Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Published: May 23, 2018 doi: 10.3791/57598
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Encellede sekventering afslører genotypiske heterogenitet i biologiske systemer, men aktuelle teknologier mangler overførselshastighed noedvendigt for deep profilering af Fællesskabets sammensætning og funktion. Her, vi beskriver en mikrofluid arbejdsproces til sekvensering > 50.000 encellede genomer fra forskellige celle populationer.

Abstract

Sekventering teknologier har undergået et paradigmeskift fra bulk enkelt celle beslutning som reaktion på en voksende forståelse af rollen af cellulære heterogenitet i biologiske systemer. Dog er én celle sekventering af store befolkningsgrupper blevet hæmmet af begrænsninger i behandlingen af genomer til sekvensering. I dette papir beskriver vi en metode til encellede genome sequencing (SiC-seq) som bruger droplet mikrofluidik til at isolere, forstærke og stregkode genomer af enkelt celler. Celle indkapsling i microgels tillader opdelte rensning og tagmentation af DNA, mens en mikrofluid fusion effektivt par hver genom med en unik encellede oligonukleotid stregkode, tillader > 50.000 enkelt celler til at blive sekventeret pr. løb. Sequencing data er demultiplexed af stregkode, generere grupper af læser med oprindelse fra enkelt celler. Som en høj overførselshastighed og lav-bias metode af encellede sekventering giver SiC-seq en bredere vifte af genomisk undersøgelser rettet mod forskellige cellepopulationer.

Introduction

Genomet, der fungerer som en blåstempling af cellulære identitet og funktion, som indeholder i sin helhed af en organisme kodning potentiale. En forståelse af cellebiologi på niveauet genom kan forklare de observerede fænotypiske mangfoldighed inden for heterogen cellepopulationer. Denne forskelligartethed viser sig i biologiske systemer og har omfattende konsekvenser for menneskers sundhed og sygdom. Eksempelvis er gen kopi nummer variationer blandt tumorceller knyttet til udvikling og spredning af kræft1,2. I bakterielle infektioner, patogenicitet øer i en lille brøkdel af genomer kan overføres horisontalt og føre til spredning af antibiotikaresistente bakterier3,4. En primære udfordring i at studere genomer på én celle-niveau er de lave mængder af DNA tilgængelige, samt behovet for at analysere tusindvis af celler til at prøve det fulde mangfoldighed af genotyper. Af disse grunde har begrænsninger i eksperimentel overførselshastighed hindret effektiviteten af encellede undersøgelser, påvirke resultaterne mod de mest rigelige celler. Encellede isolation teknikker såsom flow sortering5,6, Optisk pincet7, nedstøbning i bulk geler8og mikrofluidik9 er i stand til at behandle hundredevis af celler til sekvensering; Dette udgør dog kun en lille brøkdel af de fleste prøver. En metode til enkelt celle genome sequencing med væsentligt højere overførselshastighed ville give mulighed for dybere og mere komplet profilering af cellepopulationer, dermed belyse rollen af genotypiske mangfoldighed inden for disse samfund.

Droplet mikrofluidik giver høj overførselshastighed manipulation af celler og biologiske reagenser inden for millioner af picoliter-skala reaktorer. Til dato, microdroplet teknologier har været brugt til at studere differential udtryk mønstre blandt celler fra heterogen væv10,11,12, dybt sekvens lange molekyler13,14 ,15, og adfærd kromatin immunoprecipitation sekventering (ChiP-seq) analyser på enkelt celler16. Microdroplets er faktisk i stand til at høj overførselshastighed, opdelte operationer, hvilket gør dem imødekommenhed over for programmer i én celle genomforskning. Udviklingen af denne teknologi præsenterer sin egen unikke teknologiske udfordringer, dog. Celler skal mængden, renset og forstærket med minimal skævhed, at ensartet prøve cellepopulationer. Desuden, i modsætning til polyadenylated mRNA udskrifter i pattedyrceller er der ingen sammenlignelige molekylære motiv i genom til lette erobringen af target-nukleinsyre. Af disse grunde, har encellede genome sequencing været vanskeligt at implementere i microdroplet platforme.

I dette arbejde giver vi en detaljeret protokol af vores tidligere rapporteret encellede mikrofluid tilgang i stand til sekvensering genomer af titusinder af celler i et enkelt eksperiment17. Med denne teknologi, kaldet SiC-FF., bakterieceller indkapsles i micron-skala hydrogels og individuelt mængden, tagmented, og flettet med et microdroplet, som indeholder en unik oligonukleotid stregkode, som er splejset på cellens genomisk DNA via en enkelt overlapning udvidelse polymerase kædereaktion (PCR). Hydrogels tjene som isolerede beholdere, hvor høj molekylvægt genomisk DNA er sterically indkapslet, giver mulighed for mindre molekyler såsom rengøringsmidler og lytisk enzymer til at få adgang til og rense DNA før stregkodesystem18. Denne protokol processer > 50.000 enkelt celler i løbet af få timer, hvilket resulterer i en barcoded bibliotek klar til sekvensering. Efter sekvensering er læser demultiplexed ifølge deres encellede stregkode sekvens, hvilket resulterer i et datasæt bestående af millioner af læser, hver med en cellulær indeks.

Protocol

1. mikrofluid enhed fabrikation

  1. Forberede mikrofluid maske designs ved hjælp af computer-aided design (CAD) programmel (forudsat som. DWG; Se Supplerende filer). Har disse designs trykt af leverandøren med en 10 µm opløsning på en printplade film.
    Bemærk: For multi-lag mikrofluid enheder, de tilsvarende masker indeholder justering mærker.
  2. For hver enhed, fremstil SU-8 master mold (figur 1A) som følger.
    1. Forberede en 3 - tommer diameter silicium wafer ved at hælde ca. 1 mL af SU-8 3025 photoresist på midten af wafer. Sikre wafer på spin coater chuck ved at anvende suge.
    2. Se tabel 1 for en liste over lag tykkelser og spin hastigheder for hver enhed. For alle enheder, begynder spin belægning med 30 s på 500 rpm, efterfulgt af 30 s på den angivne hastighed.
    3. Fjerne SU-8-silicium wafer fra spin coater og bløde bage det på en kogeplade, indstillet til 135 ° C i 30 min. tillade wafer afkøle til stuetemperatur efter bagning.
    4. Udsætte SU-8-silicium wafer med passende mikrofluid masken under en kollimeres 190-mW, 365-nm UV LED i 3 min.
    5. Efter eksponering, hårde bages wafer på en kogeplade indstillet til 135 ° C i 1 min. Efter trinnet bagning tillade wafer afkøle til stuetemperatur.
    6. For en enkelt-lags mikrofluid enhed, spring til trin 1.2.7. For en flerstrenget mikrofluid enhed, skal du gentage trin 1.2.1 - 1.2.5 til det andet lag af photoresist (figur 1B).
    7. Efter de første hårdt bages i et enkelt lag enhed (eller den anden hård bages i en flerstrenget enhed), udvikle wafer ved at nedsænke det i et bad af propylenglycol mellem ether acetat (PGMEA) i 30 min.
    8. Efter den wafer udvikling, skal du bruge en sprøjte flaske der indeholder PGMEA til at skylle wafer. Derefter skylles wafer med en sprøjte flaske der indeholder isopropanol før du placerer det på en 135 ° C kogeplade i 1 min til tørre.
    9. Placere den wafer (herefter benævnt master) i en petriskål til støbning med Polydimethylsiloxan (PDMS).
  3. Med master forberedt i trin 1.2, fortsætte med at udføre enhed fabrikation med en PDMS støbning.
    1. Forberede PDMS ved at kombinere en silikone base med en hærdning agent i en 11:1 ratio af massen. Bland silikone base og hærder i hånden med en røre pind.
    2. Degas PDMS ved at placere det i en afgasning kammer og anvende et vakuum. Tillad PDMS at degas indtil luftboblerne er ikke længere synlige (typisk 30 min).
    3. Omhyggeligt hæld den afgassede PDMS over master, at endelige PDMS-lag tykkelse af ca 5 mm. Degas PDMS igen at sikre fjernelse af eventuelle luftbobler.
    4. Efter afgasning, bage PDMS og master ved 80 ° C til 80 min.
    5. Omhyggeligt Punktafgifter hærdede PDMS slab fra bagt master ved hjælp af et barberblad. Sikre, at alle nedskæringer oven på silicon wafer.
      Bemærk: Enhver nedskæringer ud silicium wafer kan resultere i en lip forhindrer en ensartet limning.
    6. Punch indgange og udgange ved hjælp af en 0,75 mm biopsi punch. Fjerne noget støv og omstrejfende PDMS ved hjælp af en emballage tape på funktion siden af enheden.
    7. Før plasma behandling af enheden, rense et 50 mm x 75 mm glas dias ved at skylle det med isopropanol og udtørre den.
    8. Placer PDMS slab og glas dias i plasma bonder med funktionerne opad for behandlingen af plasma. Udføre plasma behandlingen bruge 1 mbar O2 plasma for 1 min. Bond enhed til glasset glider ved at bringe de udsatte, eller opad, sider sammen.
    9. Efter behandlingen af plasma bage enhed ved 80 ° C i 40 min.
    10. Endelig, injicere glas overfladebehandling væske i en af fjorde til at gengive mikrofluid kanalerne hydrofobe. Sikre alle kanaler er helt oversvømmet med løsningen og Gentag injektion for hver dropmaker. Bage behandlede enheden ved 80 ° C i 10 min til at fordampe overskydende opløsningsmiddel.

2. indkapsling af celler i Agarosen Microgels

Bemærk: Se figur 2A.

  1. Forberede 1 mL 3% w/v lav-smeltende temperatur Agarosen i 1 x Tris-EDTA (TE) buffer. Holde Agarosen løsning på en 90 ° C varme blok indtil umiddelbart før sprøjten lastning.
  2. Forberede cellesuspension.
    Bemærk: Denne protokol og dens tilhørende mikrofluid enheder er blevet valideret for at arbejde med bakterieceller, enten fra en frossen bestand eller frisk forberedelse. Pattedyrceller, afhængigt af hvilken celle kan kræve en justering af mikrofluid kanal dimensioner til at rumme de større cellestørrelser.
    1. Resuspend celler i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Tælle celler i en hemocytometer eller af flow sortering. 25 µm microgels med en målbeløbet celle indkapsling af 1 ud af 10, forberede 1 mL cellesuspension i en endelig koncentration på 2.4 x 107 celler/mL.
    3. Spin cellerne ned ved 3.000 x g i 3 min. aspirat supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL af 17% v/v tæthed gradient medium (Se Tabel af materialer) i PBS. Holde det på køl indtil sprøjten lastning.
  3. Indlæse en 3-mL sprøjte med fluorholdige olie (HFE) indeholder et 2% w/w produktion-polyethylen glycol (PFPE-PIND) overfladeaktivt stof, passer det med en 27 G kanyle, og læg det i en sprøjten pumpe.
    Bemærk: Passer alle sprøjter med en 27 G kanyle til mikrofluid trin i denne protokol. For at mindske risikoen for utilsigtet prikkende, skal du holde caps på alle nåle, indtil handlingen pumpe begynder.
  4. Indlæse cellesuspension og smeltet Agarosen i 1 mL sprøjter, passer både med 27-gauge nåle og placere disse i sprøjten pumper.
  5. Holde Agarosen sprøjte og pumpe varme med en lille plads varmeapparat til at forhindre Agarosen fra geldannende i sprøjten og fjorden rør. Indstille plads varmelegeme til høj og Placer det, så den varme overflade er ca 10 cm væk fra sprøjten. Sikre, at temperaturen målt på sprøjten ca 80 ° C.
    Bemærk: Brugere rådes til at opretholde varmeren på den anbefalede afstand fra pumpning apparatet til at reducere risikoen for udstyr skader, herunder smeltning af slangen.
  6. Generere 25 µm microgel dråber bruger Co flow dropmaking enhed.
    Bemærk: Se figur 3A for en skematisk, der angiver placeringen af reagens indløb og udløb enhed.
    1. Slut sprøjten nåle til mikrofluid enhed fjorde ved hjælp af stykker af polyethylen (PE) rør. Før du indsætter rør i enheden, prime pumper for at fjerne luft fra linjen.
    2. Tilsluttes en stikkontakt et stykke slange og placere den frie ende i en 15 mL collection tube.
    3. Brug de følgende (anbefalede) strømningshastigheder for dropmaking: 800 µL/h for HFE 2% w/w PFPE-PIND; 200 µL/h for cellesuspension i PBS; og 200 µL/h for 3% w/v agarosegelelektroforese.
  7. Efter dropmaking, samling røret anbringes ved 4 ° C i 30 min til at sikre den fuldstændige gellation for agarosegelelektroforese.

3. bryde og vask Agarosen Microgels

  1. Fjerne det nederste lag af olie fra samling røret ved hjælp af en 3 mL sprøjten udstyret med en 20 G kanyle, pas på ikke for at forstyrre det øverste lag af Agarosen dråber.
  2. Bryde emulsioner med perfluorooctanol (PFO).
    1. Tilsæt 1 mL 10% v/v PFO i HFE til Agarosen dråber. Med pipette overfoeres denne løsning op og ned til 1 min til grundigt frakke af emulsioner.
      Bemærk: For alle microgel vaske trin, afpipetteres løsninger med en 1.000 µL spids. Microgel suspension skal vises homogene og fri for klumper efter pipettering det.
    2. Spin den koniske rør ved 2.000 x g i 1 min til at indsamle Agarosen microgels. Fjerne PFO/HFE supernatanten ved aspiration; microgels er nu fri for deres overfladeaktivt stof lag og vises tydeligt.
  3. Vask microgels med et overfladeaktivt stof i hexan.
    Forsigtig: Hexan er en flygtig organisk opløsningsmiddel, og vask i trin 3,3 gennemfoeres i et stinkskab.
    1. Der tilsættes 2 mL 1% v/v sorbitan monooleate nonionisk overfladeaktivt stof (Se Tabel af materialer) i hexan til Agarosen microgels. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande, at sikre komplet opløsningen af microgel pellet.
    2. Spin rør ved 1.000 x g i 1 min til at indsamle microgels. Opsug supernatanten for at fjerne overfladeaktivt stof/hexan løsning.
    3. Gentag overfladeaktivt stof/hexan vask.
  4. Vask af microgels i en vandig buffer til at fjerne enhver resterende organisk opløsningsmiddel.
    1. Der tilsættes 5 mL af TET buffer [0,1% v/v octylphenol nonylphenolethoxylat nonionisk detergent (Se Tabel af materialer) i 1 x TE] til det koniske rør. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande.
    2. Spin den koniske rør på 2.000 x g for 2 min til at indsamle microgels. Opsug supernatanten for at fjerne TET buffer.
    3. Gentag TET vaske 2 x.
    4. Tilsættes 5 mL af 1 x TE buffer til det koniske rør. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande.
    5. Spin den koniske rør på 2.000 x g for 2 min til at indsamle microgels. Opsug supernatanten for at fjerne TE-buffer.
    6. Gentag TE vask.
  5. Kontrollere celle indkapsling i microgels under et mikroskop på en 400 X forstørrelse af farvning en 10 µL alikvot af geler med 1 x nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Microgels vises klart under den gennemsigtige kanal mens celle DNA vil fluorescerer under normal god landbrugspraksis kanal (497/520 nm excitation/emission bølgelængder). En overlejring af gennemsigtige og fluorescerende kanaler vil vise cellerne i microgels, som vist i figur 4A.

4. lysering af celler i Agarosen via lytisk enzymer

  1. Forberede 1 mL af en lytisk enzym cocktail ved hjælp af 800 µL af TE buffer (1 x), 2 µL af gær lytisk enzym (5. U/µL stock, 10 U/mL endelige) 30 µL af dithiothreitol (1 M lager, 30 mM endelige), 60 mg lysozym (frysetørret pulver), 15 µL af EDTA (0,5 M lager 7.5 mM endelige), 2 µL af mutanolysin (100 U/µL stock, 200 U/mL endelige), 2 µL af lysostaphin (10. U/µL stock, 20 U/mL endelige) og 30 µL af NaCl (1 M lager, 30 mM endelige).
  2. Tilføje yderligere TE for at bringe volumen til 1 mL. Bland opløsningen af vortexing.
  3. Tilføje den hele 1 mL af opløsningen, lytisk enzym til ikke mere end 1 mL af den vasket microgels. Mix af pipettering 10 x. Inkuber blanding ved 37 ° C for > 2 h i en shaker (maksimum er natten inkubation).

5. vaskemiddel-baseret Microgel behandling

  1. Vaske microgels efter lysis via lytisk enzymer (trin 4).
    1. Spin ned microgels på 2.000 x g i 2 min. og Opsug supernatanten. Dråberne vises uigennemsigtig hvid på grund af celle debris spredt i toerstoffet.
    2. Resuspend microgels i 5 mL i 10 mM Tris-HCl buffer og afpipetteres op og ned 10 x at blande.
    3. Spin blandingen ned på 2.000 x g i 2 min., så Fjern supernatanten ved aspiration.
  2. Udføre en vaskemiddel behandling på microgels.
    1. Resuspend geler i en lithium dodecyl sulfat (låg) lysisbuffer (0,5% w/v låg i 20 mM Tris-HCl) og 60 µL af 0,5 M EDTA til en endelige mængden af 3 mL.
    2. Tilsæt 5 µL af en Proteinase K enzym (800 U/mL bestand). Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande, inkuberes derefter blandingen på 42 ° C på en varme blok 1 h solubilize cellemembraner og fordøje proteiner.
  3. Vaske microgels efter behandlingen af vaske-og rengøringsmidler.
    1. Spin den koniske rør med microgels ned på 2.000 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved aspiration.
    2. Vask microgels med 10 mL 2% v/v Polysorbat 20 i vand. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande.
    3. Spin den koniske rør ned på 2.000 x g i 2 min., så Fjern supernatanten ved aspiration.
    4. Vask microgels med 10 mL 100% ethanol til at inaktivere eventuelle resterende enzym. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande.
    5. Spin den koniske rør ned på 2.000 x g i 2 min., så Fjern supernatanten ved aspiration.
    6. Vask microgels med 10 mL 0.02% v/v Polysorbat 20 i vand. Med pipette overfoeres op og ned 10 x at blande.
    7. Spin den koniske rør ned på 2.000 x g i 2 min., så Fjern supernatanten ved aspiration.
    8. Gentag Polysorbat 20 vask 3 x. Passere løsningen gennem en 100 µm celle si før den sidste vask til at fjerne enhver store klumper.
  4. Resuspend microgels i 5 mL i 10 mM Tris-HCl buffer til at forhindre DNA forringelse. Microgels opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge før tagmentation (trin 7).

6. skabe stregkode dråber af Digital PCR

  1. Forberede en 500-pM bestand af BAR primer (tabel 2) i en 1 x TE buffer i en lav-binde tube. Før hver brug fortyndes primer for en arbejdsgruppe bestand af 1 pM og varme det til 70 ° C i 1 min på en varme blok.
  2. Forberede en 150 µL PCR-mastermix, bruger 75 µL af high-fidelity hot start master mix (Se Tabel af materialer) (2 x), 42 µL PCR-grade vand, 3 µL af DNA_BAR primer (10 µM materiel, 0,2 µM endelige), 3 µL af P7_BAR primer (10 µM lager 0,2 µM endelige), 6 µL af stregkode fortynding (1 pM materiel, 40 fM endelige), 6 µL af Polysorbat 20 (50% v/v stock, 2% endelige) og 15 µL af PIND 6 k (50% w/v stock, 5% endelige). Mix af pipettering op og ned 10 x.
  3. Forberede en HFE-backed sprøjten ved at trække 200 µL af HFE olie i en sprøjte og passe det med en nål. Knytte en sektion af PE rør til nålen og prime linjen i hånden. Sæt enden af PE-rør i target løsning og forsigtigt trække alle 150 µL PCR-mix i PE slangen og sprøjten. Læg sprøjten i en sprøjten pumpe.
  4. Indlæse en 1 mL sprøjte med fluorholdige olie (HFE) indeholder et 2% w/w produktion-polyethylen glycol (PFPE-PIND) overfladeaktivt stof, passer det med en nål, og læg det i en sprøjten pumpe.
  5. Generere 25 µm stregkode dråber bruger Co flow dropmaking enhed.
    Bemærk: Se figur 3A for en skematisk, der angiver placeringen af reagens indløb og udløb enhed.
    1. Plug celler indløb af en co flow dropmaker enhed med et lille stykke bly lodde.
    2. Tilslut injektionssprøjter fyldt med HFE og PCR mix til de mikrofluid enhed fjorde ved hjælp af stykker af PE rør, ved hjælp af Smeltet Agarosen indløb for stregkoden PCR mix. Før du indsætter rør i enheden, prime pumper for at fjerne luft fra linjen.
    3. Tilsluttes en stikkontakt et stykke slange og placere den frie ende i en 0,2 mL PCR rør. Brug de følgende (anbefalede) strømningshastigheder for dropmaking: 600 µL/h for HFE 2% w/w PFPE-PIND og 200 µL/h til PCR-blandingen. Indsamle dråberne i PCR rør med ca 50 µL af dråber i hver tube.
  6. Efter dropmaking, forsigtigt fjerne de lavere lag af HFE olie fra emulsioner ved hjælp af gel-loading pipette tips og erstatte det med FC-40 fluorholdige olie indeholdende et 5% w/w PFPE-PIND overfladeaktivt stof. Termisk cyklus med følgende protokol: 98 ° C i 3 min, 40 x af (98 ° C i 10 s, 62 ° C i 20 s, 72 ° C i 20 s), 72 ° C i 5 min, og derefter holde på 12 ° C.
    Bemærk: Thermal-cyklet dråber kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 dag.
  7. Kontrollere stregkode forstærkning og indkapsling sats.
    1. Forberede en 1 x nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer) i HFE med en 2% w/w PFPE-PIND overfladeaktivt; pletten er marginalt blandbar i HFE og vil binde sig til DNA i dråber.
    2. Tilføjes 10 µL af farvning olie 1 µL af termisk-cyklet stregkode emulsion. Inkuber dem i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Billede dråber af fluorescerende mikroskopi (normal god landbrugspraksis kanal, 497/520 nm excitation/emission bølgelængder) ved 200 X Forstørrelse og tælle stregkode indkapsling sats. Bemærk, at signalet vil være diskret: dråber indeholdende forstærket stregkoder vil fluorescerer smukt, hvorimod de tomme dråber vises mørke (figur 4B).

7. Tagmentation af genomisk DNA i dråber

Bemærk: Se figur 2B.

  1. Forberede 500 µL af tagmentation løsning ved hjælp af reagenser fra en next-generation sequencing bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer). Bruge 7 µL af tagmentation enzym, 250 µL af tagmentation buffer og 243 µL PCR-grade vand. Bland dem af vortexing og spin blandingen ned til at indsamle. Indlæse denne løsning i en HFE olie-backed 1 mL sprøjte og passe det med en nål.
  2. Forberede reinjektion af microgels.
    1. Spin ned microgel røret for 2 min på 2.000 x g og Opsug supernatanten. Overføre 200 µL af geler til toppen af en HFE-backed sprøjte med en gel-loading afpipetteres spids og forsegle mundstykke med et lille stykke tape.
    2. Ved hjælp af en 3D-trykt centrifuge adapter (Se supplerende filer 1 og 2), spin microgel sprøjte for 3 min på 3.000 x g.
    3. Fjerne den flydende supernatanten fra sprøjten ved hjælp af en gel-loading afpipetteres tip. Skubbe microgel lag i bunden af sprøjte dyse. Passe sprøjten med en nål.
  3. Indlæse en 3 mL sprøjte med fluorholdige olie (HFE) indeholder et 2% w/w produktion-polyethylen glycol (PFPE-PIND) overfladeaktivt stof, passer det med en nål, og læg det i en sprøjten pumpe.
  4. Re indkapsle microgels i dråber indeholdende tagmentation reagenser.
    Bemærk: Se figur 3B for en skematisk, der angiver placeringen af reagens indløb og udløb enhed.
    1. Tilslut sprøjter indeholdende HFE, tagmentation mix og microgels til de mikrofluid enhed fjorde ved hjælp af stykker af PE rør. Før du indsætter rør i enheden, prime pumper for at fjerne luft fra linjen.
    2. Tilsluttes en stikkontakt et stykke slange og placere den frie ende i en tom 1-mL sprøjte med stemplet tiltrukket af linjen 1 mL.
    3. Brug de følgende (anbefalede) strømningshastigheder for dropmaking: 2.000 µL/h for HFE 2% w/w PFPE-PIND, 200 µL/h for microgels og 500 µL/h til tagmentation mix.
  5. Kontroller microgel indkapsling sats under et lysmikroskop ved 400 X forstørrelse. Ca. 80-90% af dråberne bør indeholde en microgel, som vist i figur 4 c.
  6. Passer sprøjten indeholdende tagmentation emulsioner med en nål og inkuberes det oprejst i en varme blok eller ovn i 1 time ved 55 ° C til at fragmentere genomisk DNA.

8. single-celle stregkodesystem ved mikrofluid dobbelt fusion

Bemærk: Se figur 2 c.

  1. Forberede stregkode dråber for fusionen af erstatter den FC-40 olie fraktion med HFE 2% w/w PFPE-PIND. Omhyggeligt overføre disse dråber i en 1 mL sprøjte, passer det med en nål, og læg det i en sprøjten pumpe.
  2. Indlæse rugede og tagmented microgel droplet sprøjten i en sprøjten pumpe.
  3. Forberede 500 µL PCR mix. Tilføje reagenserne i rækkefølge at forhindre bundfald fra formning: 140 µL PCR-grade vand, 10 µL af P5_DNA primer (10 µM materiel, 0,2 µM endelige), 10 µL af P7_BAR primer (10 µM materiel, 0,2 µM endelige), 50 µL af PIND 6k (50% w/v lager 5% endelige), 50 µL af Polysorbat 20 (50% v/v stock, 5% endelige), 250 µL af Taq Master Mix (2 x) (Se Tabel af materialer), 10 µL af isotermisk polymerase (Se Tabel af materialer), og 10 µL af neutralisering buffer (Se Tabel af materialer). Bland dem af pipettering op og ned 10 x og spin blandingen ned til at indsamle det. Indlæse denne løsning i en HFE-backed 1-mL sprøjte, passer det med en nål, og læg det i en sprøjten pumpe.
  4. Load tre 3 mL sprøjter med fluorholdige olie (HFE) indeholdende en 2% w/w produktion-polyethylen glycol (PFPE-PIND) overfladeaktivt, passer hver med en nål og placere dem i sprøjten pumper.
  5. Indlæse tre 1 mL sprøjter med 2 M NaCl, passer hver med en nål og sæt dem til side.
  6. Flette stregkode dråber, tagmented genom dråber, og PCR mix bruger dobbelt fusion-enhed.
    Bemærk: Se figur 5 for en skematisk, der angiver placeringen af reagens og elektrode indløb og udløb enhed.
    1. Tilslut de 3 NaCl sprøjter til 2 elektrode fjorde og indre voldgrav inletusing stykker af PE rør. For elektroder, lægge pres på sprøjter manuelt indtil elektroderne er helt fyldt med saltopløsning. Efter påfyldning anvende elektroderne, manuel pres til voldgrav sprøjte indtil voldgraven er fyldt. Stik den frie ende af voldgraven med et lille stykke bly lodde.
    2. Tilslut de 3 HFE sprøjter monteret på pumper til 2 spacer olie fjorde og dropmaking olie inletusing stykker af PE rør. Før du indsætter rør i enheden, prime pumper for at fjerne luft fra linjen.
    3. Tilslut PCR mix sprøjte, microgel dråber sprøjte og stregkode falder sprøjten til deres respektive fjorde ved hjælp af PE rør. Skyde alle droplet reinjektion slanger med en antistatisk pistol før du tilslutter dem til sprøjte nåle; antistatisk behandling reducerer risikoen for slipværktøj sammensmeltning induceret af statisk elektricitet på PE rør.
    4. Tilsluttes en stikkontakt et stykke PE rør og placere den frie ende i en 0,2 mL PCR rør.
    5. Tilsluttes en kold katode lysstofrør inverteren ved hjælp af en alligator klip nål elektrode sprøjte. Angiv den inverter DC strømforsyning til 2 V.
    6. Køre dobbelt fusion enhed med de anbefalede strømningshastigheder: 300 µL/h til tagmented microgel dråber, 100 µL/h for stregkode dråber, 1500 µL/h for HFE 2% w/w PFPE-PIND (dropmaking olie), 600 µL/h for forstærkning mix, 200 µL/h for (den HFE 2% w/w) PFPE-PIND stregkode spacer olie), og 700 µL/h for HFE 2% w/w PFPE-PIND (microgel spacer olie). Indsamle dråberne i PCR rør med ca. 50 µL af emulsion i hver tube.
  7. Forud for varmepåvirkning, forsigtigt fjerne de lavere lag af HFE olie fra emulsioner ved hjælp af gel-loading pipette tips og erstatte dem med FC-40 fluorholdige olie indeholdende et 5% w/w PFPE-PIND overfladeaktivt stof. Termisk cyklus med følgende protokol: 65 ° C i 5 min, 95 ° C i 2 min., 30 x (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min., 72 ° C i 1 min), 72 ° C i 5 min, så hold på 12 ° C.
  8. Genskab barcoded DNA fra termisk-cyklet dråber.
    1. Pool dråber ind i et microcentrifuge rør og bryde emulsioner bruger 20 µL af PFO. Vortex dem for 10 s at blande.
    2. Spin tube på 10.000 x g til 1 min til fractionate blandingen ind i vandig (øverst) og olie (nederst) faser. Forsigtigt fjerne det øvre vandige lag fra røret ved hjælp af en pipette og overføre det til en ny microcentrifuge tube. Kassér den olie fase.
    3. Rense barcoded PCR produkt i en spin kolonne efter producentens protokol og elueres det i 20 µL 1 x TE buffer.
    4. Fortsæt til udføres sekvensering og analyse pr. trin 9 og 10.

9. bibliotek forberedelse og sekventering

  1. Forberede det enkelt celle bibliotek for Sekventeringen ved at følge producentens protokoller for fragment størrelse-udvælgelse og kvantificering.
  2. Sekvens biblioteket parret-end med standard kemi for Læs 1 og Læs 2. Brug den brugerdefinerede indeks 1 primer I7_READ (tabel 2) for en 15-bp index læse, svarende til én celle stregkode.

10. encellede dataanalyse

Bemærk: Brugerdefinerede Python scripts til kvalitetskontrol og foreløbige analyse af SiC-seq data kan downloades fra https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Kør scriptet "barcodeCleanup.py" til at udføre kvalitetskontrol på barcoded læsninger og eksportere encellede data til en SQLite database. For et kontrol-eksperiment, bruge dette script med det "-justere" flag sæt til at justere læser til kendte reference genomer.
  2. Analysere renheden af grupperne stregkode (for et kontrol-eksperiment) ved hjælp af scriptet "purity.py" og bekræfte høj renhed værdier i overensstemmelse med figur 6B.

Representative Results

SiC-seq eksperimentelle arbejdsproces indeholder 3 PDMS mikrofluid enheder fremstillet ved hjælp af en blød litografi procedure (figur 1). En co flow dropmaker (figur 3A) genererer 25 µm digital stregkode dråber for mærkning genomisk DNA med en unik én celle-id. Stregkode oligonukleotider består af en 15 bp degenererede sekvens flankeret af PCR håndtag til forstærkning (tabel 2, BAR primer). Stregkoder er fortyndet til en femtomolar koncentration at opnå enkelt-molekyle indkapsling, og alle dråberne modtage enten 0 eller 1 stregkode fragment(s). Dråber indeholdende en stregkode forstærkes, giver mange kopier af dobbelt-strenget stregkode amplikoner. En nukleinsyre pletten bruges til at kontrollere den succesfulde forstærkning og kvantificere indkapsling sats af stregkode fragmenter (figur 4B). Microgels er genereret af co flyder en bakteriel cellesuspension og en smeltet agarosegel på lige strømningshastigheder (figur 2A). Agarosen er parat på to gange den ønskede slutkoncentration, som co flow dropmaking proces effektivt udvander de vandige opløsninger med en faktor på 2. Da Agarosen køler, størkner det til en 25 µm diameter microgel besætter det sfæriske omfanget af denne droplet.

En række vask og lysis trin renser høj molekylvægt genomisk DNA i microgels (figur 2B). Efter at bryde emulsioner, foretages vandig skylninger i store mængder til fortyndes, trace organiske opløsningsmidler, som kan hæmme de downstream enzymatiske behandlinger. De vaskede microgels er observeret under et mikroskop for at kontrollere indkapsling cellehastighed (figur 4A). En cocktail af enzymer med bred lytisk aktivitet er tilføjet til microgel suspension til at fordøje cellevægge af bakterier og eukaryote mikrober19. En anden behandling med Proteinase K og vaskemiddel nedbryder proteinerne og solubilizes celle debris.

Tagmentation af oprenset DNA er udført i dråber til at undgå potentiel kontaminering som følge af diffusion af små tagmented DNA fragmenter mellem microgels18. En droplet indkapsling enhed (figur 3B) compartmentalizes hver microgel med en buffer og tagmentation enzym, som samtidig fragmenter dobbelt-strenget DNA mens også "kodning" det med en præinstalleret oligonukleotid20. Microgels er indlæst i dråber som tæt-pakket partikler, at opnå indkapsling satser nærmer sig 1 microgel for hver dråbe med få dubletter21 (figur 4 c).

I det sidste trin i arbejdsprocessen mikrofluid (figur 2 c) udfører en enhed en dobbelt fusion kombinerer 1 stregkode dråbe, 1 microgel-holdige dråbe og forstærkning mix i en kontrolleret totrinsproces. Først er et slipværktøj, som indeholder PCR reagens parret og fusioneret med en stregkode drop i regionen vist i gul (figur 5). Saltvand elektroder i mikrofluid kanalen producere en høj elektrisk felt gradient, som udløser en droplet fusion. I en lignende måde, er den første flettede droplet parret med en microgel dråbe og flettet en anden gang i regionen vist med rødt. Dråberne er indsamlet og termisk cyklede ud-chip i en enkelt-overlapning forlængelse (SOE) PCR. Overlappende supplerende enderne af stregkoden og tagmented genomisk DNA tillade fusion og eksponentiel forstærkning af kun korrekt barcoded konstruktioner.

Sequencing data er først filtreret efter et Læs kvalitet og derefter analyseres af gruppering læser efter deres 15-bp encellede stregkode sekvens. En stregkode gruppen kan anses for gyldigt, skal det indeholde et minimum antal læsninger; denne tærskel begrænser analysen til celler med en nyttig mængde sequencing data og fjerner PCR-muteret stregkoden "forældreløse" fra datasættet. I dette eksempel køre, minimum, der er indstillet til 7,5 kbps pr. gruppe (50 læsninger af 150 bp hver). Et histogram stregkode tæller versus Gruppestørrelse viser, at en betydelig del af grupperne gyldig stregkode er lige over tærskel størrelse (figur 6A).

I et kontrol-eksperiment hvor mikrobielle samfund sammensætning er kendt, bruges renhed og relativ overflod målinger til at vurdere kvaliteten af en SiC-seq køre. Her, er et syntetisk 10-celle fællesskab bestående af 3 gram-negative bakterier, 5 gram-positive bakterier og 2 gær analyseret. Renheden af en given stregkode gruppe er defineret som antallet af læser tilknytning til de mest almindelige genom i gruppen divideret med det samlede antal læsninger i gruppen. Det store flertal af grupperne stregkode er purities større end 0,95 (fig. 6B). Relativ overflod af celletyper beregnes ved at tælle de rå læsninger og ved at tælle stregkode grupper, hvor grupperne tildeles en celletype svarer til konsensus blandt dens medlemsstater læser (figur 6 c). Overfloden af læser og stregkode grupper spore i nogenlunde lige proportioner, der angiver, at cellepopulationer er at være udtaget prøver således, at visse arter ikke findes i uforholdsmæssig stor eller lille stregkode grupper. Plotte den samlede dækning af alle stregkode grupper fra en enkelt art angiver en høj dækning på tværs af det hele genom, med få eller ingen frafald regioner (figur 7). Ensartethed af dækning kan verificeres med en hyppighed distribution af normaliserede dækning værdier, med de fleste værdier centreret omkring gennemsnittet (figur 7, indsat).

Figure 1
Figur 1 : Fremstilling af mikrofluid enheder af fotolitografi. (A) Master forme med en enkelt funktion højde er fremstillet af spin coating et lag af SU-8 photoresist på en silicium wafer. Photoresist er derefter mønstrede med en photolithographic maske og UV-lys, crosslinking den udsatte SU-8. Endelig, uncrosslinked SU-8 er opløst i en udvikler bad. Den resulterende skimmel bruges til at kaste PDMS, som er bundet til et glas dias til at producere den komplette mikrofluid enhed. ()B) For en dobbeltlags enhed, fabrikation ligeledes begynder med spin coating og eksponering trin. Disse trin gentages derefter oprette et tolags enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over arbejdsprocessen SiC-seq. (A) A mikrobielle suspension er co flød med smeltet Agarosen i en dropmaker enhed til at indkapsle enkelt celler i microgels. (B) microgels udsættes for en serie af vasker til at rense den bakterielle genomisk DNA. Lytisk enzymer fordøje cellevægge af gram-positive bakterier og gær, og vaskemiddel solubilizes den celleaffald. Microgels er igen indkapslet i dråber for tagmentation at reducere krydskontaminering. (C) mikrofluid fusion kombinerer en digital PCR stregkode, en tagmented microgel genom og en forstærkning mix med en hastighed > 1 kHz. Off-chip SOE-PCR splices en unik encellede stregkode på tagmented genom og forstærker selektivt fuldt barcoded konstruktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Mikrofluid enheder til dropmaking og microgel re indkapsling. (A) dette panel viser en co flow dropmaker (25 µm af funktionen højde). Celler og smeltet Agarosen er indført i enheden ved lige strømningshastigheder at producere 25 µm dråber på en 25 µm x 25 µm junction. For digitale stregkode dropmaking, celle inlet er tilsluttet, og en PCR mix er indført i Agarosen indløb. (B) dette panel viser en microgel re indkapsling enhed (25 µm af funktionen højde). Microgels flyde ind i en tragtformet indgang til at opretholde deres tæt-pakket bestilling og modtage et volumen af tagmentation mix før re indkapsling i en 25 µm x 30 µm krydset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Micrographs af dråber og microgels. (A) dette panel viser vasket 25 µm microgels før enzymatisk lysering. Bakterierne farves fluorescently til kvantificering af indkapsling satsen. Poisson lastning statistik diktere, at cellerne skal være indkapslet med en sats på 1: 10 dråber eller mindre at minimere hyppigheden af multiple-indkapsling begivenheder. (B) dette panel viser et Fluorescens mikroskopi billede af 25 µm digital stregkode dråber behandlet med en nukleinsyre pletten. Dråber indeholdende forstærket stregkode fragmenter producere en stærk fluorescens signal. (C) dette panel viser microgels re indkapslet i 50 µm dråber. Tæt-pakning af microgels giver mulighed for indkapsling satser nærmer sig 1 gel pr. drop med få dubletter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Mikrofluid dobbelt fusion enhed for encellede genom stregkodesystem. En to-trins fusion par stregkode dråber med tagmented genomer på en høj overførselshastighed. En dråbe af PCR mix er først genereres og fusioneret med en stregkode droplet i regionen vist i gul ved hjælp af saltvand elektroder. Dernæst er et slipværktøj, som indeholder en microgel introduceret og flettet en anden gang i regionen vist med rødt. Olie fjorde giver mulighed for præcis styring af afstanden mellem de reinjected dråber. Stregkode reinjektion kammer og dens spacer olie er placeret på den kortere 25 µm lag, skyggefulde i blå. Alle andre enhedsfunktioner tilhører den tykkere lag med 45 µm af samlede højde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Stregkode gruppe målinger for en 10-celle syntetiske mikrobielle samfund. (A) dette panel viser fordelingen af stregkoden gruppestørrelser. Antallet af grupper af en given størrelse falder eksponentielt som gruppe filstørrelsen øges. En minimumstærskel på 7,5 kbps pr. gruppe begrænser analysen til grupper med en tilstrækkelig mængde af information og fjerner PCR-muteret sekvens "forældreløse." (B) dette panel viser fordelingen af stregkode gruppe purities. Størstedelen (> 90%) af grupper er af meget høj renhed (> 95%). (C) dette panel viser den relative forekomst af 10 arter beregnet på koncernniveau Læs og stregkode. 2 tælle metoder giver lignende resultater, angiver, at barcode gruppestørrelser er konsistent på tværs af arter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Samlet genomisk dækning af Bacillus subtilis stregkode grupper. Lyder fra alle stregkode grupper kortlægning at bakterien B. subtilis (N = 9,398) er samlet og analyseret i aggregat. Et cirkulært dækning kort illustrerer dækning ensartethed af SiC-seq læser, med ingen observerbare frafald regioner. En stiplet linje omkring omkredsen angiver den gennemsnitlige dækning (5,55 x). Inset histogrammet af relative dækning frekvenserne viser, at hovedparten af baserne er dækket på en dybde nær genome-wide gennemsnit, repræsenteret ved den stiplede linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Enhed 1. lag højde (µm) 1. lag Spin hastighed (rpm) 2. lag højde (µm) 2. lag Spin hastighed (rpm)
Co flow dropmaker 25 4000 NIELSEN NIELSEN
Gel re encapsulator 25 4000 NIELSEN NIELSEN
Dobbelt fusion 25 4000 20 5000

Tabel 1: mikrofluid enhed fabrikation parametre. Denne tabel viser en liste over de mikrofluid enheder, der bruges i SiC-seq arbejdsprocessen med deres kræves hastigheder for photoresist spin coating (baseret på producentens specifikationer for SU-8 3025).

Etiket Rækkefølge (5' > 3')
BAR GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabel 2: Primer sekvenser.

Supplerende fil 1: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

SiC-seq mikrofluid arbejdsproces producerer encellede genome sequencing data fra tusindvis af bakterieceller. Digital stregkoder splejset på genomer af microgel-indkapslede celler giver mulighed for i siliciummangan -deconvolution NGS data i grupper af barcoded læsninger stammer fra den samme celle. En kontrol eksperiment med en mikrobielle samfund med kendt sammensætning er nødvendige for at vurdere renhedsgraden af grupperne stregkode. En stor del af lav-renhed grupper angiver at celle indkapsling sats er for høj eller at der er betydelige droplet krydskontaminering opstår under mikrofluid behandlingstrin. Ifølge Poisson statistikker, bør stregkoder og celler være indkapslet i target forholdet 1 partikel for hver 10 dråber til at begrænse antallet af flere indkapsling begivenheder til mindre end 5% af alle ikke-tomme dråber. En indkapsling rente højere end dette øger satserne for dubletter eksponentielt, så kontrol af indkapsling forholdet under dropmaking processen er af afgørende betydning. Brugere bør være særligt forsigtige for indkapsling af flere celler i et enkelt microgel fordi læsninger fra forskellige celler deler den samme stregkode sekvens ikke kan være bioinformatically adskilt. I tilfældet at 1 celle modtager 2 forskellige stregkoder, stregkode gruppe renhed er upåvirket, selvom overflod metrics er skæv ved optælling af stregkode sekvens.

Droplet krydskontaminering kan også opstå som følge af suboptimal fusion betingelser. Under en vellykket operation, kan mikrofluid fusion enhed (figur 5) controllably par 1 stregkode droplet med 1 microgel og en mængde af PCR reagens. Ikke-ideelle strømningshastigheder vil resultere i en droplet parring på forkert nøgletal: 1 stregkode kunne kombineres med 2 microgels, f.eks. Alle strømningshastigheder opført i protokollen er beregnet til at blive skøn og skal måske justeres afhængigt af små variationer i enheden geometri og slipværktøj størrelser. Brugere med adgang til kameraer med high-speed optagelse evner (> 10.000 rammer/s) skal kontrollere den korrekte droplet fusion i begyndelsen og i løbet af handlingen mikrofluid. Brugere uden adgang til et højhastighedskamera kan indsamle en lille mængde af den flettede output og manuelt måle droplet størrelser under et mikroskop. Dråbestørrelse bør være ensartet: et overskud af uflettede stregkoder eller microgel dråber angiver at reinjektion priser bør reduceres tilsvarende.

Flere generelle forholdsregler bør tages ved håndtering af microgels og microdroplets til at bevare deres integritet. Microgels, skal selvom mekanisk robust, være tilstrækkeligt køles før bruddet og vaske trin for at sikre komplet gellation. Ikke-sfæriske microgels er en indikation af, at Agarosen ikke var får tilstrækkelig tid til at størkne. Når du vasker microgels, spin suspensioner ned på de krævede hastigheder til at undgå tab af produktet. Agarosen hydrogel har en refraktivt indeks tæt matchende vand og kan være svært at se i en tube22, så brugere bør omhyggeligt identificere gel-flydende grænse før aspiration. Vand i olie dråber er modtagelige for sammensmeltning af ophobning af statisk styrker23 på laboratoriet handsker og slanger. Vi anbefaler derfor, lastning droplet reinjektion sprøjter med bare hænder og behandling af alle reinjektion linjer med en anti-statisk pistol før pumpen priming. Store sammenvoksede dråber kan fjernes ved langsomt roterende emulsioner i en sprøjte og manuelt sugning de større dråber, der akkumulerer øverst på grund af deres større livlig kraft.

SiC-seq er den første teknologi til at vise encellede genome sequencing af > 50.000 bakterieceller. Denne platform giver betydelige fordele i overførselshastighed over eksisterende metoder og giver mulighed for en dybere prøveudtagning af heterogene mikrobielle samfund. Til dato har mikrofluid teknologier til én celle genome sequencing ansat microchambers9 og microwells24 for celle isolation og forstærkning, men med gennemløb i rækken af kun snesevis til hundredvis af celler. Flow sortering af enkelt celler til wellplates5,6 kræver ingen specialiserede mikrofluid instrumentation men besidder en tilsvarende lav dataoverførselshastighed. Som jord og vand prøver fra miljøet har almindeligt alpha mangfoldighedens af > 1.000 på arternes niveau25,26, SiC-seq er meget fordelagtigt i kraft af sin evne til at prøve et langt større antal organismer. SiC-seq arbejdsprocessen er fleksibel til celle input fra laboratoriet kultur, det naturlige miljø eller en levende vært. En celle prøve må kun være i en vandig suspension og fri for store partikler (> 10 µm) egnet til mikrofluid indkapsling. For eksempel, er metoden anvendt tidligere til en stikprøve af havvand ved hjælp af en række vask og filtrering trin for at pre-behandle celler før indkapsling17.

SiC-seq protokol genererer en forholdsvis sparsom mængde sequencing data fra hver enkelt celle og kan ikke være egnet til alle applikationer. Nogle Bioinformatik algoritmer som de novo genom forsamling eller enkelt nucleotid variant (SNV) ringer kræver højere dækning dybder til at arbejde effektivt. I stedet, stregkode grupper kan være grupperet i siliciummangan af taksonomiske binning metoder27 så algoritmer kan anvendes på større sæt af læser. Relativt lave samlede stregkodesystem effektivitet SiC-seq arbejdsprocessen kan også præsentere udfordringer i tilfælde, hvor tilgængeligheden af input prøven er lav. SiC-seq bygger på en Poisson-distribueret stregkode indkapsling skridt, derfor ca 10% af cellerne modtager en molekylær stregkode og forstærkes under den endelige bibliotek præparationstrin. Mens dette kan sammenlignes med andre microdroplet-baserede stregkodesystem ordninger10, brugere, der arbejder med dyrebare celle prøver kan have svært ved at opnå tilstrækkelig bibliotek udbytte til sekvensering og kan være nødvendigt at øge antallet af PCR cyklusser i finalen forstærkning trin. En anden mulig løsning til brugere med mikrofluid ekspertise er at sortere positive stregkode dråber efter trinnet digital PCR, hvorved den samlede stregkodesystem effektivitet > 85%28.

En potentiel fremtidig retning for SiC-seq teknologi tilpasser arbejdsproces til brug med pattedyrceller, baner vejen for nye kliniske encellede undersøgelser. Som et eksempel, en analyse af copy number variation blandt enkelt kræft celler kan fremme vores forståelse af heterogenitet i kræft patologi2rolle. Alternativt, integrere SiC-seq med eksisterende metoder til sonde og berige DNA sekvenser af interesse29 ville aktiverer den målrettede encellede sekvensering af delpopulationer eller sjældne stammer af celler. Med miljøprøver, kunne gener fra inden for en kendt stofskiftevej være målrettet og analyseret kontekstuelt sammen med nabolandet gener for at identificere roman genomisk øer. Fra inden for en menneskelig vært miljø, lav-titer patogene bakterier prøver kunne isoleres og sekventeret på én celle plan at undersøge mere nøje deres genotypiske oprindelsen af virulens.

Disclosures

Patenter vedrørende denne arbejdsproces kan være er licenseret til Mission Bio, af hvilke Adam R. Abate aktionær.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem en karriere Award (grant antallet DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (grant nummer HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); og Defense Advanced projekter agentur bor støberier forskningsprogrammet (kontraktnumre HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 mikrofluidik microdroplets encellede genomforskning metagenomics næste generation sequencing Molekylær stregkodesystem
En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan,… More

Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter