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Bioengineering

एकल-कक्ष जीनोम sequencing के लिए एक Ultrahigh-प्रवाह Microfluidic प्लेटफ़ॉर्म

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

एकल-कक्ष अनुक्रमण जैविक प्रणालियों में genotypic विविधता से पता चलता है, लेकिन वर्तमान प्रौद्योगिकियों समुदाय संरचना और समारोह की गहरी रूपरेखा के लिए आवश्यक प्रवाह की कमी है । यहां, हम अनुक्रमण के लिए एक microfluidic कार्यप्रवाह का वर्णन > 50, 000 विविध कोशिका आबादी से एकल सेल जीनोम ।

Abstract

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों जैविक प्रणालियों में सेलुलर विविधता की भूमिका की एक उभरती हुई समझ के जवाब में थोक से एकल सेल संकल्प करने के लिए एक प्रतिमान बदलाव आया है । हालांकि, बड़ी आबादी के एकल-कक्ष अनुक्रमण अनुक्रमण के लिए जीनोम के प्रसंस्करण में सीमाओं से प्रभावित किया गया है । इस पत्र में, हम एकल सेल जीनोम अनुक्रमण के लिए एक विधि का वर्णन (सिक-seq) जो छोटी बूंद microfluidics का उपयोग करता है को अलग, बढ़ाना, और बारकोड एकल कोशिकाओं के जीनोम । microgels में सेल encapsulation compartmentalized शुद्धि और डीएनए के tagmentation की अनुमति देता है, जबकि एक microfluidic विलय कुशलतापूर्वक एक अद्वितीय एकल सेल oligonucleotide बारकोड के साथ प्रत्येक जीनोम जोड़े, की अनुमति > 50, 000 एकल कोशिकाओं को अनुक्रम हो प्रति रन । sequencing डेटा बारकोड द्वारा, एकल कोशिकाओं से उद्भव पढ़ता के समूहों पैदा कर रहा है । एकल सेल अनुक्रमण के एक उच्च प्रवाह और कम पूर्वाग्रह विधि के रूप में, सिक-seq विविध कोशिका आबादी पर लक्षित जीनोमिक अध्ययन की एक व्यापक रेंज सक्षम हो जाएगा ।

Introduction

जीनोम सेलुलर पहचान और समारोह का एक खाका के रूप में कार्य करता है, एक जीव कोडिंग क्षमता की संपूर्णता युक्त । जीनोम के स्तर पर सेलुलर जीवविज्ञान की समझ विषम कोशिका आबादी के भीतर मनाया phenotypic विविधता की व्याख्या कर सकते हैं । इस विविधता जैविक प्रणालियों में स्पष्ट है और मानव स्वास्थ्य और रोग के लिए व्यापक प्रभाव है । उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं के बीच जीन की नकल संख्या विविधताओं के विकास और कैंसर के प्रसार के लिए1,2से जुड़े हुए हैं । बैक्टीरियल संक्रमण, जीनोम के एक छोटे से अंश में मौजूद pathogenicity द्वीपों क्षैतिज स्थानांतरित किया जा सकता है और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया3,4के प्रसार के लिए सीसा । एकल कोशिका स्तर पर जीनोम का अध्ययन करने में एक प्राथमिक चुनौती उपलब्ध डीएनए की कम मात्रा है, साथ ही पादी की पूर्ण विविधता का नमूना करने के लिए कोशिकाओं के हजारों का विश्लेषण करने की जरूरत है. इन कारणों के लिए, प्रयोगात्मक प्रवाह में सीमाओं एकल सेल अध्ययन की प्रभावशीलता में बाधा है, सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं की ओर परिणाम पक्षपातपूर्ण । एकल-कक्ष आइसोलेशन तकनीक जैसे प्रवाह5,6, ऑप्टिकल चिमटी7, बल्क जैल8में एंबेड, और microfluidics9 अनुक्रमण के लिए सैकड़ों कक्षों को संसाधित करने में सक्षम हैं; हालांकि, यह केवल अधिकांश नमूनों का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है । एकल सेल जीनोम अनुक्रमण के लिए काफी उच्च प्रवाह के साथ एक विधि सेल की आबादी के गहरे और अधिक पूर्ण रूपरेखा की अनुमति होगी, जिससे इन समुदायों के भीतर genotypic विविधता की भूमिका elucidating ।

छोटी बूंद microfluidics कोशिकाओं और picoliter पैमाने रिएक्टरों के लाखों के भीतर जैविक रिएजेंट के उच्च प्रवाह हेरफेर सक्षम बनाता है । तारीख करने के लिए, microdroplet प्रौद्योगिकियों विषम ऊतकों से कोशिकाओं के बीच अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है10,11,12, गहराई से अनुक्रम लंबे अणुओं13,14 ,15, और आचरण क्रोमेटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (चिप-seq) एकल कोशिकाओं पर विश्लेषण16. दरअसल, microdroplets उच्च प्रवाह में सक्षम हैं, compartmentalized आपरेशनों, उंहें एकल सेल जीनोमिक्स में अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदाई बना । इस प्रौद्योगिकी के विकास के अपने स्वयं के अद्वितीय तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है, लेकिन । कोशिकाओं लीजड ड होना चाहिए, शुद्ध, और न्यूनतम पूर्वाग्रह के साथ परिलक्षित, समान रूप से नमूना कोशिका आबादी के लिए. इसके अतिरिक्त, स्तनधारी कोशिकाओं में polyadenylated mRNA टेप के विपरीत, वहां जीनोम में कोई तुलनीय आणविक आकृति के लिए लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के कब्जा की सुविधा है । इन कारणों के लिए, एकल-सेल जीनोम अनुक्रमण microdroplet प्लेटफार्मों में लागू करने के लिए मुश्किल हो गया है ।

इस काम में, हम हमारे पहले रिपोर्ट एकल सेल microfluidic दृष्टिकोण की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान एक एकल प्रयोग17में कोशिकाओं के हजारों के जीनोम अनुक्रमण करने में सक्षम. इस तकनीक के साथ, सिक-seq कहा जाता है, बैक्टीरियल कोशिकाओं माइक्रोन पैमाने पर hydrogels और व्यक्तिगत रूप से लीजड ड, tagmented में समझाया, और एक एक अद्वितीय microdroplet बारकोड, जो सेल के oligonucleotide डीएनए पर ब्याह किया है युक्त जीनोमिक के साथ विलय के माध्यम से एक एकल ओवरलैप एक्सटेंशन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) । hydrogels अलग कंटेनरों में जो उच्च आणविक वजन जीनोमिक डीएनए sterically है, जैसे डिटर्जेंट और lytic एंजाइमों का उपयोग और शुद्ध डीएनए के रूप में छोटे अणुओं की अनुमति के रूप में सेवा करने से पहले barcoding18। इस प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं > 50, 000 घंटे के एक मामले में एकल कोशिकाओं, एक बारकोड अनुक्रमण के लिए तैयार पुस्तकालय में जिसके परिणामस्वरूप । अनुक्रमण के बाद, पढ़ता उनके एकल-कक्ष बारकोड अनुक्रम के अनुसार, एक डेटासेट के लाखों शामिल dataset में जिसके परिणामस्वरूप, एक सेलुलर सूचकांक के साथ एक मल्टीप्लेक्स हैं ।

Protocol

1. Microfluidic डिवाइस निर्माण

  1. microfluidic मास्क डिजाइन कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तैयार (के रूप में प्रदान की । DWG; अनुपूरक फ़ाइलें) देखें । इन डिजाइनों एक सर्किट बोर्ड फिल्म पर एक 10 µm संकल्प के साथ विक्रेता द्वारा मुद्रित किया है ।
    नोट: बहु-स्तरित microfluidic डिवाइसेज़ के लिए, संगत मास्क में संरेखण चिह्न होते हैं.
  2. प्रत्येक डिवाइस के लिए, SU-8 मास्टर मोल्ड (चित्र 1a) इस प्रकार के रूप में गढ़े ।
    1. एक 3-तैयार व्यास सिलिकॉन वेफर में लगभग 1 SU-८ ३०२५ photoresist की मिलीलीटर वेफर के केंद्र पर डालने के द्वारा । सक्शन लागू करके स्पिन कोट चक पर वेफर सुरक्षित ।
    2. प्रत्येक डिवाइस के लिए परत मोटाई और स्पिन गति की एक सूची के लिए तालिका 1 देखें । सभी उपकरणों के लिए, ५०० rpm पर 30 एस के साथ स्पिन कोटिंग शुरू, संकेत गति से 30 एस के बाद ।
    3. SU-8-स्पिन कोट से सिलिकॉन वेफर निकालें और नरम 30 मिनट के लिए १३५ ° c के लिए सेट चूल्हा पर इसे सेंकना । वेफर को पाक के बाद कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें ।
    4. एक collimated १९० मेगावाट के तहत उपयुक्त microfluidic मुखौटा के साथ एसयू-8-सिलिकॉन वेफर बेनकाब, ३६५-एनएम यूवी 3 मिनट के लिए नेतृत्व किया ।
    5. जोखिम के बाद, हार्ड एक चूल्हा पर वेफर सेंकना 1 मिनट के लिए १३५ ° c के लिए सेट । इस पाक कदम के बाद, वेफर कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति ।
    6. किसी एकल-स्तरित microfluidic डिवाइस के लिए, चरण 1.2.7 के लिए छोड़ें । बहु-लेयर्ड microfluidic डिवाइस के लिए, photoresist (आरेख 1b) की दूसरी लेयर के लिए चरण 1.2.1-1.2.5 दोहराएं ।
    7. एक एकल परत उपकरण के लिए पहली हार्ड सेंकना (या एक बहु स्तरित उपकरण के लिए दूसरा हार्ड सेंकना) के बाद, यह propylene ग्लाइकोल monomethyl ईथर एसीटेट (PGMEA) के एक स्नान में 30 मिनट के लिए विसर्जित करके वेफर विकसित ।
    8. वेफर के विकास के बाद, एक धार PGMEA युक्त बोतल का उपयोग करने के लिए वेफर कुल्ला । तो एक धार एक १३५ डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले isopropanol युक्त बोतल के साथ वेफर कुल्ला 1 को शुष्क करने के लिए मिनट चूल्हा ।
    9. polydimethylsiloxane (PDMS) के साथ ढलाई के लिए एक पेट्री डिश में वेफर (इसके बाद के रूप में गुरु के रूप में भेजा) प्लेस ।
  3. चरण १.२ में तैयार मास्टर के साथ, एक PDMS कास्टिंग के साथ डिवाइस निर्माण प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें ।
    1. बड़े पैमाने पर एक 11:1 अनुपात में एक इलाज एजेंट के साथ एक सिलिकॉन आधार के संयोजन से PDMS तैयार करते हैं । मिश्रण सिलिकॉन आधार और एक हलचल छड़ी के साथ हाथ से एजेंट का इलाज ।
    2. Degas एक degassing चैंबर में रखकर और एक निर्वात लागू करने से PDMS । PDMS degas करने की अनुमति दें जब तक हवा बुलबुले नहीं रह रहे है (आमतौर पर 30 मिनट) दिखाई ।
    3. ध्यान से गुरु पर degassed PDMS डालना, एक अंतिम PDMS परत मोटाई के लिए लगभग 5 मिमी. Degas PDMS फिर से किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने सुनिश्चित करने के लिए.
    4. degassing के बाद, PDMS और मास्टर ८० ° c पर ८० मिनट के लिए सेंकना ।
    5. ध्यान से पके हुए मास्टर एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने से ठीक PDMS स्लैब उत्पाद । सुनिश्चित करें कि सभी कटौती सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर हैं ।
      नोट: कोई भी कटौती सिलिकॉन वेफर से बना एक एक समान संबंध को रोकने के होंठ में परिणाम हो सकता है ।
    6. पंच की सुविधा देता है और एक ०.७५ mm बायोप्सी पंच का उपयोग कर आउटलेट । डिवाइस की सुविधा की ओर एक पैकेजिंग टेप का उपयोग कर किसी भी धूल और आवारा PDMS निकालें ।
    7. डिवाइस का इलाज प्लाज्मा से पहले, यह isopropanol के साथ कुल्ला और इसे सुखाने के द्वारा एक ५० mm x ७५ mm ग्लास स्लाइड साफ ।
    8. प्लाज्मा उपचार के लिए, ऊपर का सामना करना पड़ सुविधाओं के साथ प्लाज्मा बंधन में PDMS स्लैब और ग्लास स्लाइड जगह है । 1 min. बॉंड के लिए 1 mbar O2 प्लाज्मा का उपयोग कर प्लाज्मा उपचार का प्रयोग करें सामने लाकर कांच स्लाइड करने के लिए डिवाइस, या चेहरा, एक साथ ।
    9. प्लाज्मा उपचार के बाद, ४० मिनट के लिए ८० ° c पर डिवाइस सेंकना ।
    10. अंत में, microfluidic चैनलों hydrophobic प्रदान करने के लिए देता है में से एक में कांच की सतह के उपचार द्रव सुई । सुनिश्चित करें कि सभी चैनलों के समाधान के साथ पूरी तरह से बाढ़ आ गई है और प्रत्येक dropmaker के लिए इंजेक्शन दोहराएं । ८० ° c पर इलाज डिवाइस सेंकना 10 मिनट के लिए अतिरिक्त विलायक लुप्त हो जाना ।

2. Agarose Microgels में कोशिकाओं का encapsulation

नोट: चित्र 2aदेखें ।

  1. 1 मिलीलीटर तैयार 3% w/v कम पिघलने तापमान 1x Tris-EDTA (ते) बफर में agarose । तुरंत सिरिंज लोडिंग करने से पहले जब तक एक ९० डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर agarose समाधान रखें ।
  2. सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल और इसके संबद्ध microfluidic उपकरणों को बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए मांय किया गया है, या तो एक जमे हुए स्टॉक या ताजा तैयारी से । कक्ष प्रकार के आधार पर स्तनधारी कक्षों, बड़े कक्ष आकार को समायोजित करने के लिए microfluidic चैनल आयाम का समायोजन की आवश्यकता हो सकती है ।
    1. फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।
    2. किसी hemocytometer में या सॉर्टिंग द्वारा प्रवाहित कक्षों को गिनना । के लिए 25 µm microgels एक लक्ष्य सेल encapsulation की दर के साथ 1 में 10, २.४ x 107 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता पर सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर तैयार/
    3. 3 min. महाप्राण supernatant के लिए कोशिकाओं को ३,००० x g पर नीचे स्पिन और 17% v/वी घनत्व ढाल माध्यम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ( सामग्री की तालिकादेखें) पंजाब में । यह सिरिंज लोड होने तक बर्फ पर रखें ।
  3. एक 3-एमएल fluorinated तेल (HFE) एक 2% डब्ल्यू/डब्ल्यू perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-खूंटी) surfactant युक्त के साथ सिरिंज लोड, यह एक 27 जी सुई के साथ फिट है, और यह एक सिरिंज पंप में जगह है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में microfluidic चरणों के लिए एक 27 जी सुई के साथ सभी सीरिंज फिट. आकस्मिक चुभने के जोखिम को कम करने के लिए, सभी सुइयों पर टोपियां रखें जब तक पंप ऑपरेशन शुरू होता है ।
  4. 1-एमएल सीरिंज में सेल सस्पेंशन और पिघला हुआ agarose लोड, 27 गेज सुई के साथ दोनों फिट है, और सिरिंज पंपों में इन जगह है ।
  5. agarose सिरिंज और एक छोटे से अंतरिक्ष हीटर के साथ गर्म पंप रखने के लिए सिरिंज और प्रवेश टयूबिंग में बीच बढ़िया तालमेल से agarose को रोकने के । उच्च और यह स्थिति इतनी है कि हीटिंग सतह के बारे में 10 सेमी सिरिंज से दूर है करने के लिए अंतरिक्ष हीटर सेट करें । सुनिश्चित करें कि सिरिंज पर मापा तापमान लगभग ८० डिग्री सेल्सियस है.
    नोट: उपयोगकर्ताओं उपकरण नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए पंप उपकरण से सिफारिश की दूरी पर हीटर बनाए रखने के लिए सलाह दी जाती है, टयूबिंग के पिघल सहित ।
  6. सह-प्रवाह dropmaking डिवाइस का उपयोग करके 25 µm microgel ड्रॉप्स जेनरेट करें.
    नोट: एजेंट की सुविधा और आउटलेट के स्थान का संकेत करने वाली एक डिवाइस योजनाबद्ध के लिए चित्र 3 देखें ।
    1. microfluidic डिवाइस के लिए सिरिंज सुई कनेक्ट पॉलीथीन के टुकड़ों (पीई) टयूबिंग का उपयोग कर देता है । डिवाइस में ट्यूबों डालने से पहले, प्राइम पंपों लाइन से हवा को दूर करने के लिए ।
    2. आउटलेट के लिए टयूबिंग का एक टुकड़ा कनेक्ट और एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में मुक्त अंत जगह है ।
    3. निंन का उपयोग करें (अनुशंसित) dropmaking के लिए प्रवाह दरें: ८०० µ l/एच के लिए HFE 2% w/w PFPE-खूंटी; पंजाब में सेल सस्पेंशन के लिए २०० µ एल एच/ और 3% w/v agarose के लिए २०० µ l/
  7. dropmaking के बाद, agarose की पूरी जमाना सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए 4 ° c पर संग्रह ट्यूब रखें ।

3. Agarose Microgels को तोडऩा और धोना

  1. संग्रह ट्यूब से तेल की निचली परत निकालें एक 3 मिलीलीटर एक 20 ग्राम सुई के साथ लगे सिरिंज का उपयोग कर, agarose बूंदों के शीर्ष परत परेशान करने के लिए नहीं देखभाल ले ।
  2. perfluorooctanol (PFO) के साथ इमल्शन को तोड़ें ।
    1. agarose ड्रॉप्स के लिए HFE में 10% v/v PFO की 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्लास्टिक इस समाधान के लिए 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से कोट इमल्शन को ऊपर और नीचे ।
      नोट: सभी microgel वॉश स्टेप्स के लिए प्लास्टिक सॉल्यूशन को १,००० µ l टिप के साथ यूज करें । microgel निलंबन सजातीय और pipetting के बाद यह झुरमुट से मुक्त दिखाई देना चाहिए ।
    2. agarose microgels को इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए २,००० x g पर शंकु ट्यूब स्पिन । आकांक्षा द्वारा PFO/HFE supernatant निकालें; microgels अब अपनी surfactant लेयर से फ्री हैं और साफ दिखाई देंगी ।
  3. hexane में एक surfactant के साथ microgels को धो लें ।
    चेतावनी: Hexane एक अस्थिर कार्बनिक विलायक है, और ३.३ कदम में धोने एक धुएं डाकू में आयोजित किया जाना चाहिए ।
    1. 1% v/v sorbitan के 2 मिलीलीटर जोड़ें monooleate ईओण surfactant ( सामग्री की तालिकादेखें) में hexane agarose microgels । प्लास्टिक ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए 10x, microgel गोली की पूरी गोलमाल सुनिश्चित करने ।
    2. microgels इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूब स्पिन । महाप्राण को supernatant surfactant/hexane हल निकालने के लिए ।
    3. surfactant/hexane वॉश को दोहराएं ।
  4. microgels एक जलीय बफर में धोने के लिए किसी भी अवशिष्ट कार्बनिक विलायक हटाने ।
    1. TET बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें [०.१% v/v octylphenol ethoxylate ईओण डिटर्जेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x ते में) शंकु ट्यूब करने के लिए । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए ।
    2. microgels को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए २,००० x g पर शंकु ट्यूब स्पिन । TET बफर को हटाने के लिए supernatant को महाप्राण ।
    3. TET धो 2x दोहराएं ।
    4. शंकु ट्यूब के लिए 1x ते बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए ।
    5. microgels को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए २,००० x g पर शंकु ट्यूब स्पिन । महाप्राण ते बफर निकाल supernatant.
    6. ते धो दोहराएं ।
  5. 1x न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ एक 10 µ एल जैल के दाग से एक 400X आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के तहत microgels में सेल encapsulation की पुष्टि ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: Microgels पारदर्शी चैनल के तहत स्पष्ट दिखाई देगा, जबकि सेल डीएनए GFP चैनल के तहत fluoresce जाएगा (497/520 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) । पारदर्शी और फ्लोरोसेंट चैनलों की एक ओवरले microgels में कोशिकाओं को दिखाने के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया जाएगा ।

4. Lytic एंजाइमों के जरिए Agarose में कोशिकाओं की Lysis

  1. एक lytic एंजाइम कॉकटेल का 1 मिलीलीटर का उपयोग कर तैयार ८०० µ एल ते बफर (1x), 2 µ l के खमीर lytic एंजाइम (5 यू/µ l शेयर, 10 यू/एमएल फाइनल), 30 µ एल ऑफ dithiothreitol (1 एम स्टॉक, 30 एमएम फाइनल), ६० मिलीग्राम की lysozyme (lyophilized पाउडर), 15 µ एल के EDTA (०.५ मीटर स्टॉक , ७.५ मिमी अंतिम), 2 µ l के mutanolysin (१०० यू/µ l शेयर, २०० यू/एमएल फाइनल), 2 µ एल के lysostaphin (10 यू/µ एल स्टॉक, 20 यू/एमएल फाइनल), और µ के 30 NaCl एल (1 एम स्टॉक, 30 एमएम फाइनल) ।
  2. 1 मिलीलीटर में वॉल्यूम लाने के लिए अतिरिक्त ते जोड़ें । घोल को भंवर करके मिक्स कर लें ।
  3. lytic एंजाइम समाधान के पूरे 1 मिलीलीटर से अधिक नहीं धोया microgels के 1 मिलीलीटर जोड़ें । pipetting 10x द्वारा मिक्स । एक शेखर में > 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण मशीन (अधिकतम रातोंरात गर्मी है) ।

5. डिटर्जेंट आधारित Microgel उपचार

  1. lytic एंजाइमों (चरण 4) के माध्यम से lysis के बाद, microgels धो लें ।
    1. 2 मिनट के लिए २,००० x जी पर microgels नीचे स्पिन और supernatant महाप्राण । बूंदों की वजह से गोली में फैला हुआ सेल मलबे के अपारदर्शी सफेद दिखाई देगा ।
    2. 10 मिमी Tris-एचसीएल बफर और प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण के 5 मिलीलीटर में microgels reसस्पेंड ।
    3. मिश्रण 2 मिनट के लिए २,००० एक्स जी में नीचे स्पिन, तो आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
  2. microgels पर डिटर्जेंट ट्रीटमेंट करते हैं ।
    1. एक लिथियम dodecyl सल्फेट (ढक्कन) lysis बफर में जैल (०.५% डब्ल्यू/वी ढक्कन 20 मिमी Tris-एचसीएल में) और ०.५ एम EDTA के ६० µ l को 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में reसस्पेंड ।
    2. एक Proteinase K एंजाइम (८०० यू/एमएल स्टॉक) के 5 µ एल जोड़ें । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए, तो एक गर्मी ब्लॉक पर ४२ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण मशीन 1 ज के लिए सेल झिल्ली solubilize और प्रोटीन को पचाने के लिए ।
  3. डिटर्जेंट ट्रीटमेंट के बाद microgels को धो लें ।
    1. microgels के साथ शंकु ट्यूब स्पिन 2 मिनट के लिए २,००० एक्स जी पर नीचे । आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें ।
    2. 2% v/v polysorbate 20 पानी में 10 मिलीलीटर के साथ microgels धो लें । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए ।
    3. शंकु ट्यूब 2 मिनट के लिए २,००० x g पर नीचे स्पिन, तो आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
    4. किसी भी अवशिष्ट एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए १००% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ microgels धो लें । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए ।
    5. शंकु ट्यूब 2 मिनट के लिए २,००० x g पर नीचे स्पिन, तो आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
    6. microgels को ०.०२% v/v polysorbate 20 में से 10 मिलीलीटर पानी में धो लें । प्लास्टिक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए ।
    7. शंकु ट्यूब 2 मिनट के लिए २,००० x g पर नीचे स्पिन, तो आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
    8. polysorbate 20 धो 3x दोहराएं । किसी भी बड़े झुरमुट को हटाने के लिए पिछले धोने से पहले एक १००-µm सेल छलनी के माध्यम से समाधान पारित.
  4. डीएनए क्षरण को रोकने के लिए 10 एमएम Tris-एचसीएल बफर के 5 एमएल में microgels को फिर से सस्पेंड करें । microgels 4 ° c पर 1 सप्ताह से पहले tagmentation (चरण 7) के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

6. डिजिटल पीसीआर द्वारा बारकोड बूंदों का उत्पादन

  1. एक कम-बाइंड ट्यूब में एक 1x ते बफर में बार प्राइमरी (तालिका 2) के ५००-pM स्टॉक तैयार करें । प्रत्येक उपयोग करने से पहले, 1 बजे के एक काम के शेयर के लिए प्राइमर पतला और ७० ° c के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर 1 मिनट के लिए गर्मी ।
  2. एक १५०-µ l पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर तैयार करें ७५ µ l उच्च निष्ठा हॉट स्टार्ट मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें)) (2x), ४२ पीसीआर के µ एल ग्रेड वाटर, 3 µ एल के DNA_BAR प्राइमरी (10 µ मी स्टॉक, ०.२ µ मी फाइनल), 3 µ एल के P7_BAR प्राइमरी (10 µ मीटर स्टॉक , ०.२ µ m फाइनल), बारकोड कमजोर पड़ने के 6 µ एल (1 बजे शेयर, ४० एफएम अंतिम), 6 polysorbate 20 के µ एल (५०% v/वी स्टॉक, 2% अंतिम), और खूंटी 6k के 15 µ एल (५०% डब्ल्यू/वी शेयर, 5% अंतिम) । ऊपर और नीचे 10x pipetting द्वारा मिक्स ।
  3. एक सिरिंज में HFE तेल के २०० µ एल ड्राइंग द्वारा एक HFE समर्थित सिरिंज तैयार करें और यह एक सुई के साथ फिट. सुई और प्रधानमंत्री हाथ से लाइन के लिए पीई टयूबिंग के एक वर्ग देते हैं । लक्ष्य समाधान में पीई टयूबिंग के अंत डालें और ध्यान से पीई टयूबिंग और सिरिंज में पीसीआर मिश्रण के सभी १५० µ एल आकर्षित । एक सिरिंज पंप में सिरिंज लोड ।
  4. एक 2% डब्ल्यू/डब्ल्यू perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-खूंटी) surfactant युक्त fluorinated तेल (HFE) के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज लोड, यह एक सुई के साथ फिट है, और यह एक सिरिंज पंप में जगह है ।
  5. उत्पंन 25 µm बारकोड को सह प्रवाह dropmaking डिवाइस का उपयोग बूंदें ।
    नोट: एजेंट की सुविधा और आउटलेट के स्थान का संकेत करने वाली एक डिवाइस योजनाबद्ध के लिए चित्र 3 देखें ।
    1. सीसा मिलाप का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ एक सह प्रवाह dropmaker डिवाइस के कोशिकाओं प्रवेश प्लग ।
    2. microfluidic डिवाइस के लिए HFE और पीसीआर मिश्रण के साथ भरी हुई सिरिंजों कनेक्ट पीई टयूबिंग के टुकड़े का उपयोग कर, बारकोड पीसीआर मिश्रण के लिए पिघला हुआ Agarose प्रवेश का उपयोग कर । डिवाइस में ट्यूबों डालने से पहले, प्राइम पंपों लाइन से हवा को दूर करने के लिए ।
    3. आउटलेट के लिए टयूबिंग का एक टुकड़ा कनेक्ट और एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में मुक्त अंत जगह है । dropmaking के लिए निंन (अनुशंसित) प्रवाह दरों का उपयोग करें: ६०० µ l/h के लिए HFE 2% w/w PFPE-खूंटी और २०० µ एल/एच के लिए पीसीआर मिक्स । प्रत्येक ट्यूब में बूंदों के लगभग ५० µ एल के साथ पीसीआर ट्यूबों में बूँदें ले लीजिए ।
  6. dropmaking के बाद, सावधानी से HFE तेल की निचली परत को जेल-लोडिंग प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग कर इमल्शन से हटा दें और इसे एफसी-४० fluorinated ऑयल से बदलें जिसमें 5% w/w PFPE-खूंटी surfactant हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल के साथ थर्मल चक्र: ९८ ° c 3 मिनट के लिए, के लिए 40x (९८ ° c के लिए 10 s, ६२ ° c 20 s के लिए, ७२ ° c 20 s के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए, और उसके बाद 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    नोट: थर्मल-साइकिल वाली बूंदों को 1 दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  7. बारकोड प्रवर्धन और encapsulation दर सत्यापित करें ।
    1. एक 1x न्यूक्लिक एसिड दाग तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) HFE में 2% w/w PFPE-खूंटी surfactant के साथ; दाग HFE में मामूली मिश्रणीय है और वह बूंदों में डीएनए को बांध देगा ।
    2. थर्मल साइकिल बारकोड पायस के 1 µ एल जोड़ने के लिए दाग तेल की 10 µ एल । उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. एक 200X आवर्धन पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (GFP चैनल, 497/520 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) द्वारा छवि बूंदें और बारकोड encapsulation दर गिनती । ध्यान रखें कि संकेत असतत हो जाएगा: परिवर्धित बारकोड युक्त बूंदों उज्ज्वल fluoresce जाएगा, जबकि खाली बूंदें अंधेरे दिखाई देगा (चित्रा 4B) ।

7. बूंदों में जीनोमिक डीएनए का Tagmentation

नोट: चित्र bदेखें ।

  1. एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी किट से रिएजेंट का उपयोग कर tagmentation समाधान के ५०० µ एल तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें). tagmentation एंजाइम के 7 µ l का उपयोग करें, tagmentation बफर के २५० µ एल, और पीसीआर ग्रेड पानी की २४३ µ एल. उंहें भंवर से मिश्रण और मिश्रण स्पिन नीचे इकट्ठा करने के लिए । एक HFE तेल समर्थित 1 मिलीलीटर सिरिंज में इस समाधान लोड और एक सुई के साथ फिट ।
  2. इंजेक्शन के लिए microgels तैयार करें ।
    1. २,००० x जी पर 2 मिनट के लिए microgel ट्यूब नीचे स्पिन और supernatant महाप्राण । एक जेल लोडिंग प्लास्टिक टिप के साथ एक HFE-समर्थित सिरिंज के शीर्ष करने के लिए जैल के २०० µ एल स्थानांतरण और टेप का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ नोक सील ।
    2. एक 3 डी-मुद्रित केंद्रापसारक अनुकूलक का प्रयोग ( पूरक फ़ाइलें 1 और 2), 3 मिनट के लिए microgel सिरिंज ३,००० x g पर स्पिन देखें
    3. एक जेल-लोडिंग प्लास्टिक टिप का उपयोग कर सिरिंज से तरल supernatant निकालें । सिरिंज नोजल के आधार पर microgel लेयर को पुश करें । एक सुई के साथ सिरिंज फिट.
  3. fluorinated तेल (HFE) एक 2% डब्ल्यू/डब्ल्यू perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-खूंटी) surfactant, यह एक सुई के साथ फिट है, और यह एक सिरिंज पंप में जगह युक्त साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज लोड ।
  4. microgels tagmentation रिएजेंट युक्त बूंदों में पुनः encapsulate ।
    नोट: एक डिवाइस के लिए एजेंट की सुविधा देता है और आउटलेट के स्थान का संकेत योजनाबद्ध के लिए चित्र बी देखें ।
    1. HFE, tagmentation मिश्रण है, और microfluidic डिवाइस के लिए microgels युक्त सिरिंजों पीई टयूबिंग के टुकड़ों का उपयोग करते हुए कनेक्ट । डिवाइस में ट्यूबों डालने से पहले, प्राइम पंपों लाइन से हवा को दूर करने के लिए ।
    2. आउटलेट के लिए टयूबिंग का एक टुकड़ा कनेक्ट और एक खाली 1 एमएल लाइन को तैयार गोताख़ोर के साथ सिरिंज में मुक्त अंत जगह है ।
    3. निंन का उपयोग करें (अनुशंसित) dropmaking के लिए प्रवाह दर: २,००० HFE 2% w/w के लिए µ l/h PFPE-खूंटी, २०० µ एल/एच के लिए microgels, और µ मिश्रण के लिए ५०० tagmentation एल/एच ।
  5. एक 400X आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत microgel encapsulation दर की पुष्टि करें । लगभग ८०-९०% बूंदों में एक microgel होना चाहिए, जैसा चित्र 4cमें दिखाया गया है ।
  6. एक सुई के साथ tagmentation इमल्शन युक्त सिरिंज फिट और जीनोमिक डीएनए को खंडित करने के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए एक गर्मी ब्लॉक या ओवन में यह ईमानदार मशीन ।

8. एकल सेल Barcoding द्वारा Microfluidic दोहरे विलय

नोट: चित्र 2cदेखें ।

  1. HFE 2% w/w PFPE-खूंटी के साथ एफसी-४० तेल अंश की जगह से विलय के लिए बारकोड बूंदें तैयार करें । ध्यान से एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में इन बूंदों हस्तांतरण, यह एक सुई के साथ फिट है, और यह एक सिरिंज पंप में जगह है ।
  2. एक सिरिंज पंप में मशीन और tagmented microgel छोटी बूंद सिरिंज लोड करें ।
  3. पीसीआर मिक्स की ५०० µ एल तैयार करें । बनाने से उपजी को रोकने के लिए निम्न क्रम में रिएजेंट जोड़ें: १४० पीसीआर के µ एल ग्रेड पानी, P5_DNA प्राइमरी के 10 µ l (10 µ मीटर स्टॉक, ०.२ µ मीटर फायनल), 10 µ एल के P7_BAR प्राइमरी (10 µ मी स्टॉक, ०.२ µ मीटर फायनल), ५० µ एल ऑफ पेग 6k (५०% डब्ल्यू/वी स्टॉक , 5% अंतिम), polysorbate 20 के ५० µ l (५०% v/v शेयर, 5% अंतिम), २५० µ एल Taq मास्टर मिक्स (2x) ( सामग्री की तालिकादेखें), इज़ोटेर्माल पोलीमरेज़ के 10 µ l ( सामग्री की तालिकादेखें), और बेअसर बफर के 10 µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें). मिश्रण उंहें ऊपर और नीचे 10x pipetting और मिश्रण स्पिन नीचे इसे इकट्ठा करने के लिए । एक HFE-समर्थित 1-एमएल सिरिंज में इस समाधान लोड, एक सुई के साथ फिट है, और यह एक सिरिंज पंप में जगह है ।
  4. fluorinated तेल के साथ तीन 3 मिलीलीटर सिरिंज लोड (HFE) एक 2% डब्ल्यू/डब्ल्यू perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-खूंटी) surfactant युक्त, एक सुई के साथ प्रत्येक फिट और उन्हें सिरिंज पंपों में जगह.
  5. 2 मीटर NaCl के साथ तीन 1 मिलीलीटर सीरिंज लोड, एक सुई के साथ प्रत्येक फिट और उन्हें एक तरफ सेट ।
  6. डबल विलय डिवाइस का उपयोग कर बारकोड बूंदों, tagmented जीनोम बूंदें, और पीसीआर मिश्रण विलय ।
    नोट: एजेंट और इलेक्ट्रोड की सुविधा और आउटलेट के स्थान का संकेत एक डिवाइस योजनाबद्ध के लिए चित्रा 5 देखें.
    1. 2 इलेक्ट्रोड की सुविधा और पीई टयूबिंग के एकल खाई inletusing टुकड़े करने के लिए 3 NaCl सीरिंज कनेक्ट. इलेक्ट्रोड के लिए, जब तक इलेक्ट्रोड पूरी तरह से नमक समाधान से भर रहे हैं मैन्युअल रूप से सीरिंज के लिए दबाव लागू होते हैं. इलेक्ट्रोड भरने के बाद, खाई भर जाता है जब तक खाई सिरिंज के लिए मैनुअल दबाव लागू. सीसा मिलाप का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ खाई के मुक्त अंत प्लग ।
    2. कनेक्ट 3 HFE सीरिंज पंपों पर घुड़सवार 2 स्पेसल तेल की सुविधा देता है और पीई टयूबिंग के dropmaking तेल inletusing टुकड़े । डिवाइस में ट्यूबों डालने से पहले, प्राइम पंपों लाइन से हवा को दूर करने के लिए ।
    3. पीसीआर मिक्स सिरिंज, microgel बूँदें सिरिंज कनेक्ट करें, और बारकोड पीई टयूबिंग का उपयोग कर अपने संबंधित की सुविधा के लिए सिरिंज बूँदें. उन्हें सिरिंज सुई को जोड़ने से पहले एक antistatic बंदूक के साथ सभी छोटी बूंद इंजेक्शन टयूबिंग गोली मारो; पीई टयूबिंग पर स्थिर प्रभार से प्रेरित छोटी बूंद संमिलन के जोखिम को antistatic उपचार कम कर देता है ।
    4. आउटलेट के लिए पीई टयूबिंग के एक टुकड़े से कनेक्ट और एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में मुक्त अंत जगह है ।
    5. इलेक्ट्रोड की सुई एक मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर एक ठंडी कैथोड फ्लोरोसेंट पलटनेवाला के लिए सिरिंज कनेक्ट. इन्वर्टर की डीसी बिजली आपूर्ति को 2 वी निर्धारित करें ।
    6. चलाने की सिफारिश की प्रवाह दरों के साथ दोहरे विलय युक्ति: ३०० µ एल/tagmented microgel बूंदों के लिए एच, १०० µ एल एच/बारकोड बूंदें के लिए, १५०० µ एल/HFE के लिए 2% w/w PFPE-खूंटी (dropmaking तेल), ६०० µ एल/एच प्रवर्धन मिश्रण के लिए, २०० µ एल/HFE के लिए 2% w/w PFPE-खूंटी ( बारकोड स्पेसर तेल), और HFE 2% डब्ल्यू/डब्ल्यू PFPE-खूंटी (microgel स्पेसर तेल) के लिए ७०० µ एल एच/। प्रत्येक ट्यूब में पायस के लगभग ५० µ एल के साथ पीसीआर ट्यूबों में बूँदें ले लीजिए ।
  7. थर्मल साइकिल चालन से पहले, सावधानी से HFE तेल की निचली परत को जेल-लोडिंग प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग करके इमल्शन से हटा दें और उंहें एफसी-४० fluorinated ऑयल के साथ बदलें जिसमें 5% w/w PFPE-खूंटी surfactant । निंनलिखित प्रोटोकॉल के साथ थर्मल चक्र: ६५ ° c के लिए 5 मिनट, ९५ ° c के लिए 2 min, 30एक्स (९५ ° c के लिए 15 s, ६० ° c के लिए 1 min, ७२ ° c 1 मिनट के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए, फिर 12 ° c पर दबाए रखें ।
  8. थर्मल चक्रित बूंदों से बारकोड डीएनए पुनर्प्राप्त करें ।
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में बूंदों पूल और PFO के 20 µ एल का उपयोग कर पायस तोड़ । मिश्रण करने के लिए 10 एस के लिए उन्हें भंवर.
    2. 1 मिनट के लिए १०,००० x जी पर ट्यूब को जलीय (ऊपर) और तेल (नीचे) चरणों में मिश्रण fractionate स्पिन । ध्यान से एक प्लास्टिक का उपयोग कर ट्यूब से ऊपरी जलीय परत को दूर करने और एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । तेल चरण छोड़ें ।
    3. निर्माता के प्रोटोकोल के अनुसार एक स्पिन कॉलम में बारकोड्ड पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें और 1x ते बफर के 20 µ l में इसे elute ।
    4. प्रदर्शन अनुक्रमण और चरण 9 और 10 के अनुसार विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।

9. पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण

  1. एकल-कक्ष लायब्रेरी sequencing के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का अनुसरण करके टुकड़ा आकार-चयन और ठहराव के लिए तैयार करें ।
  2. पढ़ें 1 के लिए डिफ़ॉल्ट रसायन विज्ञान के साथ युग्मित अंत पुस्तकालय अनुक्रम और 2 पढ़ें । एक 15-बीपी सूचकांक के लिए कस्टम सूचकांक 1 प्राइमरी I7_READ (तालिका 2) का प्रयोग करें पढ़ें, एकल सेल बारकोड के लिए इसी ।

10. एकल-सेल डाटा विश्लेषण

नोट: गुणवत्ता नियंत्रण और सिक-seq डेटा के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए कस्टम पायथन लिपियों https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq से डाउनलोड किया जा सकता है ।

  1. स्क्रिप्ट "barcodeCleanup.py" चलाएँ बारकोड पर गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए पढ़ता है और एक SQLite डेटाबेस के लिए एकल-कक्ष डेटा निर्यात करें । एक नियंत्रण प्रयोग के लिए, के साथ इस स्क्रिप्ट का उपयोग करें "-संरेखित करें" ध्वज सेट करने के लिए जाना जाता संदर्भ जीनोम के लिए पढ़ता संरेखित करें ।
  2. बारकोड समूहों की पवित्रता का विश्लेषण (एक नियंत्रण प्रयोग के लिए) स्क्रिप्ट "purity.py" का उपयोग और उच्च शुद्धता चित्रा घमण्डके साथ संगत मूल्यों की पुष्टि करें ।

Representative Results

सिक-seq प्रायोगिक कार्यप्रवाह में 3 PDMS microfluidic उपकरण हैं जो एक सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया (चित्र 1) का उपयोग करते हुए गढ़े गए हैं । एक सह प्रवाह dropmaker (चित्रा 3) एक अद्वितीय एकल सेल पहचानकर्ता के साथ जीनोमिक डीएनए लेबल के लिए डिजिटल बारकोड बूंदों के 25 µm उत्पन्न करता है । बारकोड oligonucleotides एक 15 बीपी पतित प्रवर्धन (तालिका 2, बार प्राइमरी) के लिए पीसीआर संभालती द्वारा पार्श्व अनुक्रम से मिलकर बनता है । बारकोड एकल अणु encapsulation को प्राप्त करने के लिए एक femtomolar एकाग्रता को पतला कर रहे हैं, और सभी बूंदों या तो 0 या 1 बारकोड टुकड़ा (ओं) प्राप्त करते हैं । एक बारकोड युक्त बूंदों को परिलक्षित कर रहे हैं, डबल असहाय बारकोड amplicons की कई प्रतियां उपज । एक न्यूक्लिक एसिड दाग सफल प्रवर्धन सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और बारकोड टुकड़े (चित्रा 4B) के encapsulation दर को बढ़ाता है । microgels एक जीवाणु कोशिका निलंबन और बराबर प्रवाह दर (चित्रा 2a) पर पिघला हुआ agarose जेल बहने से उत्पन्न कर रहे हैं । agarose दो बार वांछित अंतिम एकाग्रता में तैयार है, सह प्रवाह dropmaking प्रक्रिया के रूप में प्रभावी ढंग से 2 के एक कारक द्वारा जलीय समाधान पतला । के रूप में agarose ठंडा, यह एक 25 µm व्यास में जम microgel छोटी बूंद के गोलाकार मात्रा पर कब्जा ।

धोने और lysis कदम की एक श्रृंखला microgels में उच्च आणविक वजन जीनोमिक डीएनए (चित्रा बी) को शुद्ध । इमल् शन को तोड़ने के बाद, जलीय धुल को बड़ी मात्रा में बाहर किया जाता है जिससे पता लगाने वाले कार्बनिक सॉल्वैंट्स को पतला किया जा सकता है जो बहाव एंजाइमी उपचार को बाधित कर सकते हैं । धोया microgels कोशिका encapsulation दर (चित्रा 4a) सत्यापित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे मनाया जाता है । व्यापक lytic गतिविधि के साथ एंजाइमों का एक कॉकटेल बैक्टीरिया और eukaryotic रोगाणुओं के सेल दीवारों को पचाने के लिए microgel निलंबन करने के लिए जोड़ा गया है19। Proteinase कश्मीर और डिटर्जेंट के साथ एक दूसरा उपचार प्रोटीन और solubilizes कोशिका मलबे नीचा ।

शुद्ध डीएनए की Tagmentation बूंदों में किया जाता है microgels18के बीच छोटे tagmented डीएनए टुकड़े के प्रसार से उत्पंन संभावित पार संदूषण से बचने के लिए । एक छोटी बूंद encapsulation डिवाइस (चित्र बी) एक बफर और tagmentation एंजाइम के साथ प्रत्येक microgel compartmentalizes, जो एक साथ डबल-कतरा डीएनए टुकड़े जबकि यह भी "टैगिंग" यह एक oligonucleotide20के साथ । microgels करीब पैक कणों के रूप में बूंदों में भरी हुई हैं, कुछ दोहरी21 (चित्रा 4c) के साथ हर बूंद के लिए 1 microgel आ encapsulation दरों को प्राप्त करने.

microfluidic कार्यप्रवाह के अंतिम चरण में (चित्र 2c), एक युक्ति एक दोहरे विलय आपरेशन 1 बारकोड ड्रॉप संयोजन, 1 microgel-युक्त ड्रॉप, और एक नियंत्रित दो कदम प्रक्रिया में प्रवर्धन मिश्रण करता है । पहले, पीसीआर रिएजेंट युक्त एक छोटी बूंद बनती है और पीले रंग में दिखाया क्षेत्र में एक बारकोड ड्रॉप के साथ विलय (चित्रा 5) । microfluidic चैनल में समुद्री इलेक्ट्रोड एक उच्च बिजली के क्षेत्र ढाल जो छोटी बूंद विलय ट्रिगर का उत्पादन । एक समान तरीके से, पहली विलय छोटी बूंद एक microgel छोटी बूंद के साथ बनती है और लाल रंग में दिखाया क्षेत्र में एक दूसरी बार विलय कर दिया । बूंदें एकत्र की है और एक एकल ओवरलैप एक्सटेंशन (SOE) पीसीआर में थर्मल साइकिल ऑफ चिप । बारकोड और tagmented जीनोमिक डीएनए के अतिव्यापी पूरक समाप्त होता है संलयन और केवल ठीक से बारकोड निर्माण की घातीय प्रवर्धन की अनुमति ।

sequencing डेटा पहले किसी पठन गुणवत्ता द्वारा फ़िल्टर किया गया है और उसके बाद उनके 15-bp एकल-कक्ष बारकोड अनुक्रम के अनुसार पढ़ता समूह द्वारा पार्स किया गया है । एक बारकोड समूह के लिए मांय माना जाता है, यह पढ़ता की एक ंयूनतम संख्या में होना चाहिए; यह थ्रेशोल्ड sequencing डेटा की एक उपयोगी मात्रा के साथ कक्षों के लिए विश्लेषण को सीमित करता है और पीसीआर-रूपांतरित बारकोड "ऑर्फ़न" डेटासेट से निकालता है । इस नमूने को चलाने में, न्यूनतम ७.५ kbps प्रति समूह (५० पढ़ता १५० bp प्रत्येक) के लिए सेट किया गया है । बारकोड गणनाओं का समूह आकार बनाम हिस्टोग्राम दिखाता है कि मांय बारकोड समूहों का एक महत्वपूर्ण भाग केवल थ्रेशोल्ड आकार (चित्र 6A) से ऊपर है ।

एक नियंत्रण प्रयोग में जहां माइक्रोबियल समुदाय रचना जाना जाता है, शुद्धता और सापेक्ष बहुतायत मैट्रिक्स एक सिक-seq चलाने की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है । यहां, एक सिंथेटिक 10-सेल समुदाय 3 ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, 5 ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया, और 2 खमीर से मिलकर विश्लेषण किया है । एक दिए गए बारकोड समूह की पवित्रता समूह में पढ़ता की कुल संख्या से विभाजित समूह में सबसे आम जीनोम के लिए मानचित्रण पढ़ता की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है । बारकोड समूहों के विशाल बहुमत ०.९५ (चित्रा घमण्ड) से अधिक purities है । सेल प्रकार के सापेक्ष बहुतायत कच्चे पढ़ता गिनती और बारकोड समूहों, जहां समूहों को अपने सदस्य की आम सहमति के लिए इसी एक सेल प्रकार आवंटित कर रहे हैं गिनती द्वारा गणना की जाती है (चित्रा 6C) । पढ़ता है और बारकोड समूहों की बहुतायत मोटे तौर पर बराबर अनुपात में ट्रैक, यह दर्शाता है कि कोशिका आबादी ऐसी है कि कुछ प्रजातियों में निहित नहीं है नमूना किया जा रहा है अधिकतर छोटे या बड़े बारकोड समूहों । एक ही प्रजाति से सभी बारकोड समूहों के समग्र कवरेज की साजिश रचने पूरे जीनोम भर में एक उच्च कवरेज इंगित करता है, कुछ या कोई dropout क्षेत्रों के साथ (चित्रा 7) । कवरेज की एकरूपता सबसे औसत (चित्रा 7, इनसेट) के आसपास केंद्रित अधिकांश मूल्यों के साथ, सामान्यीकृत कवरेज मूल्यों की एक आवृत्ति वितरण के साथ सत्यापित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : photolithography द्वारा microfluidic उपकरणों का निर्माण. (क) एक ही सुविधा की ऊंचाई के साथ मास्टर मोल्ड एक सिलिकॉन वेफर पर स्पिन कोटिंग एसयू की एक परत-8 photoresist द्वारा गढ़े जाते हैं । photoresist तो एक photolithographic मास्क और यूवी प्रकाश के साथ पैटर्न है, crosslinking उजागर एसयू-8 । अंत में, uncrosslinked SU-8 एक डेवलपर स्नान में भंग कर रहा है । जिसके परिणामस्वरूप मोल्ड कास्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है PDMS जो एक गिलास स्लाइड करने के लिए बंधुआ है पूरा microfluidic डिवाइस का उत्पादन । (ख) एक डबल परत डिवाइस के लिए, निर्माण इसी तरह स्पिन कोटिंग और जोखिम कदम के साथ शुरू होता है । फिर दो-लेयर डिवाइस बनाने के लिए ये चरण दोहराए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सिक-seq कार्यप्रवाह का अवलोकन. (क) एक माइक्रोबियल निलंबन microgels में एकल कोशिकाओं encapsulate करने के लिए एक dropmaker डिवाइस में पिघला हुआ agarose के साथ सह-प्रवाहित है । (B) जीवाणु जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करने के लिए microgels को धुल की श्रृंखला के अधीन कर रहे हैं । Lytic एंजाइमों ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और खमीर के सेल दीवारों को पचाने, और डिटर्जेंट सेलुलर मलबे solubilizes । microgels tagmentation के लिए बूंदों में फिर से encapsulated को पार संक्रमण को कम कर रहे हैं । (ग) microfluidic विलय एक डिजिटल पीसीआर बारकोड, एक tagmented microgel जीनोम को जोड़ती है, और एक दर पर एक प्रवर्धन मिश्रण > 1 kHz । ऑफ चिप SOE-पीसीआर tagmented जीनोम पर एक अद्वितीय एकल सेल बारकोड ब्याह और चुनिंदा पूरी तरह से बारकोड निर्माण को परिवर्धित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: dropmaking और microgel पुनः encapsulation के लिए Microfluidic उपकरणों। (a) यह पैनल एक सह प्रवाह dropmaker (फ़ीचर ऊंचाई के 25 µm) दिखाता है । कोशिकाओं और पिघला हुआ agarose एक 25 µm x 25 µm जंक्शन पर 25 µm बूंदों का उत्पादन करने के लिए समान प्रवाह दरों पर डिवाइस में पेश कर रहे हैं । डिजिटल बारकोड dropmaking के लिए, सेल प्रवेश खामियों को दूर किया है, और एक पीसीआर मिश्रण agarose प्रवेश में शुरू की है । (B) यह पैनल एक microgel री-encapsulation डिवाइस (25 µm of feature ऊँचाई) दिखाता है । एक कीप के आकार का प्रवेश में microgels प्रवाह को बनाए रखने के अपने करीब आदेश पैक और tagmentation मिश्रण की एक मात्रा पुनः से पहले प्राप्त एक 25 µm x 30 µm जंक्शन पर encapsulation । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : बूंदों और microgels की माइक्रोग्राफ । (क) यह पैनल एंजाइमी lysis से पूर्व २५ µm microgels को धोया दिखाता है. बैक्टीरिया ठहराव encapsulation की दर के लिए फ्लोरोसेंट दाग रहे हैं । Poisson लोड हो रहा है आँकड़े हुक्म है कि कोशिकाओं 1 की दर से समझाया जाना चाहिए 10 बूँदें या कम में एकाधिक-encapsulation घटनाओं की आवृत्ति को कम करने के लिए. (ख) यह पैनल एक न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ इलाज किया 25 µm डिजिटल बारकोड बूंदों की एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि दिखाता है । परिवर्धित बारकोड अंशों वाली बूंदें एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत का उत्पादन करतीं हैं । (ग) यह पैनल ५० µm बूंदों में microgels पुनः encapsulated दिखाता है । microgels के करीब पैकिंग कुछ दोहरी के साथ ड्रॉप प्रति 1 जेल आ encapsulation दरों के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : एकल-सेल जीनोम barcoding के लिए Microfluidic दोहरे विलय डिवाइस । एक दो कदम विलय आपरेशन जोड़े एक उच्च प्रवाह में tagmented जीनोम के साथ बारकोड बूंदों । पीसीआर मिक्स की एक छोटी बूंद पहले उत्पन्न होता है और समुद्री इलेक्ट्रोड का उपयोग कर पीले रंग में दिखाया क्षेत्र में एक बारकोड छोटी बूंद के साथ विलय कर दिया । अगला, एक microgel युक्त एक छोटी बूंद शुरू की है और लाल रंग में दिखाया क्षेत्र में एक दूसरी बार विलय कर दिया । तेल reइंजेक्टेड बूंदों के बीच की रिक्ति की सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । बारकोड इंजेक्शन चैंबर और उसके स्पेसर तेल कम 25 µm परत पर रखा जाता है, नीले रंग में छायांकित । अन्य सभी डिवाइस सुविधाओं की कुल ऊंचाई के ४५ µm के साथ मोटा परत करने के लिए संबंधित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : एक 10-सेल सिंथेटिक माइक्रोबियल समुदाय के लिए बारकोड समूह मेट्रिक्स । (A) यह पैनल बारकोड समूह आकारों का वितरण दिखाता है । समूह आकार बढ़ाता है के रूप में किसी दिए गए आकार के समूहों की संख्या तीव्र रूप से घटाता है । प्रति समूह ७.५ kbps की ंयूनतम सीमा विश्लेषण को पर्याप्त मात्रा में जानकारी के साथ समूहों के लिए सीमित करता है और "लावारिस" पीसीआर-रूपांतरित अनुक्रम को निकालता है । (B) यह पैनल बारकोड समूह purities का वितरण दिखाता है । विशाल बहुमत (> समूहों के 90%) बहुत उच्च शुद्धता के है (> 95%) । (ग) यह पैनल पढ़ने और बारकोड समूह स्तर पर परिकलित 10 प्रजातियों में से सापेक्ष बहुतायत दिखाता है । 2 गिनती तरीकों समान परिणाम का उत्पादन, यह दर्शाता है कि बारकोड समूह आकार प्रजातियों में संगत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : कुल जीनोमिक कवरेज के बैसिलस सबटिलिस बारकोड समूह. जीवाणु B. सबटिलिस (N = ९,३९८) के लिए मैपिंग सभी बारकोड समूहों से पढ़ता है pooled और कुल में विश्लेषण किया है । एक परिपत्र कवरेज मानचित्र सिक के कवरेज एकरूपता-seq पढ़ता है, कोई चौकस dropout क्षेत्रों के साथ दिखाता है । परिधि के चारों ओर एक डैश्ड रेखा औसत कवरेज (5.55 x) को इंगित करती है । सापेक्ष कवरेज के इनसेट हिस्टोग्राम आवृत्तियों से पता चलता है कि कुर्सियां के एक थोक जीनोम चौड़ा औसत के पास एक गहराई में शामिल हैं, डैश्ड लाइन द्वारा प्रतिनिधित्व किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

डिवाइस 1 परत ऊंचाई (µm) 1 परत स्पिन स्पीड (rpm) 2 परत ऊंचाई (µm) 2 परत स्पिन स्पीड (rpm)
सह प्रवाह dropmaker 25 ४००० N/A N/A
जेल पुनः encapsulater 25 ४००० N/A N/A
दोहरे विलय 25 ४००० 20 ५०००

तालिका 1: डिवाइस निर्माण पैरामीटर्स Microfluidic. यह तालिका photoresist स्पिन कोटिंग के लिए उनकी आवश्यक गति के साथ सिक-seq कार्यप्रवाह में प्रयुक्त microfluidic उपकरणों की एक सूची (एसयू-८ ३०२५ के लिए निर्माता के विनिर्देशों के आधार पर) दिखाती है ।

लेबल अनुक्रम (5 ' > 3 ')
पट्टी GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

तालिका 2: प्राइमरी जुगाड़ ।

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Discussion

सिक-seq microfluidic कार्यप्रवाह बैक्टीरियल कोशिकाओं के हजारों से एकल सेल जीनोम अनुक्रमण डेटा का उत्पादन । microgel-encapsulated कोशिकाओं के जीनोम पर ब्याह डिजिटल बारकोड एक ही सेल से उत्पंन बारकोड पढ़ता के समूहों में NGS डेटा के silico deconvolution में के लिए अनुमति देते हैं । ज्ञात संरचना के एक माइक्रोबियल समुदाय के साथ एक नियंत्रण प्रयोग बारकोड समूहों की शुद्धता के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है । कम शुद्धता वाले समूहों का एक बड़ा अंश इंगित करता है कि सेल encapsulation दर बहुत अधिक है या कि वहां महत्वपूर्ण छोटी बूंद पार-दूषण microfluidic संसाधन चरणों के दौरान होने वाली है । Poisson सांख्यिकी के अनुसार, बारकोड और कोशिकाओं को हर 10 बूंदों के लिए 1 कण का लक्ष्य अनुपात में encapsulated किया जाना चाहिए करने के लिए एकाधिक encapsulation घटनाओं की दर से कम 5% सभी गैर खाली बूंदों की सीमा । एक encapsulation दर इस से अधिक तेजी से दोहरी की दर बढ़ जाती है, तो dropmaking प्रक्रिया के दौरान encapsulation अनुपात के सत्यापन महत्वपूर्ण महत्व का है । उपयोगकर्ताओं को एक से अधिक कक्षों के encapsulation के विशेष रूप से सतर्क होना चाहिए एक ही microgel में एक ही बारकोड अनुक्रम साझा करने वाले विभिंन कक्षों से पढ़ता है bioinformatically अलग नहीं किया जा सकता । मामले में है कि 1 सेल 2 अलग बारकोड प्राप्त करता है, बारकोड समूह शुद्धता अप्रभावित है, हालांकि बहुतायत मैट्रिक्स जब बारकोड अनुक्रम द्वारा गिनती विषम हैं ।

छोटी बूंद पार-संदूषण भी उप इष्टतम विलय की स्थिति के कारण पैदा हो सकती है । एक सफल ऑपरेशन के दौरान, microfluidic विलय डिवाइस (चित्रा 5) नियंत्रण 1 microgel और पीसीआर रिएजेंट की एक मात्रा के साथ 1 बारकोड छोटी बूंद जोड़ी कर सकते हैं । गैर आदर्श प्रवाह दरों में एक छोटी बूंदें गलत अनुपात पर बाँधना में परिणाम होगा: 1 बारकोड 2 microgels के साथ जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए. प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सभी प्रवाह दरों का अनुमान लगाया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं और डिवाइस ज्यामिति और छोटी बूंद आकार में मामूली बदलाव के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । उच्च गति रिकॉर्डिंग क्षमताओं के साथ कैमरों के लिए उपयोग के साथ उपयोगकर्ताओं (> 10, 000 फ्रेम/एस) शुरुआत में सही छोटी बूंद विलय और microfluidic आपरेशन के पाठ्यक्रम पर सत्यापित करना चाहिए । एक उच्च गति कैमरे के लिए उपयोग के बिना उपयोगकर्ताओं को विलय उत्पादन की एक छोटी मात्रा में इकट्ठा कर सकते है और मैंयुअल रूप से एक खुर्दबीन के नीचे छोटी बूंद आकार उपाय । छोटी बूंद का आकार एक समान होना चाहिए: अनमर्ज्ड बारकोड्स या microgel ड्रॉप्स की एक अतिरिक्त इंगित करता है कि इंजेक्शन दरों तदनुसार कम किया जाना चाहिए ।

कई सामांय सावधानियों लिया जाना चाहिए जब microgels और microdroplets हैंडलिंग के लिए अपनी अखंडता की रक्षा । Microgels, हालांकि यांत्रिक रूप से मजबूत, पर्याप्त रूप से ठंडा करने से पहले तोड़ने और धुलाई कदम को पूरा जमाना सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए । गैर गोलाकार microgels एक संकेत हैं कि agarose को जमना के लिए पर्याप्त समय नहीं दिया गया । जब microgels धोने, उत्पाद की हानि से बचने के लिए आवश्यक गति पर नीचे निलंबन स्पिन । Agarose hydrogel एक अपवर्तन सूचकांक है कि पानी की बारीकी से मिलान और एक ट्यूब में देखना मुश्किल हो सकता है22, इसलिए उपयोगकर्ताओं को सावधानी से आकांक्षा से पहले जेल तरल सीमा की पहचान करनी चाहिए । पानी में तेल बूंदें प्रयोगशाला दस्ताने और टयूबिंग पर स्थैतिक बलों23 के निर्माण के द्वारा संमिलन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस कारण से, हम नंगे हाथों से छोटी बूंद reinjection सिरिंज लोड करने की सलाह देते हैं और पंप भड़काने से पहले एक विरोधी स्थैतिक बंदूक के साथ सभी इंजेक्शन लाइनों के इलाज. बड़े coalesced बूंदें धीरे से एक सिरिंज में इमल्शन घूर्णन और मैंयुअल रूप से बड़ी बूंदें, जो अपने बड़े बोया बल के कारण शीर्ष के पास जमा aspirating द्वारा हटाया जा सकता है ।

सिक-seq पहली तकनीक है जो > 50, 000 बैक्टीरियल कोशिकाओं के एकल-सेल जीनोम अनुक्रमण को प्रदर्शित करती है । इस मंच मौजूदा दृष्टिकोण पर प्रवाह में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है और विषम माइक्रोबियल समुदायों के एक गहरे नमूने सक्षम बनाता है । तारीख करने के लिए, एकल सेल जीनोम अनुक्रमण के लिए microfluidic प्रौद्योगिकियों सेल अलगाव और प्रवर्धन के लिए microchambers9 और microwells24 कार्यरत है, लेकिन कोशिकाओं के सैकड़ों करने के लिए केवल दसियों की सीमा में प्रवाह के साथ. wellplates5,6 में एकल कोशिकाओं की छंटाई प्रवाह कोई विशेष microfluidic उपकरण की आवश्यकता है,लेकिन एक इसी तरह कम प्रवाह के पास । यह देखते हुए कि मिट्टी और पर्यावरण से पानी के नमूनों आमतौर पर > 1, 000 प्रजातियों में25,26, seq के अल्फा विचलन है, सिक-अपनी क्षमता के लाभ के लिए बहुत से लाभप्रद है जीवों की अभी तक अधिक से अधिक संख्या । सिक-seq कार्यप्रवाह प्रयोगशाला संस्कृति, प्राकृतिक वातावरण, या एक जीवित मेजबान से सेल आदानों के लिए अनुकूल है । एक सेल नमूना केवल एक जलीय निलंबन और बड़े कणों से मुक्त होने की जरूरत है (> 10 µm) microfluidic encapsulation के लिए उपयुक्त हो । उदाहरण के लिए, विधि पहले की एक श्रृंखला का उपयोग कर समुद्री जल का एक नमूना करने के लिए लागू किया गया है और पूर्व प्रक्रिया के लिए चरणों को छानने से पहले17encapsulation ।

सिक-seq प्रोटोकॉल प्रत्येक एकल कक्ष से sequencing डेटा की अपेक्षाकृत विरल मात्रा जनरेट करता है और सभी अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । कुछ bioinformatics एल्गोरिदम जैसे de नोवो जीनोम असेंबली या एकल न्यूक्लियोटाइड वैरिएंट (SNV) कॉलिंग को प्रभावी रूप से कार्य करने के लिए उच्च कवरेज गहराई की आवश्यकता होती है । इसके बजाय, बारकोड समूह silico में वर्गीकरण27 विधियों द्वारा संकुल किया जा सकता है ताकि एल्गोरिदम का बड़ा सेट पर लागू किया जा सकता है पढ़ता है । सिक-seq कार्यप्रवाह की अपेक्षाकृत कम समग्र barcoding दक्षता उन मामलों में भी चुनौतियां पेश कर सकती है जहां इनपुट नमूने की उपलब्धता कम है । सिक-seq एक Poisson-वितरित बारकोड encapsulation कदम पर निर्भर करता है, इसलिए कोशिकाओं के लगभग 10% एक आणविक बारकोड प्राप्त करते हैं और अंतिम पुस्तकालय तैयारी कदम के दौरान परिवर्धित कर रहे हैं. हालांकि यह अन्य microdroplet-आधारित barcoding योजनाओं के लिए तुलनीय है10, उपयोगकर्ताओं द्वारा बहुमूल्य सेल नमूनों के साथ कार्य करने से अनुक्रमण के लिए पर्याप्त पुस्तकालय उपज प्राप्त करने में कठिनाई हो सकती है और अंतिम में पीसीआर चक्र की संख्या बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है प्रवर्धन कदम । microfluidic विशेषज्ञता वाले उपयोगकर्ताओं के लिए एक और संभावित समाधान डिजिटल पीसीआर चरण के बाद सकारात्मक बारकोड बूंदों को क्रमबद्ध करना है, जिससे समग्र barcoding दक्षता को > 85%28पर ला सके ।

सिक-seq प्रौद्योगिकी के लिए एक संभावित भविष्य की दिशा कार्यप्रवाह स्तनधारी कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूल है, नए नैदानिक एकल सेल अध्ययन के लिए जिस तरह फ़र्श । एक उदाहरण के रूप में, एकल कैंसर कोशिकाओं के बीच कॉपी संख्या भिंनता के एक विश्लेषण कैंसर पैथोलॉजी2में विविधता की भूमिका की हमारी समझ को आगे कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, एकीकृत सिक-seq मौजूदा तरीकों के साथ जांच करने के लिए और ब्याज की डीएनए दृश्यों को समृद्ध29 उपजनसंख्या या कोशिकाओं के दुर्लभ उपभेदों के लक्षित एकल सेल अनुक्रमण सक्षम होगा । पर्यावरण के नमूनों के साथ, जीन एक ज्ञात चयापचय मार्ग के भीतर से निशाना बनाया जा सकता है और संदर्भ के पड़ोसी जीन के साथ विश्लेषण के लिए उपंयास जीनोमिक द्वीपों की पहचान । एक मानव मेजबान पर्यावरण के भीतर से, कम titer रोगजनक बैक्टीरिया के नमूनों और अलग किया जा सकता है एक सेल स्तर पर अनुक्रम को और अधिक बारीकी से डाह के अपने genotypic मूल की जांच ।

Disclosures

इस कार्यप्रवाह से संबंधित पेटेंट मिशन बायो के लिए लाइसेंस प्राप्त कर सकते हैं, जिनमें से एडम आर थमी एक शेयरधारक है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा एक कैरियर अवार्ड (ग्रांट नंबर DBI-१२५३२९३) के माध्यम से समर्थित किया गया; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) (अनुदान संख्या HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); और डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी लिविंग ढलाई प्रोग्राम (अनुबंध संख्या HR0011-12-सी-००६५, N66001-12-सी-४२११, HR0011-12-सी-००६६) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३५ Microfluidics microdroplets एकल सेल जीनोमिक्स metagenomics अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आणविक barcoding
एकल-कक्ष जीनोम sequencing के लिए एक Ultrahigh-प्रवाह Microfluidic प्लेटफ़ॉर्म
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Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

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