Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Encelliga sekvensering avslöjar genotypisk heterogenitet i biologiska system, men nuvarande teknik saknar genomströmning nödvändigt för djupa profilering av gemenskapens sammansättning och funktion. Här, vi beskriver en mikroflödessystem arbetsflöde för sekvensering > 50.000 encelliga genomen från olika cell populationer.

Abstract

Sekvensering teknik har genomgått ett paradigmskifte från bulk encelliga resolution som svar på en växande förståelse av cellulära heterogenitet roll i biologiska system. Dock har encelliga sekvensering av stora populationer hämmats av begränsningar i bearbetning genomen för sekvensering. I detta papper beskriver vi en metod för encelliga Genomsekvensering (SiC-seq) som använder droplet-mikrofluidik att isolera, förstärka och streckkod genomen hos enstaka celler. Cell-inkapsling i microgels tillåter konkurrensbetingat rening och tagmentation av DNA, medan en mikroflödessystem fusion par effektivt varje genomet med en unik encelliga oligonukleotiden streckkod, så att > 50.000 enstaka celler till sekvenseras per körning. Sekvensering data är demultiplexed av streckkod, generera grupper av läsningar med ursprung från enstaka celler. Som en hög genomströmning och låg-bias metod av encelliga sekvensering aktiveras SiC-seq ett bredare spektrum av genomisk studier inriktade på olika cellpopulationer.

Introduction

Genomet serverar en blåkopia av cellulära identitet och funktion, som innehåller helheten av en organism kodning potential. Förståelse för Cellbiologi på nivån genomet kan förklara den observerade fenotypiska mångfalden inom heterogen cellpopulationer. Denna heterogenitet i biologiska system och har bred konsekvenser för människors hälsa och sjukdom. Till exempel är genen kopia antalet variationer bland tumörceller kopplade till utvecklingen och spridningen av cancer1,2. I bakteriella infektioner, patogenicitet öar i en liten del av arvsmassan kan överföras horisontellt och leda till spridning av antibiotikaresistenta bakterier3,4. En primär utmaning i att studera arvsmassan på enskild cell nivå är de låga mängder DNA tillgängliga, samt behovet av att analysera tusentals celler för att prova hela mångfalden av genotyper. Av dessa skäl har begränsningarna i experimentella genomströmning hindras effektiviteten av encelliga studier, förspänns resultaten mot de vanligast förekommande cellerna. Enskild cell isolering tekniker såsom flöde sortering5,6, optisk pincett7, ingjutning i bulk geler8och mikrofluidik9 är kan bearbeta hundratals celler för sekvensering; Detta utgör dock bara en bråkdel av de flesta prover. En metod för encelliga Genomsekvensering med betydligt högre dataflöde skulle möjliggöra djupare och mer komplett profilering av cellpopulationer, därmed belysa rollen av genotypisk mångfald inom dessa samhällen.

Droplet-mikrofluidik möjliggör hög genomströmning manipulation av celler och biologiska reagenser inom miljontals picoliter-skala reaktorer. Hittills har microdroplet teknik har använts för att studera differentiell uttrycksmönster bland celler från heterogena vävnader10,11,12, djupt sekvens långa molekyler13,14 ,15, och beteende kromatin immunoprecipitation sekvensering (ChiP-seq) analyser på enstaka celler16. Faktiskt klarar microdroplets hög genomströmning och konkurrensbetingat verksamhet, vilket gör dem mottagliga för applikationer i encelliga genomik. Utvecklingen av denna teknik presenterar sin egen unika tekniska utmaningar, emellertid. Cellerna måste vara lyserat, renat och förstärks med minimal bias, att jämnt prov cellpopulationer. Dessutom, till skillnad från polyadenylated mRNA avskrifter i däggdjursceller finns det ingen jämförbar molekylär motiv i genomet att underlätta tillfångatagandet av den mål-nukleinsyra. Av dessa skäl, har encelliga Genomsekvensering varit svår att genomföra i microdroplet plattformar.

I detta arbete ger vi ett detaljerat protokoll av vår tidigare rapporterade encelliga mikroflödessystem strategi kan sekvensering genomen hos tiotusentals cellerna i en enda experiment17. Med denna teknik, som kallas SiC-seq, bakterieceller kapslas in i micron-skala hydrogels och individuellt lyserat, tagmented, och samman med en microdroplet som innehåller en unik oligonukleotiden streckkod, som är skarvas på cellens genomiskt DNA via en enda överlappning förlängning polymeras-kedjereaktion (PCR). Hydrogels fungera som isolerade behållare där hög molekylvikt genomiskt DNA är koalisera inkapslad, vilket gör att mindre molekyler såsom rengöringsmedel och lytisk enzymer för att komma åt och rena DNA innan streckkodning18. Detta protokoll bearbetar > 50.000 enstaka celler i några timmar, vilket resulterar i ett barcoded bibliotek redo för sekvensering. Efter sekvenseringen är läser demultiplexed enligt deras encelliga streckkod sekvens, vilket resulterar i en datamängd som består av miljontals läser, var och en med en cellulär index.

Protocol

1. mikroflödessystem enhet Fabrication

  1. Förbereda mikroflödessystem mask mönster med hjälp av datorstödd konstruktion (CAD) programvara (som. DWG; Se Kompletterande filer). Har dessa mönster tryckt av leverantören med en serien,max.10 µm upplösning på en film från kretskortet.
    Obs: För flerskikts mikroflödessystem enheter, motsvarande masker innehåller alignment marks.
  2. För varje enhet, fabricera SU-8 master mögel (figur 1A) enligt följande.
    1. Förbered en 3 - in diameter kisel wafer genom att hälla ca 1 mL av SU-8 3025 fotoresist på mitten av rånet. Säkra rånet på den spin coater chuck genom att tillämpa sug.
    2. Se tabell 1 för en förteckning över skikttjocklekar och snurra hastigheter för varje enhet. För alla enheter, börja snurra beläggning med 30 s vid 500 rpm, följt av 30 s vid den angivna hastigheten.
    3. Ta bort SU-8-kisel rånet från spin coater och mjuk baka den på en värmeplatta som anges till 135 ° C i 30 min. tillåta rånet svalna till rumstemperatur efter bakning.
    4. Utsätta SU-8-kisel rånet med lämpliga mikroflödessystem mask under en kollimerad 190-mW, 365-nm UV LED för 3 min.
    5. Efter exponering, hårt Grädda rånet på en värmeplatta som anges till 135 ° C i 1 min. Efter detta bakning steg, tillåta rånet svalna till rumstemperatur.
    6. För ett enda lager mikroflödessystem enheten, hoppa till steg 1.2.7. För en flerdimensionell mikroflödessystem enhet, upprepa steg 1.2.1 - 1.2.5 för det andra lagret av fotoresist (figur 1B).
    7. Efter den första hårda bakar för ett enda lager enhet (eller de andra hårda Grädda i en flerdimensionell enhet), utveckla rånet genom nedsänkning i ett bad av propylenglykol monometylfumarat eter acetat (PGMEA) för 30 min.
    8. Efter rånets utveckling, Använd en sprutande flaska innehållande PGMEA för att skölja rånet. Skölj sedan rånet med en sprutande flaska som innehåller isopropanol innan du placerar den på en 135 ° C värmeplatta för 1 min torka.
    9. Placera rånet (hädanefter benämnd som master) i en petriskål för gjutning med Polydimetylsiloxan (PDMS).
  3. Med master bereddes i steg 1.2, fortsätta att utföra enhet tillverkning med en PDMS gjutning.
    1. Förbereda PDMS genom att kombinera en silikon bas med en härdare i ett 11:1-förhållande av massan. Blanda silikon bas och härdare för hand med en uppståndelse pinne.
    2. Avlufta PDMS genom att placera det i en avgasning kammare och tillämpa ett vakuum. Tillåta PDMS att Avlufta tills luftbubblor inte längre synliga (normalt 30 min).
    3. Häll försiktigt den avgasade PDMS över befälhavaren, till en slutlig PDMS-skiktets tjocklek ca 5 mm. Degas i PDMS igen för att se till att avlägsna eventuella luftbubblor.
    4. Efter den avgasning, grädda PDMS och befälhavaren vid 80 ° C för 80 min.
    5. Noggrant punktskatt härdade PDMS plattan från bakad master med ett rakblad. Se till att alla styckningsdelar ovanpå kisel rånet.
      Obs: Några nedskärningar av kisel rånet kan resultera i en läpp som hindrar en enhetlig bindning.
    6. Punsch i vikar och försäljningsställen med en 0,75 mm biopsi punch. Ta bort damm och herrelösa PDMS med en förpackning tejp på funktionen sida av enheten.
    7. Före plasma behandling av enheten, rengöra en 50 x 75 mm glasskiva genom att skölja det med isopropanol och torka.
    8. För plasmabehandling, placera PDMS platta och glas bilden till den plasma bonder med funktioner vänd uppåt. Utföra plasmabehandling med 1 mbar O2 plasma för 1 min. Bond enheten till glas Skjut genom att föra de exponerade, eller möta upp, sidorna tillsammans.
    9. Efter plasmabehandling, grädda enheten vid 80 ° C i 40 min.
    10. Slutligen, injicera glas ytbehandling vätska i en av öppningarna att återge mikroflödessystem kanalerna hydrofoba. Se till att alla kanaler är helt översvämmad med lösningen och Upprepa injektionen för varje dropmaker. Grädda behandlade enheten vid 80 ° C i ca 10 min att avdunsta lösningsmedel.

2. inkapsling av celler i agaros Microgels

Obs: Se figur 2A.

  1. Laga 1 mL 3% w/v låg-smältande temperatur agaros 1 x Tris-EDTA (TE)-buffert. Förvara agaros lösningen på en 90 ° C värme block förrän omedelbart före sprutan lastning.
  2. Förbered cellsuspensionen.
    Obs: Detta protokoll och dess associerade mikroflödessystem enheter har validerats för att arbeta med bakterieceller, antingen från ett fryst lager eller färska preparat. Däggdjursceller, beroende på celltyp av, kan kräva en justering av mikrofabricerade kanal dimensioner passar de större cell storlekarna.
    1. Att resuspendera cellerna i 1 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    2. Räkna cellerna i en hemocytometer eller av flöde sortering. För 25 µm microgels med en cell inkapsling målsatsen av 1 på 10, förbereda 1 mL cellsuspension med en slutlig koncentration på 2.4 x 107 celler/mL.
    3. Snurra cellerna ner vid 3 000 x g i 3 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL av 17% v/v täthet lutning medium (se Tabell för material) i PBS. Hålla det på is tills sprutan lastning.
  3. Läsa in en 3-mL spruta med fluorerade olja (HFE) som innehåller en 2% w/w framställa-polyetylen glykol (PFPE-PEG) tensid, passar det med en 27 G nål och placera det i en sprutpump.
    Obs: Passar alla sprutor med en 27 G nål för mikroflödessystem steg i detta protokoll. För att minska risken för oavsiktlig prickning, hålla caps på alla nålar tills pumpen operationen börjar.
  4. Ladda cellsuspension och smälta agarosen till 1 mL sprutor, passa både med 27-gauge nålar och placera dessa i sprutpumpar.
  5. Värma agaros sprutan och pump med en liten nattuppvärmare att förhindra Agarens gelbildande i sprutan och inlopp slangar. Inställd nattuppvärmare på hög och placera den så att värme yta är ca 10 cm bort från sprutan. Se till att temperaturen mäts på sprutan är cirka 80 ° C.
    Obs: Användare uppmanas att behålla värmaren på rekommenderade avstånd från pumpande apparaten för att minska risken för skada på utrustningen, inklusive smältning av slangen.
  6. Generera 25 µm mild mikrogel skyddas droppar med samtidig flöde dropmaking enheten.
    Obs: Se figur 3A för en enhet som är Schematisk som anger platsen för de reagens inlopp och utlopp.
    1. Anslut sprutan nålar till mikroflödessystem enhet öppningarna med hjälp av bitar av polyetylen (PE) slangar. Innan du sätter rören i enheten, prime pumparna för att ta bort luft från linjen.
    2. Ansluta en bit av slangen till utlopp och placera den fria änden i en 15 mL collection tube.
    3. Använda de följande (rekommenderas) flödena för dropmaking: 800 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG; 200 µL/h för cellsuspensionen i PBS; och 200 µL/h för de 3% w/v agarosen.
  7. Efter dropmaking, placera samling röret vid 4 ° C i 30 min att säkerställa den komplett gelation Agarens.

3. att bryta och tvättning av agaros Microgels

  1. Ta bort det lägsta skiktet av olja från samling röret med en 3 mL spruta med en 20 G nål, noga med att inte störa det översta lagret av agaros droppar.
  2. Bryta emulsioner med perfluorooctanol (PFO).
    1. Tillsätt 1 mL 10% v/v PFO i HFE till agaros dropparna. Pipettera denna lösning upp och ner för 1 min att noggrant belägga emulsioner.
      Obs: För alla den mild mikrogel skyddas tvätta steg, Pipettera lösningarna med 1000 µL spets. Mild mikrogel skyddas suspensionen ska visas homogena och fri från klumpar efter pipettering det.
    2. Snurra koniska röret vid 2000 x g i 1 min att samla agaros microgels. Ta bort PFO/HFE supernatanten genom aspiration; microgels är nu fri från sina ytaktiva skiktet och visas tydligt.
  3. Tvätta microgels med ett ytaktivt ämne i hexan.
    FÖRSIKTIGHET: Hexan är flyktiga organiska lösningsmedel, och tvätten i steg 3.3 bör utföras i dragskåp.
    1. Tillsätt 2 mL av 1% v/v sorbitan monooleate icke-jonaktivt ytaktivt ämne (se Tabell för material) i hexan till agaros microgels. Pipettera upp och ner 10 x att blanda, att säkerställa komplett upplösningen av den mild mikrogel skyddas pellet.
    2. Snurra röret vid 1 000 x g för 1 min att samla microgels. Aspirera supernatanten för att ta bort ytaktivt ämne/hexan lösningen.
    3. Upprepa ytaktivt ämne/hexan tvätten.
  4. Tvätta microgels i en vattenlösning buffert att ta bort eventuella kvarvarande organiska lösningsmedel.
    1. Tillsätt 5 mL av TET buffert [0,1% v/v oktylfenol ethoxylate Nonjonaktivt rengöringsmedel (se Tabell för material) i 1 x TE] till konisk röret. Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    2. Snurra koniska röret vid 2000 x g i 2 min att samla microgels. Aspirera supernatanten för att ta bort TET bufferten.
    3. Upprepa TET tvätta 2 x.
    4. Tillsätt 5 mL av 1 x TE buffert till konisk röret. Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    5. Snurra koniska röret vid 2000 x g i 2 min att samla microgels. Aspirera supernatanten för att ta bort TE bufferten.
    6. Upprepa TE tvätten.
  5. Verifierar cell inkapsling i microgels under ett Mikroskop vid 400 X förstoring av färgning en 10 µL alikvot av geler med 1 x nukleinsyra fläcken (se Tabell för material).
    Obs: Microgels visas tydligt under den transparenta kanalen medan cell DNA kommer fluorescerar under kanalen GFP (497/520 nm excitation/utsläpp våglängder). En överlagring av transparent och fluorescerande kanaler visar cellerna i microgels som visas i figur 4A.

4. lys av celler i agaros via lytisk enzymer

  1. Förbereda 1 mL av en lytisk enzym cocktail med 800 µL av TE buffert (1 x), 2 µL av jäst lytisk enzym (5 U/µL lager, 10 U/mL slutlig), 30 µL av Ditiotreitol (1 M lager, 30 mM slutlig), 60 mg lysozym (frystorkat pulver), 15 µL av EDTA (0,5 M lager 7.5 mM slutlig), 2 µL av mutanolysin (100 U/µL lager, 200 U/mL slutlig), 2 µL av lysostaphin (10 U/µL lager, 20 U/mL slutlig) och 30 µL av NaCl (1 M lager, 30 mM slutlig).
  2. Lägga till ytterligare TE för att få volymen till 1 mL. Blanda lösningen av vortexa.
  3. Tillsätt de hela 1 mL av lytisk enzym lösningen till mer än 1 mL av den tvättade microgels. Blanda genom pipettering 10 x. Inkubera vid 37 ° C i blandningen > 2 h i en shaker (maximal är natten inkubation).

5. diskmedel-baserade mild mikrogel skyddas behandling

  1. Efter Lys via lytisk enzymer (steg 4), tvätta microgels.
    1. Snurra ner microgels vid 2000 x g i 2 min och Aspirera supernatanten. Droppar visas ogenomskinlig vit på grund av cellfragment dispergerade i pelleten.
    2. Återsuspendera microgels i 5 mL 10 mM Tris-HCl buffert och Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    3. Blandningen ner vid 2000 x g i 2 min och sedan ta bort supernatanten genom aspiration.
  2. Utföra en rengörande behandling på microgels.
    1. Återsuspendera gelerna i ett litium dodecyl sulfate (lock) lyseringsbuffert (0,5% w/v lock i 20 mM Tris-HCl) och 60 µL 0,5 M EDTA till en slutlig volym av 3 mL.
    2. Tillsätt 5 µL av en proteinas K enzym (800 U/mL lager). Pipettera upp och ner 10 x att blanda, inkubera sedan blandningen vid 42 ° C på en värme block för 1 h solubilize cellmembranen och smälta proteiner.
  3. Efter tvättmedel behandling, tvätta microgels.
    1. Snurra den koniska rör med microgels ner vid 2000 x g i 2 min. ta bort supernatanten genom aspiration.
    2. Tvätta microgels med 10 mL 2% v/v polysorbat 20 i vatten. Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    3. Koniska röret ner vid 2000 x g i 2 min och sedan ta bort supernatanten genom aspiration.
    4. Tvätta microgels med 10 mL 100% etanol att inaktivera eventuella kvarvarande enzym. Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    5. Koniska röret ner vid 2000 x g i 2 min och sedan ta bort supernatanten genom aspiration.
    6. Tvätta microgels med 10 mL 0,02% v/v polysorbat 20 i vatten. Pipettera upp och ner 10 x att blanda.
    7. Koniska röret ner vid 2000 x g i 2 min och sedan ta bort supernatanten genom aspiration.
    8. Upprepa polysorbat 20 tvätta 3 x. Låt lösningen rinna genom en 100 µm cell SIL före den sista tvättningen bort några stora klumpar.
  4. Återsuspendera microgels i 5 mL 10 mM Tris-HCl buffert att förhindra DNA nedbrytning. Microgels kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka före tagmentation (steg 7).

6. Generera streckkod droppar av Digital PCR

  1. Förbereda ett 500-pM lager av BAR primer (tabell 2) i en 1 x TE buffert i en låg-bind tube. Före varje användning, späd primern till ett fungerande lager av 1 pM och värm det till 70 ° C i 1 min på en värme block.
  2. Förbereda en 150-µL PCR-reaktionsblandning använder 75 µL av HiFi-varmstart master mix (se Tabell för material) (2 x), 42 µL av PCR-grade vatten, 3 µL av DNA_BAR primer (10 µM lager, 0,2 µM slutlig), 3 µL av P7_BAR primer (10 µM lager 0,2 µM slutlig), 6 µL av streckkod utspädning (1 pM lager, 40 fM slutlig), 6 µL av polysorbat 20 (50% v/v lager, 2% slutlig) och 15 µL av PEG 6 k (50% w/v lager, 5% slutlig). Blanda genom pipettering upp och ner 10 x.
  3. Förbered en HFE-backed sprutan genom att dra 200 µL HFE olja i en spruta och passa in den med en nål. Bifoga ett avsnitt av PE slangar till nålen och prime linjen för hand. Infoga i slutet av PE slangen i målet lösningen och noggrant rita alla 150 µL av PCR-mixen i PE slang och spruta. Fyll sprutan i en sprutpump.
  4. Fyll en 1 mL spruta med fluorerade olja (HFE) som innehåller en 2% w/w framställa-polyetylen glykol (PFPE-PEG) tensid, passar det med en nål och placera det i en sprutpump.
  5. Generera 25 µm streckkod droppar med samtidig flöde dropmaking enheten.
    Obs: Se figur 3A för en enhet som är Schematisk som anger platsen för de reagens inlopp och utlopp.
    1. Anslut en samtidig flöde dropmaker enhet med en liten bit av blylod celler inlopp.
    2. Anslut sprutorna laddad med HFE och PCR blanda till mikroflödessystem enhet öppningarna med bitar av PE slang, med Smält agaros inloppet för streckkoden PCR-mix. Innan du sätter rören i enheten, prime pumparna för att ta bort luft från linjen.
    3. Ansluta en bit av slangen till utlopp och placera den fria änden i en 0,2 mL PCR-rör. Använda de följande (rekommenderas) flödena för dropmaking: 600 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG och 200 µL/h för PCR-mixen. Samla droppar in i PCR-rören med ca 50 µL droppar i varje rör.
  6. Efter dropmaking, ta försiktigt bort det nedre lagret av HFE olja från de emulsioner använda gel-lastning Pipettera tips och ersätta det med FC-40 fluorerade olja innehållande en 5% w/w PFPE-PEG tensid. Termisk cykel med följande protokoll: 98 ° C för 3 min, 40 x av (98 ° C för 10 s, 62 ° C för 20 s, 72 ° C under 20 s), 72 ° C i 5 min, och håll sedan vid 12 ° C.
    Obs: Thermal-cyklade droppar kan lagras vid 4 ° C upp till 1 dag.
  7. Verifiera den streckkod förstärkning och inkapsling kursen.
    1. Förbereda en 1 x nukleinsyra fläcken (se Tabell för material) i HFE med en 2% w/w PFPE-PEG tensid; fläcken är marginellt blandbar med HFE och binder till DNA i droppar.
    2. Tillsätt 1 µL av thermal-cyklade streckkod emulsion till 10 µL av färgning olja. Inkubera dem för 5 min i rumstemperatur.
    3. Bild droppar av fluorescerande mikroskopi (GFP kanal, 497/520 nm excitation/utsläpp våglängder) vid 200 X förstoring och räkna andelen streckkod inkapsling. Observera att signalen blir diskret: droppar som innehåller förstärkt streckkoder kommer fluorescerar i ljust, medan den tomma droppar visas mörka (figur 4B).

7. Tagmentation av genomisk DNA i droppar

Obs: Se figur 2B.

  1. Förbereda 500 µL av tagmentation lösningen med reagenser från ett nästa generations sekvensering bibliotek preparat kit (se Tabell för material). Använd 7 µL av tagmentation enzym, 250 µL av tagmentation buffert och 243 µL av PCR-grade vatten. Blanda dem genom vortexa och snurra blandningen ner för att samla. Ladda denna lösning i en HFE olja-backed 1 mL injektionsspruta och passa in den med en nål.
  2. Förbereda microgels för återföring.
    1. Snurra ner mild mikrogel skyddas röret under 2 minuter vid 2000 x g och Aspirera supernatanten. Över 200 µL av geler till toppen av en HFE-backed spruta med gel-lastning Pipettera spets och försegla munstycket med en liten tejpbit.
    2. Med en 3D-tryckt centrifug-adapter (se kompletterande filer 1 och 2), snurra mild mikrogel skyddas sprutan för 3 min vid 3000 x g.
    3. Ta bort flytande supernatanten från sprutan med en gel-lastning Pipettera spets. Tryck mild mikrogel skyddas lagret till basen på sprutan munstycket. Passa sprutan med nål.
  3. Fyll en 3 mL spruta med fluorerade olja (HFE) som innehåller en 2% w/w framställa-polyetylen glykol (PFPE-PEG) tensid, passar det med en nål och placera det i en sprutpump.
  4. Kapsla in microgels åter i små droppar som innehåller tagmentation reagens.
    Obs: Se figur 3B för en enhet som är Schematisk som anger platsen för de reagens inlopp och utlopp.
    1. Anslut de sprutor som innehåller HFE, tagmentation mix och microgels till de mikroflödessystem enhet vikar med hjälp av bitar av PE rör. Innan du sätter rören i enheten, prime pumparna för att ta bort luft från linjen.
    2. Ansluta en bit av slangen till utlopp och placera den fria änden i en tom 1 mL-sprutan med kolven dras till raden 1 mL.
    3. Använda de följande (rekommenderas) flödena för dropmaking: 2 000 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG, 200 µL/h för microgels och 500 µL/h för den tagmentation blandningen.
  5. Verifiera mild mikrogel skyddas inkapsling priset enligt ett ljusmikroskop vid 400 X förstoring. Cirka 80-90% av dropparna bör innehålla en mild mikrogel skyddas, som visas i figur 4 c.
  6. Passar sprutan som innehåller de tagmentation emulsioner med en nål och inkubera det upprätt i en värme block eller ugn för 1 h vid 55 ° C att fragmentera genomisk DNA.

8. single-cell streckkodning genom mikroflödessystem dubbel sammanslagning

Obs: Se figur 2 c.

  1. Förbereda streckkod droppar för sammanslagningen genom att ersätta den FC-40 olja fraktionen med HFE 2% w/w PFPE-PEG. Noggrant överföra dessa droppar i en 1 mL spruta, passar det med en nål och placera det i en sprutpump.
  2. Läsa in ruvade och tagmented mild mikrogel skyddas droplet sprutan i en sprutpump.
  3. Förbereda 500 µL av PCR-mix. Tillsätt reagenserna i följande ordning för att förhindra fällningar bildas: 140 µL av PCR-grade vatten, 10 µL P5_DNA primer (10 µM lager, 0,2 µM slutlig), 10 µL P7_BAR primer (10 µM lager, 0,2 µM slutlig), 50 µL av PEG 6k (50% w/v lager 5% slutlig), 50 µL av polysorbat 20 (50% v/v lager, 5% slutlig), 250 µL av Taq Master Mix (2 x) (se Tabell för material), 10 µL isotermiska polymeras (se Tabell för material), och 10 µL neutralisering buffert (se Tabell för material). Blanda dem genom pipettering upp och ner 10 x och snurra blandningen ner att samla in den. Läsa in denna lösning i en HFE-backed 1 mL spruta, passar det med en nål och placera det i en sprutpump.
  4. Ladda tre 3 mL sprutor med fluorerade olja (HFE) med en 2% w/w framställa-polyetylen glykol (PFPE-PEG) tensid, passar alla med en nål och placera dem i sprutpumpar.
  5. Ladda tre 1 mL sprutor med 2 M NaCl, passar alla med en nål och ställ dem åt sidan.
  6. Sammanfoga streckkod droppar, tagmented genomet droppar, och PCR blanda med dubbel samgående enheten.
    Obs: Se figur 5 för en enhet som är Schematisk som anger platsen för de reagens och elektroden inlopp och utlopp.
    1. Anslut de 3 NaCl-sprutorna till 2 elektrod vikar och inre vallgraven inletusing bitar av PE rör. För elektroderna, utöva påtryckningar till sprutorna manuellt tills elektroderna är helt fyllda med salt lösning. Efter fyllning gäller elektroderna, manuellt tryck på vallgrav sprutan tills vallgraven är fylld. Den fria änden av vallgraven med en liten bit av blylod.
    2. Anslut 3 HFE sprutorna monterad på pumpar till 2 spacer olja vikar och dropmaking olja inletusing bitar av PE rör. Innan du sätter rören i enheten, prime pumparna för att ta bort luft från linjen.
    3. Anslut PCR-mix sprutan, mild mikrogel skyddas droppar spruta och streckkod sjunker spruta till deras respektive vikar med PE slangar. Skjuta alla droplet återföring slangar med en antistatisk pistolen innan du ansluter dem till sprutan nålar; antistatiska behandling minskar risken för droplet återförening induceras av statiska laddningar på PE slangen.
    4. Ansluta en bit av PE slang till utlopp och placera den fria änden i en 0,2 mL PCR-rör.
    5. Anslut nålen på sprutan elektrod till en kall katod fluorescerande inverter med en alligator klipp. Ange den inverter DC strömförsörjning till 2 V.
    6. Kör dubbel samgående enheten med de rekommenderade flödena: 300 µL/h för tagmented mild mikrogel skyddas dropparna, 100 µL/h för den streckkod droppar, 1500 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG (dropmaking olja), 600 µL/h för förstärkning blanda, 200 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG ( barcode spacer olja), och 700 µL/h för HFE 2% w/w PFPE-PEG (mild mikrogel skyddas spacer olja). Samla in dropparna i PCR-rör med cirka 50 µL emulsion i varje rör.
  7. Före den termisk cykling, ta försiktigt bort det nedre lagret av HFE olja från de emulsioner använda gel-lastning Pipettera tips och ersätta dem med FC-40 fluorerade olja innehållande en 5% w/w PFPE-PEG tensid. Termisk cykel med följande protokoll: 65 ° C i 5 min, 95 ° C i 2 min, 30 x (95 ° C under 15 s, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min), 72 ° C i 5 min, sedan hålla på 12 ° C.
  8. Återställa barcoded DNA från thermal-cyklade droppar.
    1. Samla droppar in i en mikrocentrifug rör och bryta de emulsioner använda 20 µL av PFO. Vortex dem för 10 s att blanda.
    2. Snurra röret vid 10.000 x g för 1 min till fractionate blandningen i vattenlösning (överst) och olja (nederst) faser. Försiktigt bort övre vattenskiktet från röret med en Pipettera och överföra den till en ny mikrocentrifug rör. Kassera den olja fas.
    3. Rena barcoded PCR-produkten i en spin kolumn enligt tillverkarens protokollet och eluera det i 20 µL av 1 x TE buffert.
    4. Fortsätt till utförs sekvensering och analys enligt steg 9 och 10.

9. bibliotek förberedelse och sekvensering

  1. Förbereda encelliga biblioteket för sekvensering genom att följa tillverkarens protokollen för fragment storlek-urval och kvantifiering.
  2. Sekvens Parade-end biblioteket med standard kemi för Läs 1 och Läs 2. Använd den anpassade Index 1 primern I7_READ (tabell 2) för ett 15-bp-index som läser, motsvarar encelliga streckkoden.

10. single-cell dataanalys

Obs: Anpassade Python skript för kvalitetskontroll och preliminär analys av SiC-seq data kan hämtas från https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Kör skriptet ”barcodeCleanup.py” för att utföra kvalitetskontroll på den barcoded läser och exportera single-cell data till en SQLite databas. För en kontroll experiment, använder det här skriptet med den ”-align” flagga att justera läser till kända referens genomen.
  2. Analysera renhet i grupperna streckkod (för en kontroll experiment) med hjälp av skriptet ”purity.py” och bekräfta de hög renhet värdena överensstämmer med figur 6B.

Representative Results

SiC-seq experimentella arbetsflödet innehåller 3 PDMS mikroflödessystem enheter tillverkade med hjälp av en mjuk litografi förfarande (figur 1). En samtidig flöde dropmaker (figur 3A) genererar 25 µm av digitala streckkod droppar för märkning genomiskt DNA med en unik single-cell identifierare. De streckkod oligonukleotider består av en 15 bp degenererade sekvens flankerad av PCR-handtag för amplifiering (tabell 2, BAR primer). Streckkoder är utspätt till en femtomolar koncentration att uppnå singel-molekyl inkapsling och alla droppar får antingen 0 eller 1 streckkod fragmenten. Droppar som innehåller en streckkod förstärks, vilket ger många kopior av dubbelsträngat streckkod amplikoner. En nukleinsyra fläck används för att verifiera den framgångsrika förstärkningen och kvantifiera andelen inkapsling av streckkod fragment (figur 4B). Microgels genereras av samtidig flyter en bakteriecell fjädring och en smält agarosgel vid lika flöden (figur 2A). Agarens är beredd på två gånger önskad slutliga koncentration, som samtidig flöde dropmaking processen effektivt späder ut de aqueous lösningarna med en faktor 2. Som Agarens cools, stelnar det till en 25 µm diameter mild mikrogel skyddas ockuperar den sfärisk volymen av droplet-programmet.

En serie wash och lysis steg renar hög molekylvikt genomisk DNA i microgels (figur 2B). Efter att ha brutit emulsioner, utförs vattenhaltigt i stora volymer att späda ut spår organiska lösningsmedel som kan hämma de nedströms enzymatiska behandlingarna. De tvättade microgels observeras i Mikroskop för att kontrollera cellhastighet inkapsling (figur 4A). En cocktail av enzymer med breda lytisk verksamhet läggs till mild mikrogel skyddas suspensionen att smälta cellväggarna i bakterier och eukaryota mikrober19. En andra behandling med proteinas K och tvättmedel försämrar proteinerna och solubilizes cellfragment.

Tagmentation av renade DNA utförs i droppar att undvika potentiell korskontaminering som följd av diffusionen av små tagmented DNA-fragment mellan de microgels18. En droplet inkapsling enhet (figur 3B) compartmentalizes varje mild mikrogel skyddas med en buffert och tagmentation enzym, vilket samtidigt fragment dubbelsträngat DNA medan också ”taggning” det med en förladdad oligonukleotiden20. Microgels läses in i droppar som nära-packade partiklar, uppnå inkapsling priser närmar sig 1 mild mikrogel skyddas för varje droppe med några dubletter21 (figur 4 c).

I det sista steget i arbetsflödet mikroflödessystem (figur 2 c) utför en enhet en dubbel fusion kombinerar 1 streckkod droppe, 1 mild mikrogel skyddas-innehållande droppe och förstärkning mixen i en kontrollerad process. Först är ett droplet-program innehållande PCR reagens ihopkopplade och samman med en streckkod droppe i regionen visas i gult (figur 5). Saltvatten elektroder i ultrakalla kanalen producerar en hög elektriska fältet övertoning som utlöser droplet sammanslagningen. På ett liknande sätt, är den första sammanslagna droplet parat med en mild mikrogel skyddas droplet och samman en andra gång i regionen visas i rött. Droppar samlas och termisk cyklade off-chip i en singel-överlappning förlängning (SOE) PCR. Överlappande kompletterande ändarna av streckkoden och tagmented genomisk DNA kan fusion och exponentiell amplifiering endast korrekt barcoded konstruktioner.

Sekvensering data först filtreras av en Läs kvalitet och sedan analyseras genom att gruppera läser enligt deras 15-bp encelliga streckkod sekvens. För en streckkod grupp anses vara giltigt, bör den innehålla ett minsta antal läsningar; Detta tröskelvärde begränsar analysen till celler med en användbar mängd sekvensering data och tar bort PCR-muterade streckkoden ”orphans” från datamängden. I det här exemplet kör minst är inställd på 7,5 kbps per grupp (50 läsningar av 150 bp varje). Ett histogram över streckkoden räkningarna kontra gruppens storlek visar att en betydande del av grupperna giltig streckkod är precis ovanför tröskelvärdet storlek (figur 6A).

I en kontroll experiment där mikrobiella gemenskapen sammansättning är känd, används renhet och relativa överflöd mått för att utvärdera kvaliteten på en SiC-seq kör. Här, analyseras en syntetisk 10-cells gemenskap bestående av 3 gramnegativa bakterier, 5 grampositiva bakterier och 2 jäst. Renhet av en viss streckkod grupp definieras som antalet läsningar mappa till den vanligaste arvsmassan i gruppen dividerat med det totala antalet läsningar i gruppen. De allra flesta i grupperna streckkoden har med större än 0,95 (figur 6B). Relativa överflöd av celltyper beräknas genom att räkna de raw-läsningar och genom att räkna de streckkod grupperna, där grupperna tilldelas en celltyp som motsvarande konsensus av dess medlem läsningar (figur 6 c). Överflödet av läsningar och streckkod grupper spåra i ungefär lika proportioner, vilket indikerar att cellpopulationer som provtas så att vissa arter inte ingår i streckkod oproportionerligt små eller stora grupper. Plottning sammanlagda täckning av alla streckkod grupper från en enda art indikerar en hög täckning över hela genomet, med få eller inga dropout regioner (figur 7). Likformigheten av täckning kan verifieras med en frekvensfördelning av normaliserade täckning värden, med de flesta värden centrerad kring medelvärdet (figur 7, infälld).

Figure 1
Figur 1 : Tillverkning av mikrofabricerade enheter av photolithographyen. (A) Master formar med en enda funktion höjd tillverkas av spin beläggning ett skikt av SU-8 fotoresist på en silicon wafer. Fotoresist är sedan mönstrad med photolithographic mask och UV-ljus, crosslinking den exponerade SU-8. Slutligen, uncrosslinked SU-8 löses i badkar utvecklare. Den resulterande mögel används för att casta PDMS som är bunden till en glasskiva att producera kompletta mikroflödessystem enheten. ()B) för en enhet med dubbla lager, tillverkning likaså börjar med spin beläggning och exponering steg. Dessa steg upprepas sedan för att skapa en två-lagers enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Översikt över arbetsflödet SiC-seq. (A) A mikrobiella suspensionen är samtidig flödade med smält agaros i en dropmaker enhet att kapsla in enstaka celler i microgels. (B) microgels utsätts för en rad tvättar att rena den bakteriella genomiskt DNA. Lytisk enzymer smälta cellväggar grampositiva bakterier och jästsvampar och rengöringsmedel solubilizes cellulära skräp. Microgels är åter inkapslad i små droppar för tagmentation att minska förorening. (C), ultrakalla fusionen kombinerar en digital PCR-streckkod, ett tagmented mild mikrogel skyddas genom och en förstärkning blandning i en takt > 1 kHz. Off-chip SOE-PCR skarvar en unik encelliga streckkod på tagmented genomet och förstärker selektivt fullt barcoded konstruktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Mikroflödessystem enheter för dropmaking och mild mikrogel skyddas re inkapsling. (A) denna panel visar en samtidig flöde dropmaker (25 µm funktionen höjd). Celler och smälta agarosen introduceras in i enheten vid lika flöden att producera 25 µm droppar på en 25 µm x 25 µm junction. För den digitala streckkod dropmaking, cell inloppet är ansluten och en PCR-mix införs i inloppet agaros. (B) denna panel visar en mild mikrogel skyddas re inkapsling enhet (25 µm funktionen höjd). Microgels flöda in i en trattformad inloppet till upprätthålla deras Stäng-packade ordning och få en volym av tagmentation mix före nytt inkapsling vid en 25 µm x 30 µm korsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Micrographs av droppar och microgels. (A) denna panel visar tvättas 25 µm microgels innan enzymatisk lysis. Bakterier färgas fluorescently för kvantifiering av andelen inkapsling. Poisson lastning statistik diktera att cellerna bör vara inkapslade i en takt av 1 av 10 droppar eller mindre att minimera frekvensen av multipel-inkapsling händelser. (B) denna panel visar en fluorescence mikroskopi bild av 25 µm digital streckkod droppar behandlas med en nukleinsyra fläck. Droppar som innehåller förstärkt streckkod fragment producerar en stark fluorescens-signal. (C) i denna panel visas microgels åter inkapslade i 50 µm droppar. Stäng-förpackning av microgels tillåter inkapsling priser närmar sig 1 gel per droppe med några dubletter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Mikroflödessystem dubbel fusion enhet för encelliga genomet streckkodning. En två-stegs fusionen par streckkod droppar med tagmented genomen på en hög genomströmning. En droppe av PCR-mix först genereras och samman med en streckkod droppe i regionen visas i gult med saltvatten elektroder. Nästa, en droplet-fil som innehåller en mild mikrogel skyddas förs och samman en andra gång i regionen visas i rött. Olja vikar möjliggör exakt kontroll av avståndet mellan reinjected droppar. Barcode återföring kammaren och dess spacer olja placeras på kortare 25 µm lager, skuggad i blått. Alla andra enhetsfunktioner tillhör det tjockare lagret med 45 µm totala höjd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Barcode grupp mätvärden för en 10-cells syntetiska mikrobiell gemenskapen. (A) denna panel visar fördelningen av streckkoden gruppstorlekar. Antalet grupper av en given storlek minskar exponentiellt när gruppen storlek ökar. En minimigräns på 7,5 kbps per grupp begränsar analysen till grupper med en tillräcklig mängd information och tar bort den PCR-muterad sekvensen ”orphans”. (B) denna panel visar fördelningen av streckkod grupp föroreningar. Majoriteten (> 90%) av grupper är av mycket hög renhet (> 95%). (C) i denna panel visas det relativa överflödet av 10 arter beräknas på gruppnivå Läs och streckkod. 2 räkna metoder ge liknande resultat, vilket indikerar att de streckkod gruppstorlekar är konsekvent mellan arter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Aggregera genomisk täckning av Bacillus subtilis streckkod grupper. Läser från alla streckkod grupper mappning till bakterien B. subtilis (N = 9,398) är poolade och analyseras i aggregat. En cirkulär täckningskarta visar täckning likformigheten av SiC-seq läser, med inga observerbara dropout regioner. En streckad linje runt omkretsen anger genomsnittliga täckningen (5,55 x). Infälld histogrammet av relativa täckning frekvenserna visar att en huvuddelen av baserna täcks på ett djup nära genome-wide genomsnittet, företrädd av den streckade linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Enhet 1st layer höjd (µm) 1st layer Spin varvtal (rpm) 2nd layer höjd (µm) 2nd layer Spin varvtal (rpm)
Samtidig flöde dropmaker 25 4000 EJ TILLÄMPLIGT EJ TILLÄMPLIGT
Gel re encapsulator 25 4000 EJ TILLÄMPLIGT EJ TILLÄMPLIGT
Dubbelrum sammanslagning 25 4000 20 5000

Tabell 1: mikroflödessystem fabrication enhetsparametrar. Denna tabell visar en lista på de mikroflödessystem enheter som används i arbetsflödet SiC-seq med deras krävs hastigheter för fotoresist spin beläggning (baserat på tillverkarens specifikationer för SU-8 3025).

Etikett Sekvens (5' > 3')
AA1 GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabell 2: Primer sekvenser.

Kompletterande fil 1: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

SiC-seq mikroflödessystem arbetsflödet producerar encelliga genomet sekvensering data från tusentals bakterieceller. Digitala streckkoder skarvas på genomen hos mild mikrogel skyddas-inkapslat celler möjliggör de i silico deconvolution NGS data i grupper av barcoded läser med ursprung från samma cell. En kontroll experiment med en mikrobiell gemenskap med känd sammansättning är nödvändiga för bedömning av renheten av grupperna streckkod. En stor fraktion av låg-renhet grupper anger att cellen inkapsling är alltför hög eller att det finns betydande droplet korskontaminering som inträffar under mikroflödessystem processtegen. Enligt Poisson statistik, bör de streckkoder och celler vara inkapslade i målet förhållandet 1 partikel för varje 10 droppar att begränsa frekvensen av flera inkapsling till mindre än 5% av alla icke-tomma droppar. En inkapsling högre än detta ökar andelen dubletter exponentiellt, så att kontrollen av inkapsling förhållandet under processen dropmaking är av avgörande betydelse. Användare bör vara särskilt försiktig med inkapsling av flera celler i en enda mild mikrogel skyddas eftersom läsningar från olika celler delar samma streckkod sekvens inte kan vara bioinformatically separerade. I fall 1 cellen får 2 olika streckkoder, streckkod gruppen renhet är opåverkad även om överflöd mätvärden är skev vid inventering av streckkod sekvens.

Droplet korskontaminering kan också uppstå på grund av suboptimal fusionen förhållanden. Under en framgångsrik verksamhet, kan simuleras samgående enheten (figur 5) controllably para ihop 1 streckkod droplet med 1 mild mikrogel skyddas och en volym av PCR reagens. Icke-ideala flöden kommer att resultera i en droplet para ihop vid felaktiga förhållanden: 1 streckkod kan paras med 2 microgels, till exempel. Alla flöden som anges i protokollet är avsedda att vara uppskattningar och kan behöva justeras beroende på små variationer i enheten geometri och droplet storlekar. Användare med tillgång till kameror med hög hastighet inspelningen anlagen (> 10 000 bildrutor/s) bör kontrollera rätt droplet fusionen i början och under loppet av mikrofabricerade operationen. Användare utan åtkomst till en höghastighetskamera kan samla en liten volym av sammanfogad utdata och manuellt mäta de droplet storlekarna under ett mikroskop. Droppstorlek bör vara enhetliga: ett överskott av produktutgåva streckkoder eller mild mikrogel skyddas droppar indikerar att de återföring bör minskas med detta.

Flera allmänna försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hantering av microgels och microdroplets att bevara deras integritet. Microgels, kylas men mekaniskt robust, tillräckligt före avbrottet och tvätt steg för att säkerställa fullständig gelation. Icke-sfäriska microgels är en indikation på att Agarens inte var ges tillräcklig tid för att stelna. När du tvättar microgels, snurra upphängningarna ner med nödvändiga hastigheter att undvika en förlust av produkt. Agaros hydrogel har ett brytningsindex som matcha med vatten och kan vara svårt att se i en tub22, så att användare bör noggrant identifiera gel-flytande gränsen före aspiration. Vatten-i-olja droppar är mottagliga för återförening av statiska krafter23 på laboratoriet handskar och slangar. Av denna anledning rekommenderar vi lastning droplet återföring sprutorna med händerna och att behandla alla återföring rader med en anti-statisk kanon före pumpen grundningen. Stora coalesced droppar kan tas bort genom att långsamt rotera emulsioner i en spruta och manuellt aspirera större dropparna ansamlas nära toppen på grund av deras större buoyant kraft.

SiC-seq är den första teknologin att demonstrera enskild cell Genomsekvensering av > 50.000 bakterieceller. Denna plattform erbjuder betydande fördelar i genomströmning över befintliga strategier och möjliggör en djupare provtagning av heterogena mikrobiella samhällen. Hittills har mikroflödessystem teknik för encelliga Genomsekvensering anställd microchambers9 och mikrobrunnar24 för cell isolering och förstärkning, men med genomloppstid i spänna av endast tiotals till hundratals celler. Flöde sortering av enstaka celler i wellplates5,6 kräver inga specialiserade mikroflödessystem instrumentation men äger en likaså låg genomströmning. Med tanke på att prover av jord och vatten från omgivningen ofta ha alfa mångfalder av > 1 000 på arten nivå25,26, SiC-seq är mycket fördelaktigt genom dess förmåga att prova ett långt större antal organismer. SiC-seq arbetsflödet är anpassningsbar till cell ingångar från laboratoriet kultur, den naturliga miljön eller en levande värd. En cell prov behöver bara vara i en vattensuspension och gratis av stora partiklar (> 10 µm) vara lämplig för mikroflödessystem inkapsling. Till exempel har metoden tidigare använts på ett urval av havsvatten med hjälp av en rad wash och filtrering steg för att förbehandla cellerna innan inkapsling17.

SiC-seq protokollet genererar en relativt gles mängd sekvensering data från varje enskild cell och kanske inte passar för alla tillämpningar. Vissa bioinformatik algoritmer som de novo genomet montering eller enda nukleotid variant (SNV) ringer kräver högre täckning djup att arbeta effektivt. Istället kan streckkoden grupper vara klustrade i silico av taxonomiska binning metoder27 så att algoritmer kan appliceras på större uppsättningar av läsningar. Den relativt låga totala streckkodning effektiviteten i SiC-seq arbetsflödet kan också presentera utmaningar i fall där tillgången på ingång provet är låg. SiC-seq bygger på en Poisson-fördelade streckkod inkapsling steg, därför cirka 10% av cellerna får en molekylär streckkod och förstärks under den slutliga bibliotek beredning steget. Medan detta är jämförbart med andra microdroplet-baserade barcoding system10, användare som arbetar med dyrbara cellprover kan ha svårigheter att uppnå adekvat bibliotek avkastningen för sekvensering och kan behöva öka antalet PCR cykler i finalen förstärkning steg. En annan möjlig lösning för användare med mikroflödessystem expertis är att sortera positiva streckkod droppar efter steget för digital PCR, vilket innebär att den totala effektiviteten för streckkodning > 85%28.

En potentiell framtida riktning för SiC-seq teknik anpassar arbetsflödet för användning med däggdjursceller, banar väg för nya studier av encelliga. Som ett exempel, en analys av kopia nummer variationen mellan enda cancer cells maj ytterligare vår förståelse av heterogenitet i cancer patologi2roll. Alternativt skulle att integrera SiC-seq med befintliga metoder att probe och berika DNA sekvenser av intresse29 möjliggöra riktade encelliga sekvensering av subpopulationer eller sällsynta stammar av celler. Med miljöprov, kunde gener från inom en kända metabola vägen vara riktade och analyseras kontextuellt tillsammans med angränsande gener för att identifiera nya genomiska öar. Från inom en mänsklig värd miljö, låg-titer patogena bakterier prover kan isoleras och sekvenserade på enskild cell nivå att undersöka mer noggrant deras genotypisk ursprunget till virulens.

Disclosures

Patent avseende detta arbetsflöde kan vara är licensierad till uppdrag Bio, som Adam R. Abate aktieägare.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Science Foundation genom en karriär Award (licensnummer DBI-1253293); den National Institutes of Health (NIH) (grant nummer HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); och Defense Advanced Research projekt byrå lever gjuterier Program (kontraktsnummer HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Bioteknik fråga 135 mikrofluidik microdroplets encelliga genomik metagenomik nästa generations sekvensering molekylär streckkodning
En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter