Summary
단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 > 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.
Abstract
시퀀싱 기술 생물 학적 시스템에서 세포질이 성분의 역할의 진화 이해에 대 한 응답에서 단일 셀 해상도로 대량에서 패러다임의 변화를 받은. 그러나, 큰 인구의 단일 셀 시퀀싱 게놈 시퀀싱에 대 한 처리에 제한에 의해 방해 되어 있다. 이 종이에 우리는 방법 분리, 증폭, 드롭릿 마이크로 사용 하 여 단일 셀 게놈 시퀀싱 (SiC-seq) 및 바코드 단일 세포의 게놈 설명 합니다. 미세 합병 효율적으로 쌍 각 게놈 독특한 단일 셀 oligonucleotide 바코드와 함께 하는 동안 microgels에 셀 캡슐화 compartmentalized 정화와 DNA의 tagmentation 수 있도록 > 50000 단일 셀 시퀀싱 할 당 실행 합니다. 시퀀싱 데이터는 역다중화 바코드를 생성 하는 단 세포에서 발생 하는 읽기의 그룹에 의해. 단일 셀 시퀀싱의 높은 처리량과 낮은 바이어스 방법으로 SiC-seq는 광범위 한 게놈 연구를 대상으로 다양 한 세포 인구 수 있게 된다.
Introduction
게놈은 세포 id 및 기능, 전체 유기 체를 포함 하는 청사진의 잠재력을 코딩 있습니다. 게놈 수준에서 세포 생물학의 이해는 다른 유형의 세포 인구에서 관찰 된 phenotypic 다양성을 설명할 수 있다. 이 이종 생물 학적 시스템에서 이며 인류 건강 및 질병에 대 한 광범위 한 의미를 갖는다. 예를 들어 종양 세포 중 유전자 복사 번호 유사 진화 및 암1,2의 확산에 연결 됩니다. 세균 감염, pathogenicity 제도 게놈의 작은 분수에 수평으로 옮겨질 수 있다 하 고 항생제 내성 박테리아3,4의 확산으로 이어질. 단일 셀 수준에서 유전자를 공부 하 고 있는 주요 과제의 DNA, 세포의 수천을 분석할 필요가 genotypes의 전체 다양성을 낮은 수량입니다. 이러한 이유로 실험 처리량에서 제한 단일 셀 연구, 가장 풍부한 셀 쪽으로 결과 바이어 싱의 효과 방해 했습니다. 단일 셀 격리 기법5,6, 광학 핀셋7, 대량 젤8, 및9 마이크로 임베디드 정렬 흐름 등은 시퀀싱;에 대 한 셀의 수백 처리할 수 그러나, 이것은 대부분 샘플의 극히를 일부에 나타냅니다. 실질적으로 더 높은 처리량을 가진 단일 셀 게놈 시퀀싱 하는 방법을 더 깊이 그리고 더 완전 한 세포 인구, 따라서 elucidating genotypic 다양성이 지역이 사회 내에서 역할의 프로 파일링 수 있습니다.
드롭릿 마이크로 셀과 picoliter 스케일 원자로의 수백만에서 생물학 시 약의 높은 처리량 조작 수 있습니다. 날짜 하려면, microdroplet 기술 이질적인 조직10,,1112, 셀 중 차동 식 패턴을 공부 하는 데 사용 되었습니다 깊이 긴 분자13,14 시퀀스 ,15및 단일 셀16행위 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 분석. 실제로, microdroplets 높은 처리량, compartmentalized 작업, 그들을 단일 셀 유전체학에 의무가 응용 프로그램 만들기 수 있다. 그러나이 기술 개발 과제가 그것의 자신의 독특한 기술, 있습니다. 셀 lysed 해야 합니다 정화, 고 균일 하 게 샘플 세포 인구를 최소한의 바이어스 증폭. 또한, polyadenylated 포유류 세포에 있는 mRNA 사본는 달리 아무 유사한 분자 모티브 대상 핵 산의 캡처를 촉진 하기 위하여 게놈에서. 이러한 이유로, 단일 셀 게놈 시퀀싱 microdroplet 플랫폼에서 구현 하기 어려운 되었습니다.
이 작품에서는, 우리는 단일 실험17셀의 수천 수만의 게놈을 시퀀싱 할 수 이전에 보고 된 단일 셀 미세 접근의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 기술로, SiC-seq 라는 세균 세포 미크론 규모 hydrogels에 개별적으로 lysed, tagmented, 그리고 독특한 oligonucleotide 바코드를 통해 세포의 게놈 DNA에 접합 되는 포함 하는 microdroplet와 합병 한 단일 중복 확장 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR). hydrogels는 높은 분자 무게 genomic DNA sterically 쌌 다, 세제 및 액세스 하 여 DNA barcoding18전에 정화 용균성 효소와 같은 작은 분자를 허용 하는 절연된 컨테이너 역할을 합니다. 이 프로토콜 처리 > 결과 바코드 라이브러리 시퀀싱에 대 한 준비에 시간의 문제에 50000 단일 셀. 시퀀싱, 따라 읽기는 셀룰러 인덱스와 각 데이터 집합의 읽기, 수백만의 구성의 결과로 그들의 단일 셀 바코드 순서 대로 역다중화.
Protocol
1. 미세 장치 제조
- 준비는 미세 (제공 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용 하 여 마스크 디자인. DWG; 보조 파일참조). 인쇄 회로 기판 필름에 10 µ m 해상도와 공급 업체에서 이러한 디자인을가지고.
참고: 다층된 미세 장치, 해당 마스크 포함 맞춤 표시. -
각 장치에 대 한 수호-8 마스터 몰드 (그림 1A)를 다음과 같이 조작.
- 웨이퍼의 중심에 수 8 3025 감광 제의 약 1 mL을 붓는 의해 3에서 직경 실리콘 웨이퍼를 준비 합니다. 흡입을 적용 하 여 스핀 coater에 웨이퍼 척을 보안 합니다.
- 레이어 두께의 목록은 표 1 을 참조 하 고 각 장치에 대 한 속도 스핀. 모든 장치에 대 한 30 스핀 코팅을 시작 s 500 rpm에서 30 다음 표시 된 속도로 s.
- Spin coater를 30 분에 대 한 135 ° C로 설정 열판에 베이킹 후 실내 온도에 냉각 웨이퍼를 허용 하는 부드러운 빵 수호-8-실리콘 웨이퍼를 제거 합니다.
- 3 분에 대 한 조명을된 190 mW, 365 nm UV LED 아래 적절 한 미세 마스크 수-8-실리콘 웨이퍼를 노출 합니다.
- 노출, 하드 빵 열판에 웨이퍼 1 분 동안 135 ° C로 설정합니다. 이 베이킹 단계 실내 온도에 냉각 웨이퍼를 하실 수 있습니다.
- 단일 레이어 미세 장치 1.2.7 단계로 건너뜁니다. 다층된 미세 장치에 대 한 단계 1.2.1-감광 (그림 1B)의 두 번째 계층에 대 한 1.2.5 반복 합니다.
- 단일 계층 장치 (또는 다중된 장치에 대 한 두 번째 하드 빵)에 대 한 첫 번째 하드 빵, 다음 프로필 렌 글리콜 monomethyl 에테르 아세테이트 (PGMEA) 30 분의 욕조에 immersing 하 여 웨이퍼를 개발 합니다.
- 웨이퍼의 개발 후 웨이퍼 린스를 PGMEA를 포함 하는 물 총 병을 사용 합니다. 다음 물 총 병 135 ° C 열판 건조를 1 분 동안에 그것을 배치 하기 전에 소 프로 파 놀을 포함 하는 웨이퍼를 린스 합니다.
- (이제부터 마스터 라고 함) 웨이퍼 캐스팅입니다 (PDMS)와 페 트리 접시에 놓습니다.
-
마스터 단계 1.2 준비, PDMS 주조 장치 제조 수행 진행 합니다.
- PDMS 질량 11:1 비율에서 경화제와 실리콘 베이스를 결합 하 여 준비 합니다. 믹스 실리콘 베이스와 경화제 손으로 저 어 스틱.
- PDMS 생성 챔버에 배치 하는 진공을 적용 하 여 드. 공기 거품은 더 이상 표시 될 때까지 드를 PDMS를 허용 (일반적으로 30 분).
- 신중 하 게 최종 PDMS 층 두께 약 5 m m. 드가 모든 공기 거품의 제거를 보장 하기 위해 다시 PDMS 마스터 degassed PDMS 붓는 다.
- 기체 제거 후는 PDMS와 마스터 80 분 동안 80 ° C에서 구워.
- 신중 하 게 치료 PDMS 슬 래 브는 면도날을 사용 하 여 구운된 마스터에서 삭제할. 모든 상처는 실리콘 웨이퍼 위에 있는지 확인 하십시오.
참고: 실리콘 웨이퍼에서 만든 상처는 균일 한 결합을 방지 하는 입술에 발생할 수 있습니다. - 인 레트와 출구 0.75 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 펀치. 모든 먼지와 길 잃은 PDMS 장치의 기능 측면에서 포장 테이프를 사용 하 여 제거 합니다.
- 플라즈마 장치 치료, 이전 소 프로 파 놀과 그것을 헹 구 고 그것을 건조 하 여 50 m m x 75 m m 유리 슬라이드를 청소.
- 플라즈마 처리에 대 한 위로 향하도록 기능 플라즈마 성으로 PDMS 슬 래 브와 유리 슬라이드를 놓습니다. 1 분 본드 유리에 장치 노출, 여 슬라이드 또는 얼굴, 함께 측 대 1 mbar O2 플라즈마를 사용 하 여 플라즈마 처리를 수행 합니다.
- 플라즈마 처리에 따라 40 분 동안 80 ° C에서 장치를 구워.
- 마지막으로, 소수 성 미세 채널을 렌더링 하는 후미의 하나로 유리 표면 처리 액체를 주사. 모든 채널 솔루션 완전히 침수 되 고 각 dropmaker에 대 한 주사를 반복 확인 하십시오. 80 ° c 10 분 초과 용 매를 증발 처리 장치를 구워.
2입니다. Agarose Microgels 세포의 캡슐화
참고: 그림 2A참조.
- 트리 스-EDTA (테) 버퍼 x 1에 3 %w / v 낮은 녹는 온도 agarose의 1 mL를 준비 합니다. Agarose 솔루션 로드 주사기 직전까지 90 ° C 열 블록에 계속.
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세포 현 탁 액을 준비 합니다.
참고:이 프로토콜과 관련 된 미세 장치는 검증 세균성 세포, 냉동된 주식 또는 신선한 준비 작업입니다. 포유류 세포, 세포 유형에 따라 미세 채널 차원의 더 큰 셀 크기에 맞게 조정을 해야 합니다.- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL에 셀 resuspend
- hemocytometer 또는 흐름 정렬 셀을 계산 합니다. 1에서 10의 대상 셀 캡슐화 속도 25 µ m microgels에 대 한 107 셀/mL x 2.4의 최종 농도에 세포 현 탁 액 1 mL를 준비 합니다.
- 3 분 Aspirate는 상쾌한 3000 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 17 %v / v 밀도 그라데이션 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend ( 재료의 표참조) PBS에. 주사기 로드까지 얼음에 계속.
- 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제 포함 된 불 유 (HFE) 3 mL 주사기를 로드, 27 G 니 들 맞지 고 그것 주사기 펌프 합니다.
이 프로토콜에는 미세에 27g 바늘으로 모든 주사기 단계: 맞는. 펌프 작업이 시작 될 때까지 실수로 찌르는의 위험을 줄이려면 모든 바늘에 모자를 유지. - 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액 및 녹은 agarose를 로드 하 고 27-게이지 바늘, 둘 다 맞는 주사기 펌프에 배치.
- Agarose 주사기와 펌프에서 주사기와 튜브 입구에 고는 agarose를 방지 하기 위해 작은 공간 히터와 따뜻한 유지. 높은 공간 히터를 설정 하 고 난방 표면은 주사기에서 약 10cm 위치. 주사기에 측정 온도 약 80 ° c. 인지 확인
참고: 사용자는 튜브의 녹는 포함 하 여, 장비 손상의 위험을 줄이기 위해 펌핑 장치에서 권장된 거리에서 히터를 유지 하도록 조언 된다. -
25 µ m microgel 방울 공동 흐름 dropmaking 장치를 사용 하 여 생성 합니다.
참고: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 구조도 그림 3A 참조.- 폴 리 에틸렌 (PE) 관의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 주사기 바늘을 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임.
- 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 15 mL 컬렉션 튜브에서 무료 끝을 배치.
- Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE-말뚝; 800 µ L/h PBS;에 세포 현 탁 액에 대 한 200 µ L/h 그리고 200 µ L/h 3 %w / v agarose.
- Dropmaking, 후는 agarose의 완전 한 겔 화 되도록 30 분 동안 4 ° C에서 컬렉션 튜브를 놓습니다.
3. 분리 및 세척 Agarose Microgels
- Agarose 방울의 상위 계층을 방해 하지 않도록 주의 복용 20 G 바늘 장착 3 mL 주사기를 사용 하 여 컬렉션 튜브에서 오일의 하위 계층을 제거 합니다.
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Perfluorooctanol (PFO)와 유화 제를 휴식.
- HFE에 agarose 방울 10 %v / v PFO의 1 mL를 추가 합니다. 피펫으로 철저 하 게 코트는 유화 액을 1 분 위로, 아래로이 솔루션.
참고: 모든 microgel에 대 한 세척 단계, 피펫으로 1000 µ L 팁 솔루션. 균질 및 그것 pipetting 후 덩어리의 무료 microgel 정지 표시 되어야 합니다. - 2000 x g 1 분 agarose microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. PFO/HFE 상쾌한 포부;에 의해 제거 microgels 그들의 계면 층의 지금 자유롭다 고 분명 나타납니다.
- HFE에 agarose 방울 10 %v / v PFO의 1 mL를 추가 합니다. 피펫으로 철저 하 게 코트는 유화 액을 1 분 위로, 아래로이 솔루션.
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헥 산에는 계면 활성 제와 microgels를 씻어.
주의: 제 초 제는 휘발성 유기 용 매, 그리고 단계 3.3에서에서 세척 증기 두건에서 실시 한다.- 1 %v / v sorbitan monooleate 비 계면 활성 제의 2 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) agarose microgels 헥 산에. 혼합 10 x 위아래로 피펫으로, 작은 microgel의 완전 한 결별을 보장.
- 1000 x g 1 분은 microgels 수집에서 튜브를 회전 합니다. 계면 활성 제/헥 산 솔루션을 제거 하려면 상쾌한 발음
- 계면 활성 제/헥 산 세척을 반복 합니다.
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모든 잔류 유기 용 매를 제거 하는 수성 버퍼에서는 microgels를 씻어.
- TET 버퍼의 5 mL을 추가 [0.1 %v / v octylphenol ethoxylate 비 세제 ( 재료의 표참조)에 1 x 테] 원뿔 관에. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다.
- 2000 x g 2 분은 microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. TET 버퍼를 제거 하는 상쾌한 발음
- TET 세척 2 x를 반복 합니다.
- 원뿔 튜브에 1 x 테 버퍼의 5 mL를 추가 합니다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다.
- 2000 x g 2 분은 microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. TE 버퍼를 제거 하는 상쾌한 발음
- 테 세척을 반복 합니다.
- 10 µ L 약 수와 젤의 얼룩으로 400 X 확대 현미경 microgels에 셀 캡슐화 확인 1 x 핵 산 얼룩 ( 재료의 표참조).
참고: Microgels 세포 DNA에서 GFP 채널 (497/520 nm 여기/방출 파장) 형광 것입니다 하는 동안 투명 한 채널에서 분명히 나타납니다. 그림 4A와 같이 투명 하 고 형광 채널의 오버레이 microgels 셀 표시 됩니다.
4. Agarose 용균성 효소를 통해 세포의 세포의 용 해
- 1 mL 용균성 효소 60mg lysozyme (동결 건조 된 분말), EDTA (0.5 M 재고의 15 µ L의 TE 버퍼 (1x), 효 모 용균성 효소 (5 U / µ L 주식, 최종 10 U/mL), dithiothreitol (1 M 주식, 최종 30 m m)의 30 µ L의 2 µ L의 800 µ L를 사용 하 여 칵테일의 준비 최종 7.5 m m), mutanolysin (100 U / µ L 주식, 최종 200 U/mL)의 2 µ L, 2 µ L의 lysostaphin (10 U / µ L 주식, 최종 20 U/mL), 그리고 30 µ L NaCl (1 M 주식, 최종 30 m m)의.
- 1 mL을 볼륨을가지고 추가적인 테를 추가 합니다. Vortexing에 의해 솔루션을 믹스.
- 씻어 microgels의 더 이상 1 ml 용균성 효소 솔루션의 전체 1 mL를 추가 합니다. Pipetting 10 x 믹스. 37 ° C에서 혼합물을 품 어 > (최대는 야간 보육) 통에 2 h.
5. 세제-기반 Microgel 치료
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용균성 효소 (4 단계)을 통해 세포의 용 해, 다음은 microgels 세척.
- 2000 x g 2 분에서 microgels 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음. 작은 물방울 불투명 화이트 셀 파편 펠 릿에 분산으로 인해 나타납니다.
- 10 mM Tris HCl 버퍼와 혼합 10 x 위아래로 피펫으로의 5 ml는 microgels resuspend.
- 2000 x g 2 분 대에서 혼합물 스핀 다운 다음 포부는 상쾌한 제거.
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microgels에 세제 처리를 수행 합니다.
- 리튬 라우릴 황산 (뚜껑) 세포의 용 해 버퍼에는 젤 resuspend (20 mM Tris HCl에에서 뚜껑 0.5 %w / v) 및 3 mL의 최종 볼륨을 0.5 M EDTA의 60 µ L.
- 가수분해 K 효소 (800 U/mL 주식)의 5 µ L를 추가 합니다. 혼합, 10 x 위아래로 피펫으로 다음 solubilize 세포 막 단백질을 소화 하는 1 시간에 대 한 열 블록에 42 ° C에 혼합물을 품 어.
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세제 치료 다음에 microgels 세척.
- 스핀은 microgels와 원뿔 튜브 아래로 2000 x g 2 분 제거에는 상쾌한 포부에 의해.
- Microgels 2 %v / v 음식 물에 20의 10 mL로 씻는 다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다.
- 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 워시 모든 잔여 효소 비활성화를 100% 에탄올 10 mL와 함께 microgels. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다.
- 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- Microgels 0.02 %v / v 음식 물에 20의 10 mL로 씻는 다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다.
- 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 반복 20 음식을 씻어 3 배. 어떤 큰 덩어리를 제거 하는 마지막 세척 전에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 솔루션을 전달 합니다.
- DNA 저하를 방지 하기 위해 10 mM Tris HCl 버퍼의 5 ml에서는 microgels resuspend. microgels tagmentation (7 단계) 이전까지 1 주에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
6. 디지털 PCR에 의해 작은 물방울 바코드 생성
- TE 버퍼 낮은 바인딩 튜브에서 x 1에 뇌관 (표 2) 바의 500-오후 재고를 준비 합니다. 각각의 사용, 이전 작업 재고 1 오후의 뇌관을 희석 하 고 열 블록에 1 분 동안 70 ° C에가 열.
- 75를 사용 하 여 150 µ L PCR 반응 혼합 준비 충실도 높은 뜨거운 시작 마스터의 µ L 믹스 ( 재료의 표참조) (2 배), PCR 급 물, DNA_BAR 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 3 µ L, P7_BAR 뇌관 (10 µ M 재고의 3 µ L의 42 µ L 최종 0.2 µ M), 바코드 희석 (1 오후 주식, 최종 40 fM)의 6 µ L, 6 µ L 폴 20의 (50 %v / v 재고, 2% 최종), 및 15 µ L 말뚝의 6 k (50 %w / v, 주식 5% 최종). 10 배 아래로 pipetting으로 혼합.
- 준비 HFE 백업 주사기 HFE의 200 µ L를 그려서 오일 주사기로 하 고 바늘으로 적합. 바늘을 PE 튜브의 섹션을 연결 하 고 라인을 손으로 총리. 대상 솔루션에 PE 튜브의 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 PE 튜브와 주사기에 PCR 혼합의 모든 150 µ L를 그립니다. 주사기 펌프에 주사기를 로드 합니다.
- 로드 불 오일 (HFE) 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제를 포함 하는 1 mL 주사기, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다.
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25 µ m 바코드 상품 공동 흐름 dropmaking 장치를 사용 하 여 생성 합니다.
참고: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 구조도 그림 3A 참조.- 셀 입구 납 땜 납의 작은 조각으로 공동 흐름 dropmaker 장치를 연결 합니다.
- HFE와 함께 로드 된 주사기를 연결 하 고 PCR 혼합 PE 튜브의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 녹은 Agarose 입구를 사용 하 여 바코드에 대 한 PCR 혼합. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임.
- 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 0.2 mL PCR 튜브에 자유로운 끝을 배치. Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE 말뚝 및 PCR 혼합에 대 한 200 µ L/h 600 µ L/h. 각 튜브의 상품의 약 50 µ L PCR 튜브를 수집 합니다.
- Dropmaking, 후 신중 하 게 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 유화 액에서 HFE 오일의 더 낮은 층을 제거 하 고 5 %w / w PFPE 못 계면 활성 제를 포함 하는 FC-40 불 기름으로 그것을 대체 합니다. 다음 프로토콜 열 주기: 3 분 동안 98 ° C, 40 x (98 ° C 10 s, 20 62 ° C s, 20 72 ° C s), 72 ° C 5 분, 그리고 대기 12 ° c.에 대 한
참고: 열 순환 방울 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 일. -
바코드 증폭 및 캡슐화 속도 확인 합니다.
- 1 x 핵 산 준비는 2 %w / w PFPE 못 계면 활성 제;와 HFE에 ( 재료의 표참조)을 얼룩 얼룩 소폭 HFE에 혼합할 수 있는 이며 작은 물방울에서 DNA에 바인딩하는 것입니다.
- 얼룩 오일의 10 µ L를 열 순환 바코드 유제의 1 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 그들을 품 어.
- 200 배 확대에 형광 현미경 검사 법 (GFP 채널, 497/520 nm 여기/방출 파장) 물방울 이미지 및 바코드 캡슐화 속도. 신호 이산 됩니다: 빈 방울 어두운 나타납니다 반면 증폭 된 바코드를 포함 하는 작은 물방울 밝게, 형광 것 이다 (그림 4B).
7입니다. 작은 물방울에서 게놈 DNA의 Tagmentation
참고: 그림 2B참조.
- 다음-세대 시퀀싱 라이브러리 준비에서 시 약을 사용 하 여 tagmentation 솔루션의 500 µ L를 준비 키트 ( 재료의 표참조). 사용 하 여 tagmentation 효소의 7 µ L, tagmentation 버퍼의 250 µ L 및 243 µ L PCR 급 물. Vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 수집 하는 혼합물 아래로 회전. HFE 석유 지원 1 mL 주사기에이 솔루션을 로드 하 고 바늘으로 적합.
-
microgels는 reinjection에 대 한 준비.
- 2000 x g에서 2 분 동안 microgel 튜브 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음. 젤 로드 피펫으로 팁 HFE 백업 주사기의 상단에 젤의 200 µ L을 전송 하 고 테이프의 작은 조각으로 노즐을 봉인.
- 3D 인쇄 원심 분리기 어댑터를 사용 하 여 ( 추가 파일 1 과 2참조), 3000 x g에서 3 분 microgel 주사기를 스핀.
- 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 주사기에서 액체 상쾌한을 제거 합니다. Microgel 레이어 주사기 노즐의 기지를 밀어. 주사기 바늘으로 적합.
- 로드 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제 포함 된 불 유 (HFE) 3 mL 주사기, 바늘, 그것을 맞지 고 그것 주사기 펌프 합니다.
- 다시 tagmentation 시 약을 포함 하는 작은 물방울으로는 microgels를 캡슐화 합니다.
주: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 도식에 대 한 그림 3B 를 참조 하십시오.- HFE, tagmentation 믹스, 그리고 microgels PE 튜브의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 주사기를 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임.
- 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 1 mL 선으로 그려진 플런저와 빈 1 mL 주사기에 자유로운 끝을 배치.
- Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE 못 2000 µ L/h, microgels를 위한 200 µ L/h 및 500 µ L/h tagmentation 믹스에 대 한.
- 400 배 확대에 가벼운 현미경 microgel 캡슐화 속도 확인 합니다. 그림 4C와 같이 방울의 약 80-90%는 microgel를 포함 해야 합니다.
- 주사기 바늘으로 tagmentation 유화 액을 포함 하 고 열 블록 또는 genomic DNA 조각에 55 ° C에서 1 시간 동안 오븐에서 직 립 품 어 있습니다.
8. 단일 셀 Barcoding 미세 이중 합병에 의해
참고: 그림 2C참조.
- HFE 2 %w / w PFPE 못 FC-40 오일 분수를 대체 하 여 합병을 위한 바코드 방울을 준비 합니다. 조심 스럽게이 액 1 mL 주사기로 전송, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다.
- 주사기 펌프를 incubated 및 tagmented microgel 방울 주사기를 로드 합니다.
- PCR 혼합의 500 µ L를 준비 합니다. 형성에서 침전을 방지 하기 위해 다음 순서로 시 약을 추가: PCR 급 물, P5_DNA 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 10 µ L, P7_BAR 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 10 µ L, 50 µ L 말뚝의 6 k (50 %w / v 주식 140 µ L 최종 5%), 폴 20 50 %v / v 재고, 5% (최종)의 50 µ L, Taq 마스터 믹스의 250 µ L (2 x) ( 재료의 표참조), 등온선 중 합 효소의 10 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 중화 버퍼의 10 µ L ( 재료의 표참조). 10 x 위아래로 pipetting으로 그들을 혼합 하 고 그것을 수집 하는 혼합 아래로 회전. HFE 백업 1 mL 주사기에이 솔루션 로드, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다.
- 부하 세 3 mL 주사기 불 오일 (HFE) 포함 하는 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제, 바늘으로 각각에 맞는 고 그들 주사기 펌프 합니다.
- 2 M NaCl로 3 1 mL 주사기를 로드 하 고 각각의 바늘을 맞는 그들을 따로 설정.
-
병합 바코드 방울, tagmented 게놈 방울, 그리고 PCR 이중 합병 장치를 사용 하 여 혼합.
주: 장치 시 약 및 전극 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 도식에 대 한 그림 5 를 참조 하십시오.- 2 전극 후미와 PE 튜브의 자에 단일 inletusing 조각 3 NaCl 주사기를 연결 합니다. 전극, 적용 압력 주사기를 수동으로 전극 소금물으로 완전히 채워집니다 때까지. 작성 후 전극, 수동 압력 굴 주사기에 자에 채워질 때까지 적용 됩니다. 납 땜 납의 작은 조각으로 굴의 자유로운 끝을 연결 합니다.
- 3 HFE 주사기 펌프 2 스페이서 오일 후미와 PE 튜브의 dropmaking 기름 inletusing 조각에 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임.
- PCR 혼합 주사기를 연결 하 고 microgel 주사기, 상품 바코드 상품 주사기 PE 튜브를 사용 하 여 그들의 각각 후미. 주사기 바늘;에 그들을 연결 하기 전에 정전기 방지 총으로 모든 방울 reinjection 튜브를 촬영 정전기 방지 치료 방울 접착 PE 배관에 정전기에 의해 유도 된의 위험을 줄여줍니다.
- PE 튜브의 조각을 콘센트에 연결 하 고 0.2 mL PCR 튜브에 자유로운 끝을 배치.
- 악어 클립을 사용 하 여 냉 음극 형광등 인버터에 전극 주사기의 바늘을 연결 합니다. 2 V 인버터의 DC 전원 공급 장치를 설정 합니다.
- 권장된 흐름 율을 가진 이중 합병 장치 실행: tagmented microgel 삭제에 대 한 300 µ L/h, 100 µ L/h 바코드 상품, HFE 2 %w / w PFPE-말뚝 (dropmaking 기름)에 대 한 1500 µ L/h, 확대를 위한 600 µ L/h에 대 한 혼합, HFE 2 %w / w PFPE 페그 (200 µ L/h 바코드 공백 기름), 700 µ L/h HFE 2 %w / w PFPE-말뚝 (microgel 스페이서 기름). 각 튜브에서 유제의 약 50 µ L PCR 튜브를 수집 합니다.
- 열 순환, 전에 신중 하 게 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 유화 액에서 HFE 오일의 더 낮은 층을 제거 하 고 5 %w / w PFPE 못 계면 활성 제를 포함 하는 FC-40 불 기름으로 대체. 다음 프로토콜 열 주기: 5 분, 2 분 동안 95 ° C, 30 x 65 ° C (95 ° C 15에 대 한 s, 1 분, 1 분에 72 ° C를 위한 60 ° C), 72 ° C 5 분, 다음 12 ° c.에서 개최
-
열 순환 방울에서 바코드 DNA를 복구 합니다.
- Microcentrifuge 튜브에 방울 풀 고 PFO의 20 µ L를 사용 하 여 유화 액. 와 동 10 그들 혼합 s.
- 1 분 수성 (맨 위)과 기름 (아래) 단계에 혼합물을 충분치 10000 x g에서 튜브를 회전 합니다. 조심 스럽게를 피펫으로 사용 하 여 튜브에서 위 수성 층을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송. 오일 단계를 삭제 합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 스핀 열에 바코드 PCR 제품을 정화 하 고 1 x 테 버퍼의 20 µ L에 elute.
- 단계 9 및 10에 의하여 분석 수행된 시퀀싱을 진행 합니다.
9. 라이브러리 준비 및 시퀀싱
- 조각 크기 선택 및 정량화에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱에 대 한 단일 셀 라이브러리를 준비 합니다.
- 읽기 1과 읽기 2 기본 화학 결합-엔드 라이브러리 시퀀스입니다. 사용자 정의 인덱스 1 뇌관 I7_READ를 사용 하 여 (표 2)에 해당 하는 단일 셀 바코드 읽기, 15-bp 인덱스에 대 한.
10. 단일 셀 데이터 분석
참고: 품질 관리 및 SiC seq 데이터의 예비 분석에 대 한 사용자 정의 파이썬 스크립트는 https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq에서 다운로드할 수 있습니다.
- "BarcodeCleanup.py" 바코드 읽기에서 품질 관리를 수행 하 고 단일 셀 데이터는 SQLite 데이터베이스를 내보낼에 스크립트를 실행. 제어 실험에 대 한이 스크립트를 사용 하 여는 "-정렬"로 알려진된 참조 게놈을 읽기 정렬 설정 플래그.
- "Purity.py" 스크립트를 사용 하 여 (제어 실험)에 대 한 바코드 그룹의 순도 분석 하 고 그림 6B와 고 순도 값을 확인 합니다.
Representative Results
SiC seq 실험 워크플로 포함 3 PDMS 미세 장치는 소프트 리소 그래피 프로시저 (그림 1)를 사용 하 여 조작 합니다. 공동 흐름 dropmaker (그림 3A)는 독특한 단일 셀 식별자 genomic DNA를 라벨에 대 한 디지털 바코드 방울의 25 µ m를 생성 합니다. PCR 증폭 (표 2, 뇌관 바)에 대 한 핸들을가지고 있는 15 bp 타락 한 시퀀스 바코드 oligonucleotides에 의하여 이루어져 있다. 바코드 단일 분자 캡슐화를 달성 하기 위해 femtomolar 농도를 희석 하 고 모든 방울을 받을 0 또는 1 바코드 fragment(s). 더블-좌초 바코드 amplicons의 많은 복사본을 저조한 방울 바코드를 포함 하는 증폭 된다. 핵 산 얼룩 성공적인 증폭을 확인 하 고 바코드 조각 (그림 4B)의 캡슐화 속도 측정 하는 데 사용 됩니다. microgels 공동 세균성 세포 현 탁 액 및 동일한 유량 (그림 2A)에서 녹은 agarose 젤을 흐르는 의해 생성 됩니다. agarose는 공동 흐름 dropmaking 프로세스는 효과적으로 2의 요인에 의해 수성 솔루션을 dilutes으로 두 번 원하는 최종 농도에서 준비 된다. 로 agarose 냉각, 그것은 25 µ m 직경 microgel는 작은 물방울의 구형 볼륨 점령으로 굳은 것 이다.
일련의 세척 및 세포 단계 정화 microgels (그림 2B)에 높은 분자 무게 genomic DNA. 속보는 유화 액, 후 수성 세척 추적 밖으로 다운스트림 효소 치료를 억제할 수 있는 유기 용 제 희석 큰 볼륨에서 수행 됩니다. 씻어 microgels 셀 캡슐화 속도 (그림 4A) 확인을 현미경으로 관찰 된다. 광범위 한 용균성 활동 효소 칵테일 박테리아와19진 핵 미생물 세포 벽을 소화 microgel 서 스 펜 션에 추가 됩니다. 세제 성분을 K와 두 번째 치료 단백질을 저하 하 고 세포 파편을 solubilizes.
순화 된 DNA의 Tagmentation microgels18사이 작은 tagmented DNA 파편의 확산에서 발생 하는 잠재적인 상호 오염을 피하기 위해 방울에서 수행 됩니다. 드롭릿 캡슐화 장치 (그림 3B) 동시에 또한 "태그" 그것은 사전 로드 된 oligonucleotide20동안 이중 가닥 DNA를 조각 버퍼 및 tagmentation 효소와 함께 각 microgel compartmentalizes. microgels 가까운 포장 입자, 캡슐화 요금 1 microgel 모든 드롭 몇 남자21 (그림 4C)에 대 한 접근 달성으로 작은 물방울에 로드 됩니다.
미세 워크플로 (그림 2C)의 마지막 단계에서 장치 바코드 1 방울, 1 microgel-포함 된 드롭 및 제어 2 단계 과정에서 증폭 혼합 결합 하는 이중 합병 작업을 수행 합니다. 첫째, PCR 시 약을 포함 하는 작은 물방울 쌍 이며 노란색 (그림 5)에 표시 된 지역에서 바코드 드롭과 병합 합니다. 미세 채널에서 바닷물 전극 높은 전기 분야 그라데이션 방울 합병 트리거를 생성 합니다. 비슷한 방식으로, 첫 번째 병합 된 물방울 microgel 물방울와 결합 이며 빨간색으로 표시 된 지역에서 두 번째 시간을 병합. 방울 수집 되 고 열 순환 단일 중첩 확장 (SOE) PCR 칩. 바코드와 tagmented genomic DNA의 겹치는 보완 끝 퓨전만 제대로 바코드 구문 지 수 증폭을 허용합니다.
시퀀싱 데이터는 먼저 읽기 품질에 의해 필터링 하 고 그들의 15-bp 단일 셀 바코드 순서 대로 읽기를 그룹화 하 여 구문 분석. 유효 바코드 그룹, 그것은 읽기;의 최소 수 있어야 이 임계 처리 분석 시퀀싱 데이터의 유용한 금액에 포함 된 셀을 제한 하 고 데이터 집합에서 PCR 돌연변이 바코드 "고아"를 제거 합니다. 이 샘플을 실행, 최소 그룹 당 7.5 kbps 설정 됩니다 (150의 50 읽기 혈압 각). 그룹 크기를 비교 하는 바코드의 히스토그램 유효한 바코드 그룹의 중요 한 부분 (그림 6A) 임계값 크기 보다 큰 표시 합니다.
제어 실험 미생물 커뮤니티 구성 알려져 있다, 순도 관계 되는 풍부 통계 SiC seq 실행의 품질을 평가 하 데 사용 됩니다. 여기, 3 그람 음성 박테리아, 5 그람 양성 박테리아 및 효 모 2의 구성 된 합성 10 셀 커뮤니티 분석 이다. 주어진된 바코드 그룹의 순도 읽기 읽기 그룹에서의 총 수로 나눈 그룹에 가장 일반적인 게놈에 수로 정의 됩니다. 바코드 그룹의 대부분 순도 0.95 (그림 6B) 보다 더 큰 있다. 세포 유형의 관계 되는 풍부는 원시 읽기를 계산 하 여 고 어디 그룹에 해당 하는 셀 형식을에 할당의 회원 읽기 (그림 6 c)의 합의 바코드 그룹을 계산 하 여 계산 됩니다. 읽기 및 바코드 그룹의 풍부는 대략 동등한 비율, 특정 종 어울리지 않게 작거나 큰 바코드 그룹에 포함 되지 않은 그런 세포 인구를 샘플링 되는 나타내는에 추적 합니다. 플로팅 단일 종에서 모든 바코드 그룹의 집계 범위 전체 게놈 몇몇 또는 강하 영역 (그림 7)에 걸쳐 높은 범위를 나타냅니다. 범위의 균일 정규화 된 범위 값, 평균을 중심으로 대부분의 값의 주파수 분배로 확인할 수 있습니다 (그림 7, 삽입).
그림 1 : 사진 평판에 의해 미세 소자의 제조. (A) 마스터 금형 단일 기능 높이 스핀 코팅의 실리콘 웨이퍼에 감광 제 수-8 층에 의해 조작. 포토 레지스트는 다음 photolithographic 마스크와 UV 빛, 가교 노출된 수-8 꽃무늬. 마지막으로, uncrosslinked SU-8 개발자 욕조에 녹입니다. 결과 형 완전 한 미세 장치를 생산 하는 유리 슬라이드에 접착 되는 PDMS를 캐스팅 하는 데 사용 됩니다. (B) 더블 레이어 장치 제조 마찬가지로 스핀 코팅 및 노출 단계 시작. 이러한 단계는 다음 2 층 장치를 만드는 반복 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 의 SiC seq 워크플로 개요. (A) A 미생물 현 탁 액은 microgels에 있는 단일 셀을 캡슐화 하는 dropmaker 장치에 녹은 agarose와 공동 흐른. (B)는 microgels 세균성 게놈 DNA를 정화 세척의 시리즈를 받게 됩니다. 용균성 효소 그람 양성 박테리아와 효 모의 세포 벽을 소화 하 고 세제 solubilizes 세포질 파편. microgels 경우 다시 상호 오염을 줄이기 위해 tagmentation에 대 한 작은 물방울으로 캡슐화 됩니다. (C) 미세 합병, 결합 한 디지털 PCR 바코드 tagmented microgel 게놈 그리고 비율로 증폭 믹스 > 1 kHz. 오프 칩 SOE-PCR tagmented 게놈에 독특한 단일 셀 바코드를 결합 하 고 선택적으로 증폭 하 고 완전히 바코드 구문. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Dropmaking 및 microgel 다시 캡슐화에 대 한 미세 장치. (A)이이 패널 공동 흐름 dropmaker (기능 높이의 25 µ m)를 보여줍니다. 셀 및 녹은 agarose 25 µ m x 25 µ m 접합점에서 25 µ m 방울을 생산 하기 위해 동일한 흐름 속도에서 장치에 소개 된다. 디지털 바코드 dropmaking 셀 입구 연결 및 PCR 혼합은 agarose 입구에 도입. (B)이이 패널 microgel 다시 캡슐화 장치 (기능 높이의 25 µ m)를 보여 줍니다. microgels 25 µ m x 30 µ m 교차점에서 다시 캡슐화 하기 전에 tagmentation 믹스의 볼륨을 유지 하는 그들의 가까운 포장 주문 깔때기 모양의 입구에 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 작은 물방울 및 microgels의 현미경 사진. (A)이이 패널 표시 효소 세포 전에 25 µ m microgels 세척 합니다. 박테리아는 붙일 캡슐화 속도의 정량화에 대 한 스테인드. 푸아송 로드 통계 지시 10에 1 방울의 속도로 캡슐화 또는 다중 캡슐화 이벤트의 빈도 최소화 하기 위해 적은 셀 이어야 합니다. (B)이이 패널은 25 µ m 디지털 바코드 작은 물방울 핵 산 얼룩으로 대우의 형광 현미경 이미지를 보여 줍니다. 방울 증폭된 바코드 파편을 포함 하는 강한 형광 신호를 생성 합니다. (C)이이 패널 microgels 다시 50 µ m에서에서 캡슐화를 보여줍니다. microgels의 가까운 패킹 캡슐화 요금 몇 남자와 드롭 당 1 젤을 접근 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 단일 셀 게놈 바코드에 대 한 미세 이중 합병 장치. 2 단계 합병 작업 쌍 높은 처리량에서 tagmented 유전자와 바코드 방울. PCR 혼합의 물방울은 처음 생성 하 고 바닷물 전극을 사용 하 여 노란색으로 표시 된 지역에서 바코드 드롭릿와 합병. 다음으로 microgel를 포함 하는 작은 물방울 소개 이며 빨간색으로 표시 된 지역에서 두 번째 시간을 병합. 오일 후미 reinjected 방울 사이의 간격의 정확한 제어를 위한 수 있습니다. 바코드 reinjection 챔버와 스페이서 석유 파란색에서 음영 짧은 25 µ m 계층에 배치 됩니다. 다른 모든 장치 기능 전체 높이의 45 µ m로 두꺼운 층에 속한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 10 셀 합성 미생물 지역 사회에 대 한 바코드 그룹 메트릭. (A)이이 패널 그룹 크기는 바코드의 분포를 보여줍니다. 주어진된 크기의 그룹 수가 그룹 크기가 증가 함에 따라 기 하 급수적으로 감소합니다. 그룹 당 7.5 kbps의 최소 임계값 제한 충분 한 양의 정보를 가진 그룹을 분석 하 고 PCR 돌연변이 시퀀스 "고아"를 제거 합니다. (B)이이 패널에서 그룹 순도 바코드의 분포를 보여줍니다. 대부분 (> 90%)은 매우 높은 순도의 그룹의 (> 95%). (C)이이 패널 읽기 및 바코드 그룹 수준에서 계산 하는 10 종의 관계 되는 풍부를 보여준다. 계산 방법 2 바코드 그룹 크기 종에 걸쳐 일관성 있는 지를 나타내는 비슷한 결과 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 집계의 게놈 범위 새 균의 subtilis 바코드 그룹. B. subtilis 박테리아를 모든 바코드 그룹에서 읽기 (N = 9,398)는 풀링된 및 집계에서 분석. 원형 범위 지도 SiC seq 읽기 없이 관찰 강하 지역의 범위 균일성을 보여 줍니다. 파선 둘레는 평균 범위를 나타냅니다 (5.55 x). 상대 범위 주파수의 인세트 히스토그램 표시 기초의 대량 게놈 넓은 평균 근처 깊이에서 커버는 점선으로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 장치 | 1 층 높이 (µ m) | 1 레이어 회전 속도 (rpm) | 2 층 높이 (µ m) | 2 레이어 회전 속도 (rpm) |
| 공동 흐름 dropmaker | 25 | 4000 | N/A | N/A |
| 젤 재 encapsulator | 25 | 4000 | N/A | N/A |
| 이중 합병 | 25 | 4000 | 20 | 5000 |
표 1: 미세 장치 제조 매개 변수. 이 표에서 감광 스핀 코팅에 대 한 그들의 필요한 속도와 SiC seq 워크플로 (3025 SU-8에 대 한 제조업체의 사양에 따라)에 사용 되는 미세 장치 목록을 보여줍니다.
| 레이블 | 시퀀스 (5' > 3') | ||||
| 바 | GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT | ||||
| DNA_BAR | CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA | ||||
| P7_BAR | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG | ||||
| P5_DNA | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC | ||||
| I7_READ | GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA | ||||
표 2: 뇌관 시퀀스.
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보조 파일 2: 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
SiC-seq 미세 워크플로 세균성 세포의 수천에서 단일 셀 게놈 시퀀싱 데이터를 생성합니다. Microgel-캡슐화 된 세포의 유전자에 접합 하는 디지털 바코드는 철에 deconvolution NGS 데이터의 바코드 읽기 같은 셀에서 발생의 그룹으로 허용 합니다. 알려진된 구성의 미생물 지역 사회와 함께 제어 실험은 바코드 그룹의 순도 평가 하는 데 필요 합니다. 저 순도 그룹의 큰 분수 셀 캡슐화 속도가 너무 높습니다 하거나 중요 한 물방울 교차 오염을 미세 처리 단계 동안 발생 하는 나타냅니다. 통계에 따르면 푸아송, 바코드와 셀 모든 비어 있지 않은 물방울의 5% 미만에 다중 캡슐화 이벤트의 속도 제한에 모든 10 드랍 스에 대 한 1 입자의 대상 비에 캡슐화 한다. Dropmaking 과정에서 캡슐화 비율의 확인은 매우 중요 하므로 이것 보다 더 높은 요금을 캡슐화 기 하 급수적으로, 남자의 속도 증가 시킵니다. 사용자가 읽기 같은 바코드 순서를 공유 하는 다른 세포에서 분리 된 bioinformatically 수 없습니다 하기 때문에 단일 microgel에 여러 셀의 캡슐화의 특히 신중 해야 합니다. 경우에는 1 셀 수신 2 다른 바코드, 바코드 그룹 순수성 비록 풍부한 통계는 비뚤어진 바코드 시퀀스에 의해 계산 하는 때 영향을 받지 않습니다.
드롭릿 교차 오염 또한 차선 합병 조건으로 인해 발생할 수 있습니다. 성공적인 작업 중 미세 합병 장치 (그림 5) 1 microgel와 1 바코드 물방울과 PCR 시 약의 볼륨 controllably 쌍 수 있습니다. 비-이상적인 흐름 속도 잘못 된 비율에서 쌍 방울 귀 착될 것 이다: 1 바코드 예 2 microgels와 결합 수 있습니다. 프로토콜에 나열 된 모든 흐름 율 추정 될 것입니다 그리고 장치 형상과 방울 크기에 약간의 변화에 따라 조정 해야 할 수 있습니다. 고속 녹화 기능으로 카메라에 액세스할 수 있는 사용자 (> 10000 프레임/s) 시작 및 미세 작업의 과정을 통해 올바른 드롭릿 합병을 확인 해야 합니다. 고속 카메라에 액세스 하지 않고 사용자가 병합 된 출력의 작은 볼륨을 수집 하 고 수동으로 측정 현미경으로 작은 물방울 크기 수 있습니다. 작은 물방울 크기 균일 해야: 병합 되지 않은 바코드 또는 microgel 상품의 초과 나타냅니다 reinjection 요금 따라 감소 되어야 한다.
몇 가지 일반적인 예방 조치 취해야 한다 microgels와 microdroplets를 처리 하는 때 그들의 무결성을 유지 하. Microgels, 비록 기계적으로 강력 하 고, 해야 될 충분히 냉각 침입 및 완전 한 겔 화 되도록 조치를 세척 하기 전에. 비 구형 microgels는 표시는 agarose을 강화 하기 위해 충분 한 시간을 주어진. Microgels 세척 할 경우 제품의 손실을 방지 하기 위해 필요한 속도에서 정지 아래로 회전 합니다. Agarose 히드로 밀접 하 게 일치는 물의 굴절률 있으며 사용자가 신중 하 게 포부 전에 젤-액체 경계를 식별 해야 하므로 튜브22볼 하기 어려울 수 있습니다. 물에 기름 방울 정적 세력23 실험실 장갑과 튜브에의 하 여 접착을 따르게 됩니다. 이러한 이유로, 맨 손으로 물방울 reinjection 주사기를 로드 하 고 모든 reinjection 라인 펌프 못쓰게 하기 전에 정전기 방지 총을 치료 하는 것이 좋습니다. 큰 병합된 방울 주사기에 유화 액을 천천히 회전 하 고 수동으로 그들의 더 큰 부 력 힘 때문에 위쪽에 축적 큰 방울을 발음 하 여 제거할 수 있습니다.
SiC-seq는의 단일 셀 게놈 시퀀싱을 보여 주기 위해 첫 번째 기술 > 50000 세균성 세포. 이 플랫폼 기존 접근에 비해 처리량에 상당한 이점을 제공 하 고 이기종 미생물 커뮤니티의 깊은 샘플링을 수 있습니다. 날짜 하려면, 단일 셀 게놈 시퀀싱에 대 한 미세 기술 microchambers9 와 microwells24 셀 절연 및 증폭, 하지만 처리량만 수십 수백 개의 셀의 범위에서 고용 했다. Wellplates5,6 으로 단일 셀의 흐름 정렬 없음 특수 미세 계측을 필요 하지만 마찬가지로 낮은 처리량을 소유한 다. 토양 및 물 샘플 환경에서 일반적으로 있다의 알파 다양성을 감안할 때 > 종에 1, 000 레벨25,26, SiC seq 생물의 훨씬 더 큰 수를 샘플링 하는 기능 덕택으로 매우 유리 하다. SiC-seq 워크플로 실험실 문화, 자연 환경 또는 생활 호스트에서 셀 입력을 적응할 수 있습니다. 셀 샘플 필요만 수성 현 탁 액 및 큰 입자의 무료 (> 10 µ m) 미세 캡슐화에 대 한 적합 하다. 예를 들어 메서드는 세척의 시리즈를 사용 하 여 및 캡슐화17이전 셀을 전처리 하는 단계를 필터링 해 수의 샘플에 이전 적용 되었다.
SiC-seq 프로토콜 각 단일 셀에서 시퀀싱 데이터의 상대적으로 부족 한 금액을 생성 하 고 모든 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 전화 드 노 보 게놈 어셈블리 또는 단일 뉴클레오티드 변종 (SNV) 같은 생물 정보학 알고리즘 일부 높은 범위 깊이 효과적으로 작동 하려면 필요 합니다. 대신, 바코드 그룹은 클러스터 된 철에 의해 분류학 범주화 방법27 알고리즘 읽기의 큰 세트에 적용 될 수 있도록 수 있습니다. SiC-seq 워크플로의 상대적으로 낮은 전반적인 barcoding 효율성 또한 입력된 샘플의 가용성 낮은 경우에서 과제를 선물 수 있습니다. SiC-seq 포아송 분포 바코드 캡슐화 단계에 의존, 따라서 세포의 약 10% 분자 바코드를 받을 마지막 라이브러리 준비 단계 중에 증폭 됩니다. 이것은 다른 microdroplet 기반 바코드 제도10, 소중한 셀 샘플을 사용 하는 사용자가 시퀀싱에 대 한 적절 한 라이브러리 수익률을 달성 하는 어려움이 있을 수 있습니다. 고 마지막에 PCR 사이클의 수를 늘려야 할 수 있습니다. 증폭 단계입니다. 미세 전문 기술 사용자를 위한 또 다른 잠재적인 솔루션 디지털 PCR 단계, 따라서 전체 바코드 효율 가져온 후 긍정적인 바코드 방울을 정렬 하는 > 8528.
SiC-seq 기술에 대 한 잠재적인 미래 방향을 새로운 임상 연구는 단일 셀에 대 한 방법을 포장 하는 포유류 세포와 함께 사용 하기 위해 워크플로 적응 이다. 예를 들어, 단일 암 중 복사 번호 유사의 분석 5 월 세포 암 병 리2에서 성분의 역할에 대 한 우리의 이해를 더. 또는 관심29 의 DNA 시퀀스를 풍부 하 게 조사 하는 기존의 방법 SiC-seq를 통합 모집단의 대상으로 단일 셀 시퀀싱 또는 셀의 희귀 한 변종 사용할 것. 환경 샘플, 알려진된 신진 대사 통로 내에서 유전자는 대상 고 소설 게놈 제도 식별 하는 유전자를 이웃과 함께 콘텐츠 분석 될 수 있습니다. 인간의 호스트 환경 내에서 낮은 titer 병원 성 박테리아 샘플 격리 될 수 있습니다 및 더 많은 검사를 단일 세포 수준에서 밀접 하 게 시퀀싱 독성의 genotypic 그들의 기원.
Disclosures
이에 관련 된 특허 수 있습니다 주주 이다 임무 바이오는 아담 R. Abate의 허가.
Acknowledgments
이 작품 경력 수상 (DBI-1253293 번호 부여);를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 국립 보건원 (NIH) (보조금 번호 HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); 그리고 방위 고급 연구 프로젝트 기관 생활 파운드리 프로그램 (계약 번호 HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3025 photoresist | Microchem | 17030192 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| Degassing chamber | Bel-Art | 42025 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
| Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| Space heater | Lasko | CD09250 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
| TE (10X) | Rockland | mb-007 | |
| PBS 1X, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-65083 | |
| OptiPrep (density gradient medium) | Sigma-Aldrich | d1556 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Lysozyme Type IV | MP Biomedicals | 195303 | |
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Zymolyase (yeast lytic enzyme) | Zymo Research | e1004 | |
| Lysostaphin | Sigma-Aldrich | L7386 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl, pH 7.5, 1M | Invitrogen | 15567-027 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Teknova | d9750 | |
| Lithium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L9781 | |
| Proteinase K | New England Biosciences | P8107S | |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Koptec | V1001 | |
| SYBR Green I (nucleic acid stain) | Invitrogen | S7563 | |
| PEG 6k | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Nextera DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-121-1030 | |
| Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) | New England Biosciences | m05365 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) | New England Biosciences | m0538m | |
| NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) | Illumina | FC-131-1024 | |
| Cold cathode fluorescent inverter | (custom) | (custom) | |
| DC power supply | Mastech | HY1503D | |
| Zerostat 3 anti-static gun | Milty | 5036694022153 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 |
References
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