Forurening under den genomisk sekventering af mikroskopiske organismer er fortsat et stort problem. Her viser vi en metode til sequence genomet af et tardigrade fra et enkelt eksemplar med så lidt som 50 pg genomisk DNA uden hele genom forstærkning til at minimere risikoen for kontaminering.
De er mikroskopiske dyr, som angiver en ametabolic stat kaldet anhydrobiosis når man står overfor udtørring og kan vende tilbage til deres oprindelige tilstand, når vand er leveret. Genomisk Sekventeringen af mikroskopiske dyr som Biogeografi risici bakteriel forurening, der nogle gange fører til fejlagtige fortolkninger, for eksempel med hensyn til omfanget af horisontal genoverførsel i disse dyr. Her, leverer vi en ultralow input metode for at sekvens genomet af tardigrade, Hypsibius dujardini, fra et enkelt eksemplar. Ved at ansætte grundig vask og forurenende udstødelse sammen med en effektiv udvinding af 50 ~ 200 pg genomisk DNA fra et enkelt individ, vi bygget et bibliotek sekventeret med en DNA-sekventering instrument. Disse biblioteker var meget reproducerbare og upartiske, og informatik analyse af den omkostningsstyring læser med andre H. dujardini genomer viste en minimal mængde af forurening. Denne metode kan anvendes til unculturable biogeografi, der ikke kunne blive sekventeret tidligere metoder.
De er mikroskopiske dyr, der kan angive en ametabolic stat kaldet anhydrobiosis, når man står overfor udtørring. De inddrive ved absorption af vand1,2. I ametabolic staten er de i stand til at tolerere forskellige ekstreme miljøer, der omfatter ekstreme temperaturer3 og pres4,5, en høj dosis af ultraviolet lys6, røntgen og gammastråler 7 , 8, og kosmisk plads9. Genomisk data er et uundværligt grundlag for studiet af molekylære mekanismer af anhydrobiosis.
Tidligere forsøg på at sekvens Biogeografi genom har vist tegn på bakteriel forurening10,11,12,13,14. Genomisk sekventering af sådanne små organismer kræver et stort antal dyr og er liggende hen til bakteriel forurening; Derfor har vi tidligere fastsat en sekventering protokollen ved hjælp af en ultralow inddata metode med udgangspunkt i et enkelt eksemplar af tardigrade, for at minimere risikoen for forureninger15. Ved hjælp af disse data, har vi yderligere gennemført en høj kvalitet resequencing og gensamling af genomet af H. dujardini16,17. Her vi beskriver i detaljer denne metode for genomisk sekventering fra en enkelt tardigrade individuelle ()figur 1). Valideringen af denne sekventering metode er ud over fokus i dette papir og allerede er blevet grundigt drøftet i vores tidligere rapport16.
Denne metode består af to dele: isolering af en enkelt tardigrade med den laveste forurening mulige og høj kvalitet udvinding af piktogram niveauer af DNA. Tardigrade er udsultet og skylles grundigt med vand, som antibiotika og observeret under et mikroskop med 500 X forstørrelse at sikre fjernelse af enhver bakteriel forurening. Tidligere skøn og målinger viser, at et enkelt individ af tardigrade indeholder cirka 50-200 pg genomisk DNA16, som er udvundet af sprængning chitin exoskeleton af fryse-tø cykler eller ved manuel homogenisering. Denne genomisk DNA er indsendt til bibliotek opbygning og sekventeret på en DNA-sekventering instrument. En yderligere Informatik analyse viser høj kvalitet sekventering, samt lave niveauer for forurening i forhold til tidligere tardigrade sekventering projekter.
Bakteriel forurening udgør en trussel mod den genomisk sekventering af mikroskopiske organismer. Mens tidligere undersøgelser på tardigrade genome sequencing har filtreret ud forurening ved hjælp af omfattende Informatik metoder12,20, sekventeret vi genom fra en enkelt person til at minimere risikoen for kontaminering. Da en individuel tardigrade indeholder cirka 50-200 pg genomisk DNA16 og er indkapslet i et tykt lag af chitin exoskel…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Nozomi Abe, Yuki Takai og Nahoko Ishii for deres tekniske support i genomisk sekvensering. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) Research Fellow, KAKENHI licensbetaling for unge forskere (No.22681029) og KAKENHI licensbetaling for videnskabelig forskning (B), No. 17 H 03620 fra JSP’ER, ved en Tilskud til grundlæggende videnskab forskningsprojekter fra The Sumitomo Foundation (No.140340), og dels af forskningsmidler fra Yamagata Prefectural regering og Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris bruges til at fodre Biogeografi var som Chlorella Industry Co Ltd
SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
VHX-5000 System | Keyence | ||
0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
Ethanol | Wako | 054-027335 | |
EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |