figur 3A) och CHO/GPC3 (figur 2F). Ingen eller minimal bindningen till GPC3-negativa MHCC - 97H och CHO-celler observerades (figur 3D, 3E). GPC3-S-Fab kunde också binda till CD16-positiva celler, NK92/CD16 celler (figur 3 g). Dessa resultat överensstämmer med tidigare resultat med andra anti-GPC3 antikroppar30, vilket tyder på att GPC3-S-Fab specifikt kan binda GPC3-positiv cellinjer och CD16-positiva celler.
Utvärdera cytotoxiciteten hos GPC3-S-Fab, inkuberades tumörceller med färska isolerade NK-celler med olika koncentrationer av GPC3-S-Fab. Utan NK-celler hade GPC3-S-Fab ingen cytotoxicitet mot tumörceller oavsett GPC3 uttryck status (figur 4). I närvaro av NK-celler, GPC3-S-Fab utlöst starka cytotoxicitet mot HepG2, Hep3B och Huh7 celler på ett dosberoende sätt men visade ingen effekt på GPC3-negativa MHCC - 97 H celler (figur 4), tyder på att cytotoxiciteten hos GPC3-S-Fab beror på GPC3 uttryck på cellytan tumör.
Figur 1. Konstruktioner av GPC3-S-Fab
(A), bakteriell uttrycket konstruktioner av GPC3-S-Fab. Konstruktioner innehåller en pelB signal sekvens, en humaniserad anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (tung kedja), eller en VL-CL (lätt kedja). För att underlätta identifiering av protein och rening, lades en flagga eller en His8 RUNAT till C-terminus. (B) diagrammet av GPC3-S-Fab efter samtidig uttryck.
Figur 2. GPC3-S-Fab rening från E. coli.
(A) vänstra panelen, efter Ni-NTA affinitetskromatografi; Högra panelen, efter anti-IgG-CH1 affinitetskromatografi; M, molekylvikt stege; Coomassie blå färgning. (B) vänstra panelen, efter Ni-NTA affinitetskromatografi; Högra panelen, efter anti-IgG-CH1 affinitetskromatografi; M, molekylvikt stege; Western-analys. (C) Gel filtrering analys av GPC3-S-Fab. Övre panelen, standard markörer; nedre panelen, GPC3-S-Fab. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GPC3-S-Fab erkänner GPC3 positivt och CD16-positiva celler.
Flow flödescytometri analys av HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) och NK92/CD16 (G) celler utfördes som beskrivs i protokollet. Röda linjen: tumör celler; Gröna linjen: isotypen kontroll, tumör cell + human IgG1 + anti-humant IgG(H+L)-488; blå linje: tumör cell + GPC3-S-Fab + anti-humant IgG (H + L) -488. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. GPC3-S-Fab främjar celldöd GPC3-positiv cancer celler.
Dosberoende cytotoxicitet analyser utfördes som beskrivs i protokollet för HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), och MHCC - 97 H (D). Koncentrationerna av GPC3-S-Fab var från 0.0045 µg/mL till 30 µg/mL. Uppgifterna är medelvärdet av exemplar med felstaplar representera standardavvikelsen. Fylld cirkel, endast GPC3-S-Fab; fast torget, GPC3-S-Fab+ NK, NK-celler (50.000 per brunn) och målceller (5,000 per brunn). Blandningarna inkuberades för 72 h före cytotoxicitet mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterar vi en strategi för att konstruera ett nytt format av bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan rekrytera NK-celler inriktning GPC3 positiv tumörceller. S-Fab är baserad på naturliga Fab format genom att lägga till en anti-CD16 VHH11,12. Jämfört med regionen bsAbs innehållande Fc, kan GPC3-S-Fab enkelt produceras i periplasm av bakterier i stor skala.
Användning av uttryck och rening strategi som beskrivs i protokollet, fick vi en löslig och funktionella GPC3-S-Fab i stora mängder. För att underlätta periplasmic uttryck, lades en signal sekvens pelB till N-terminalen direkt utsöndring till periplasm av E. coli17. I motsats till cytoplasman, mer oxiderande miljö i periplasmic utrymmet mellan de cytoplasmiska och yttre membran är utrustad med ett antal proteiner viktiga för proteinveckning och montering och främjar därmed korrigera vikningen och lösligheten av rekombinanta proteiner16. Maskineriet för proteinveckning och export till periplasm i E. coli har dock begränsad kapacitet. Högt uttryck av rekombinanta proteiner ofta resulterar i ansamling av olösliga produkt i periplasm16. För att undvika höga uttrycket av protein under en kort tid, tillämpades låg IPTG (0,2 mM) och låg temperatur (16 ° C) i näringsrik medium i detta protokoll för att undvika ansamling av olösligt protein. I denna studie erhölls ~1.2 mg protein från 1 L av medium, förbättra avkastningen minst 2gånger jämfört med tidigare verk12.
För att undvika proteinnedbrytning, bör alla fraktioner som innehåller GPC3-S-Fab i olika steg hållas på is. Med hans tagga på C-terminalen VL-cl, Ni-NTA-agaros användes för rening. Dock räcker det inte med enda Ni-NTA-agaros rening för att ta bort oönskade proteiner, såsom oparade VL-CL protein. För att rena den homogena heterodimeriskt GPC3-S-Fab, det andra steget, tillämpades anti-IgG-CH1 affinitet rening. Det renat proteinet hade hög renhet och två polypeptider nära 1:1 (figur 2A-2B).
Gel filtrering kromatografi kan avgöra molekylvikt av proteiner baserat på deras molekylära storlekar och former; analysera graden av renhet; och avgöra om det renat proteinet är en monomer, dimer, eller som består av aggregat15. Genom gel filtrering kromatografi identifierades GPC3-S-Fab med den förväntade molekylära storleken på cirka 63 kDa, som är i form av en monomer med heterodimerization av GPC3-S-Fab (figur 2 c).
Flödescytometri kan avgöra huruvida en antikropp kan binda sitt antigen på cellmembranet, jämfört med traditionella western-blotting och ELISA, som endast upptäcka antigen-antikroppsreaktioner med bindande. Genom flödescytometri Flödesanalys erkände GPC3-S-Fab GPC3 på cellmembranet, tyder på den GPC3-Fab-delen var funktionell. När du utför flödescytometri Flödesanalys, är det viktigt att hålla alla stegen på is eller vid 4 ° C efter antikroppen läggs. När antikroppen binder till cell surface antigen, inleda antikropp-antigen komplex internalisering. Genom att hålla det kallt, bromsas internalisering processen avsevärt.
PBMC och NK-celler var effektivt isolerade från perifert blod genom centrifugering med lymfocyter separation medium, följt av magnetiska-aktiverad cell sortering strategier. GPC3-S-Fab visade potent cytotoxicitet mot GPC3 positiva cellerna när förhållandet av NK-celler till målcellerna (tumörceller) var 10:1, och förhållandet mellan NK-celler till målceller kan variera från 50: 1 till 5:1.
Sammanfattningsvis ger GPC3-S-Fab, som kan produceras i en mikroorganism uttryck systemet, en ny väg för att skapa funktionella format av bsAbs mot tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av R & D planera i provinsen Guangdong (Kina) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
