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एक पूर्व Vivo Langendorff प्रणाली में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और Arrhythmogenesis पर Intracardiac न्यूरॉन्स का प्रभाव

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57617
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2
1Department of Cardiology-Electrophysiology, cNEP (cardiac Neuro- and Electrophysiology research group), University Heart Center, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), 3Institute of Experimental Cardiovascular Research, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

यहां, हम intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के मॉडुलन और बुनियादी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, arrhythmogenesis, और शिविर गतिशीलता पर एक पूर्व vivo Langendorff सेटअप का उपयोग कर अपने प्रभाव के आकलन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

देर से 19वीं सदी में अपने आविष्कार के बाद से, Langendorff पूर्व vivo हार्ट छिड़काव प्रणाली शारीरिक, जैव रासायनिक, रूपात्मक, और औषधीय मापदंडों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक उपकरण के लिए जारी है मध्ये denervated दिल. यहां, हम intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के मॉडुलन और बुनियादी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, arrhythmogenesis, और चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर) गतिशीलता पर अपने प्रभाव के आकलन के लिए एक सेटअप का वर्णन । intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र अलिंद वसा पैड के यांत्रिक विच्छेदन द्वारा संग्राहक है-जिसमें murine गैंग्लिया मुख्य रूप से स्थित हैं-या वैश्विक के उपयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लक्षित औषधीय हस्तक्षेप । एक octapolar electrophysiological कैथेटर सही atrium और सही निलय में पेश किया गया है, और उच्च संकल्प मानचित्रण के लिए epicardial-रखा मल्टी इलेक्ट्रोड सरणियों (मेे) कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmogenesis निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है । Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग विभिन्न कार्डियक क्षेत्रों में शिविर के स्तर के वास्तविक समय की निगरानी के लिए किया जाता है । Neuromorphology एंटीबॉडी के माध्यम से अध्ययन किया है-पूरे दिल के धुंधला आधारित ंयूरॉंस मार्कर का उपयोग करने की पहचान और प्रदर्शन अध्ययन में intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के विशिष्ट लक्ष्यों के मॉडुलन गाइड । पूर्व vivo Langendorff सेटअप कम समय में reproducible प्रयोगों की एक उच्च संख्या के लिए अनुमति देता है । फिर भी, सेटअप के आंशिक रूप से खुला प्रकृति (जैसे, मेे माप के दौरान) लगातार तापमान नियंत्रण मुश्किल बनाता है और एक ंयूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए । यह वर्णित विधि का विश्लेषण करने के लिए और विकेन्द्रीकृत दिलों में intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र को मिलाना संभव बनाता है.

Introduction

Langendorff पूर्व vivo हार्ट छिड़काव प्रणाली शारीरिक, जैव रासायनिक, रूपात्मक, और केंद्रीय denervated दिल1में औषधीय अध्ययन के एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शन के लिए एक प्रासंगिक उपकरण होना जारी है,2 ,3,4,5 देर से 19वीं सदी6में अपने आविष्कारकेबाद से । तारीख करने के लिए, इस प्रणाली को अभी भी व्यापक रूप से विभिंन विषयों के लिए प्रयोग किया जाता है (उदा, ischemia reperfusion) या हृदय औषधीय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए7,8, और हृदय अनुसंधान में एक बुनियादी उपकरण है । कई फायदों से इस विधि के परिणाम की दीर्घायु (उदा, माप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र या अन्य अंगों, प्रणालीगत संचलन, या घूम हार्मोन के प्रभाव के बिना प्रदर्शन कर रहे हैं) । यदि आवश्यक हो, फार्मास्यूटिकल्स छिड़काव बफर करने के लिए एक नियंत्रित तरीके से जोड़ा जा सकता है या सीधे विशिष्ट संरचनाओं के लिए लागू किया । प्रयोग reproducible हैं, और एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या में प्रयोगों के समय की एक छोटी अवधि में किया जा सकता है । (भाग में) सेटअप के खुले प्रकृति के तापमान विनियमन मुश्किल कर सकते है और ध्यान में रखा जाना चाहिए । हालांकि Langendorff प्रणाली भी बड़ी प्रजातियों में प्रयोग किया जाता है9, छोटे जानवरों को मुख्य रूप से प्रयोगात्मक सेटअप कम जटिल है के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, और एक बड़ा जैविक परिवर्तनशीलता (उदा., ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के प्रायोगिक सेटअप में, बुनियादी electrophysiological मानकों पर intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के प्रभाव, वेंट्रिकुलर arrhythmogenesis, epicardial आचरण, और चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर) गतिशीलता है मूल्यांकन. intracardiac गैंग्लिया की एक बड़ी संख्या है, जो मुख्य रूप से अलिंद वसा पैड में स्थित है और अब अच्छी तरह से केंद्रीय तंत्रिका नियंत्रण से स्वतंत्र हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी नियंत्रण के लिए जाना जाता है, या तो बरकरार छोड़ दिया या मैंयुअल रूप से सावधान यांत्रिक के साथ हटा रहे है विच्छेदन. स्वायत्त तंत्रिका तंत्र का एक औषधीय मॉडुलन या तो दुनिया भर में छिड़काव बफर या स्थानीय स्तर पर अलिंद गैंग्लिया के लक्षित मॉडुलन द्वारा फार्मास्यूटिकल्स जोड़कर किया जाता है । प्रयोगों के बाद, दिल एक immunohistological आकलन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है के रूप में सभी रक्त कोशिकाओं को निरंतर छिड़काव के कारण हटा दिया गया है, जो धुंधला की गुणवत्ता में वृद्धि कर सकते हैं ।

वर्णित तकनीकों का समग्र लक्ष्य है माउस हृदय में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmogenesis पर स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के प्रभाव के संबंध में विस्तृत अध्ययन के लिए उपन्यास परिप्रेक्ष्य प्रस्तुत करना. इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक कारण यह है कि यह अध्ययन और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रभाव के बिना स्वायत्त तंत्रिका तंत्र में परिवर्तन करने के लिए संभव है । एक प्रमुख लाभ औषधीय प्रयोगों, जिसमें संभावित समर्थक या पुराने और नए एजेंटों के antiarrhythmic गुण का परीक्षण किया जा सकता है की आसान रोजगार है । इसके अलावा, विभिंन हृदय रोगों के ट्रांसजेनिक और पीटा माउस मॉडलों के लिए अंतर्निहित ताल विकारों, दिल की विफलता, या चयापचय रोगों तंत्र की जांच करने के लिए उपलब्ध हैं । इस दृष्टिकोण कैसे अलिंद स्तर पर स्वायत्त तंत्रिका तंत्र वेंट्रिकुलर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ताल विकारों के प्रेरण प्रभाव कर सकते हैं की हमारी समझ में वृद्धि हुई है ।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं हैंबर्ग के राज्य के स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया, हैंबर्ग पशु देखभाल और उपयोग समितियों के विश्वविद्यालय ।

1. Langendorff तंत्र की तैयारी

नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Langendorff छिड़काव सिस्टम का उपयोग किया जाता है ।

  1. एक संशोधित Krebs-Henseleit सॉल्यूशन तैयार करें (११९ mm सोडियम क्लोराइड, 25 एमएम का सोडियम बिकारबोनिट, ४.६ एमएम का पोटेशियम क्लोराइड, १.२ एमएम का पोटेशियम फास्फेट का monobasic, १.१ एमएम का मैग्नीशियम सल्फेट, २.५ एमएम का कैल्शियम क्लोराइड, ८.३ एमएम का ग्लूकोज, और 2 एमएम का सोडियम पाइरूवेट) । कैल्शियम वर्षण को रोकने के लिए छिड़काव समाधान के लिए ९५% ऑक्सीजन/5% कार्बन डाइऑक्साइड का मिश्रण जोड़ें । ०.२२ µm की एक ताकना आकार के साथ बफर फ़िल्टर ।
  2. आवश्यक के रूप में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmogenesis पर इसके प्रभाव की जाँच करने के लिए बफ़र के लिए एक औषधीय एजेंट जोड़ें ।
  3. पानी स्नान शुरू करें और यह ९५% ऑक्सीजन/5% कार्बन डाइऑक्साइड का एक मिश्रण सहित छिड़काव समाधान जगह है । जल स्नान के तापमान को समायोजित करें, ताकि प्रवेशनी से पहले सीधे छिड़काव समाधान तापमान ~ ३७ ˚ C है ।
  4. रोलर पंप शुरू और छिड़काव समाधान के साथ उपकरण को भरने के रूप में जल्द ही सही तापमान तक पहुंच गया है ।
  5. दिल संलग्न करने से पहले पंप दर समायोजित करें, ताकि कोई हवा बुलबुले प्रवेशनी में छोड़ दिया जब यह तंत्र के लिए बढ़ते हैं ।

2. हार्ड और सॉफ्टवेयर की तैयारी

  1. छिड़काव दबाव, प्रवाह दर, और दिल की दर की एक सतत रिकॉर्डिंग के लिए Langendorff तंत्र के लिए एक डिजिटल डेटा अधिग्रहण प्रणाली और इसके इसी सॉफ्टवेयर से कनेक्ट करें ।
    1. ८० mmHg करने के लिए सामान्य सेटिंग्स में लक्षित छिड़काव दबाव सेट करें ।
    2. रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें ।
  2. प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कैथेटर (सामग्री की मेज) का उपयोग करें, ०.५ x ०.५ मिमी की एक इलेक्ट्रोड सतह, और डेटा रिकॉर्डिंग और एक निर्दिष्ट डिजिटल उत्तेजना जनरेटर के साथ उत्तेजना के लिए ०.५ मिमी की एक इलेक्ट्रोड रिक्ति.
    1. कैथेटर क्षेत्र जहां दिल उपकरण के लिए लगाव के बाद तैनात किया जाएगा करने के लिए बंद रखें ।
    2. कैथेटर से 2 इलेक्ट्रोड का चयन करके उत्तेजना तैयार है और १०० ms के एक चक्र की लंबाई का उपयोग करें ।

3. दिल की तैयारी

  1. ठंड जोड़ें (~ 2-4 ˚ ग) छिड़काव बफर (10-20 मिलीलीटर और ४०-५० मिलीलीटर, ताकि पूरे पकवान कवर किया जाता है) 2 पेट्री व्यंजन (6 सेमी और 10 सेमी का व्यास) और प्रवेशनी के साथ पकवान और बर्फ पर उंहें सीधे बगल में और माइक्रोस्कोप के तहत जगह है । प्रवेशनी के चारों ओर एक डबल गांठ तैयार करते हैं ।
  2. तेजी से छाती मेयो कैंची और संकीर्ण पैटर्न संदंश का उपयोग कर खोल कर ग्रीवा विस्थापन के बाद दिल आबकारी । फिर पकड़ महाधमनी और वेना डायाफ्राम के ऊपर कावा लंदन संदंश का उपयोग कर और सभी जहाजों और संयोजी ऊतक तिर्यकदृष्टि कैंची के साथ रीढ़ की हड्डी के करीब काटने के द्वारा दिल फेफड़ों के ब्लॉक उत्पाद ।
  3. बर्फ शीत बफर से भरा पहली डिश (6 सेमी व्यास) में दिल फेफड़ों ब्लॉक स्थानांतरण और ध्यान से तिर्यकदृष्टि कैंची और लंदन संदंश का उपयोग करके दिल को नुकसान पहुँचाए बिना फेफड़ों को दूर. फिर दिल को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और स्प्रिंग कैंची और Dumont SS संदंश का उपयोग करके थाइमस, घेघा और श्वासनली को सावधानीपूर्वक हटा दें ।
  4. कैथेटर की प्रविष्टि के लिए सही atrium के ऊपरी हिस्से में १.५-2 मिमी के एक छेद में कटौती करने के लिए स्प्रिंग कैंची का प्रयोग करें । फुफ्फुसीय धमनी में एक छिद्र काट लें । इसके बाद महाधमनी को सीधे supraaortic शाखाओं के नीचे काटें और टिशू को महाधमनी से निकाल लें, ताकि गांठ को आसानी से अटैच किया जा सके ।
  5. अलिंद फैट पैड रखें, ganglionated plexi स्थित प्रमुख atrially सहित, बाईं atrium के आसपास या पूरी तरह से उन्हें सावधान विच्छेदन से हटा दें ।
  6. प्रवेशनी के साथ पकवान के लिए दिल हस्तांतरण और यह माइक्रोस्कोप के नीचे जगह है । Dumont एसएस संदंश के साथ प्रवेशनी के ऊपर महाधमनी खींचो और महाधमनी के आसपास कसकर तैयार गाँठ टाई । सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी महाधमनी में बहुत गहरा नहीं रखा गया है ताकि महाधमनी वाल्व और कोरोनरी वाहिकाओं मुक्त छोड़ दिया जाता है ।
  7. Langendorff उपकरण के लिए प्रवेशनी जल्दी से संलग्न करें । सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले प्रवेशनी में छोड़ दिया है ।
  8. स्विच छिड़काव दबाव ८० mmHg के लिए, एक निरंतर दबाव छिड़काव की अनुमति ।
  9. को छूने या दिल को नुकसान पहुँचाए बिना सही atrium और सही निलय में कैथेटर ध्यान से डालें और टेप के साथ प्रवेशनी करने के लिए कैथेटर देते हैं ।
  10. एक प्रारंभिक 20 मिनट equilibration अवधि के लिए १०० ms के तैयार चक्र लंबाई के साथ उत्तेजना शुरू करो ।
  11. चैंबर बंद करने के लिए एक स्थिर तापमान की अनुमति ।

4. Electrophysiological पैरामीटर और Arrhythmogenesis

  1. दो बार अलिंद या वेंट्रिकुलर पेसिंग थ्रेशोल्ड में कैथेटर के बाहर या समीपस्थ इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक क्रमादेशित उत्तेजना लागू करें निम्न चरणों में वर्णित के रूप में electrophysiological पैरामीटर का मूल्यांकन करने के लिए.
    1. निर्धारित दर पेसिंग के 10 एस के बाद अधिकतम वापसी चक्र लंबाई के रूप में साइनस नोड वसूली समय का निर्धारण १२० ms, १०० एमएस, और ८० ms के एक S1S1 चक्र की लंबाई पर ।
    2. सबसे लंबे समय तक S1S1 चक्र लंबाई (8 उत्तेजनाओं के रूप में Wenckebach बिंदु का निर्धारण; S1S1:१०० ms; 2 ms stepwise कमी) 11 ए वी नोडल कंडक्टर के नुकसान के साथ । सबसे लंबे S1S2 (12 उत्तेजनाओं के रूप में अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नोडल दुर्दम्य अवधियों का निर्धारण; S1S1:१२० एमएस, ११० एमएस, और 100ms; एक लघु एक 2 एमएस stepwise S1S2 कमी के साथ युग्मित extrastimulus ए वी नोडल के संचालन के नुकसान के साथ) ।
    3. सबसे लंबे समय तक S1S2 (12 उत्तेजनाओं के रूप में अलिंद और वेंट्रिकुलर दुर्दम्य अवधियों का निर्धारण; S1S1:१२० एमएस, ११० एमएस, और 100ms; एक लघु एक 2 एमएस stepwise S1S2 कमी के साथ युग्मित extrastimulus) एक अनुपस्थित अलिंद या वेंट्रिकुलर प्रतिक्रिया के साथ10,11।
  2. एक क्रमादेशित extrastimulation प्रदर्शन (S1S1:१२० एमएस, १०० एमएस, और ८० एमएस, अप करने के लिए 3 अतिरिक्त धड़कता द्वारा पीछा किया; ६०-20 एक 2 एमएस stepwise कमी के साथ एमएस) या फट पेसिंग प्रोटोकॉल (S1S1 में 5 एस: ५०-10 ms के साथ एक 10 ms stepwise कमी) लाइन में ईवा को लैम्बेथ संमेलनों के साथ luate को वेंट्रिकुलर arrhythmogenesis10,11,12.

5. Epicardial आचरण मापन

नोट: रिकॉर्ड एकध्रुवीय epicardial electrograms का उपयोग करके एक १२८-चैनल, कंप्यूटर की मदद से रिकॉर्डिंग सिस्टम के साथ एक नमूना दर 25 kHz के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन मैपिंग. ३२ बहु-इलेक्ट्रोड सरणी (मेे; अंतर-इलेक्ट्रोड दूरी: ३०० µm; १.८ x १.८ mm) का उपयोग करें । ध्यान दें कि डेटा bandpass फ़िल्टर (५० हर्ट्ज) थे और 12 बिट और 20 एमवी की एक संकेत रेंज के साथ डिजीटल ।

  1. मेे जगह दिल के नामित क्षेत्र में लगाएं और दिल के13,14,15के एक और हिस्से को जमीनी रूप से जोड़ें ।
  2. प्लेस एक epicardial उत्तेजना कैथेटर विदेश मंत्रालय के पास और एक निरंतर उत्तेजना शुरू करते हैं ।
  3. संकेत की गुणवत्ता और आयाम की जाँच करके इलेक्ट्रोड के अच्छे संपर्क की पुष्टि के बाद रिकॉर्डिंग शुरू.
  4. प्रसार की दिशा में लहर प्रचार वेग और फैलाव के निर्धारण के लिए एक ऑफ़लाइन विश्लेषण का प्रयोग करें ।

6. Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट)-आधारित चक्रीय Adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर) इमेजिंग

नोट: झल्लाहट आधारित माप के लिए, सीएजी से फसल दिलों-Epac1-शिविरों ट्रांसजेनिक चूहों16.

  1. एक stereomicroscope15,17के आसपास एक आत्म निर्मित इमेजिंग प्रणाली का प्रयोग करें ।
  2. stereomicroscope को दिल के सामने रखें और उसे तीक्ष्णता के लिए एडजस्ट करें ।
  3. एक प्रकाश स्रोत के साथ शिविर संवेदक उत्तेजित [उदा., एक एकल तरंग दैर्ध्य प्रकाश उत्सर्जक डायोड (४४० एनएम) का उपयोग करें] । दाता और स्वीकार्य चैनल में उत्सर्जन प्रकाश भाजित एक बीम-अलगानेवाला का उपयोग कर (एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए/पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़ी, एक 565dcxr dichroic मिरर और D480/30 और D535/40 उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें) ।
  4. चैंबर के चारों ओर एक प्लास्टिक लपेटो डाल द्वारा एक स्थिर तापमान सुनिश्चित करें ।
  5. एक वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (sCMOS) कैमरे का उपयोग करके छवियों को ले लो । प्रकाश स्रोत और कैमरा छवि ऐसे सूक्ष्म प्रबंधक के रूप में एक खुला स्रोत इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ कब्जा समंवय ।
  6. छवि प्राप्ति शुरू करने के लिए, मल्टी-डी Acqको पुश करें । बटन और एक समय चूक है, जो एक छवि हर 10 एस, उपयुक्त जोखिम समय है, जो फ्लोरोसेंट संकेत की ताकत पर निर्भर करता है (१०० ms के आसपास) के साथ प्राप्त की स्थापना की ।
  7. का प्रयोग करें पहले वर्णित और उपलब्ध झल्लाहट ऑनलाइन और झल्लाहट ऑनलाइन 2 plugins17 दो चैनलों में छवि विभाजित करने के लिए, ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें, और अनुपात अनुरेखण की निगरानी ।
  8. अर्जन के दौरान perfuse ने हृदय को विभिन्न पदार्थो से युक्त संशोधित Krebs-Henseleit सॉल्यूशन के साथ प्रयोग की प्रकृति पर निर्भर किया ।
  9. प्रयोग के अंत में, रोकें बटन को धकेल कर और छवियों के ढेर को बचाने के लिए अधिग्रहण बंद कर दें ।
  10. एक समर्पित विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि दाता और स्वीकारकर्ता चैनल के लिए दो समान वर्गों में छवियों को विभाजित कर सकते है और कई क्षेत्रों-ब्याज में झल्लाहट विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते है का उपयोग कर झल्लाहट डेटा ऑफ़लाइन विश्लेषण ।
    नोट: एक समर्पित प्लग में (ऑफलाइन झल्लाहट) की जरूरत है, जो Sprenger एट अल में प्रदान की जाती है । 17.
    1. सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें । Plugins मेनू पर जाकर विश्लेषण खोलें, फिर MicroManagerपर क्लिक करें, और फिर खोलें माइक्रो-प्रबंधक फ़ाइलपर ।
    2. आदेश में समय-चूक को विभाजित करने के लिए दो समान छवियों में और YFP चैनल के लिए झल्लाहट ऑफलाइन प्लगइन भागो ।
    3. YFP छवि में रुचि के क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग करें । चयन को बहु माप विंडो में जोड़ने के लिए जोड़ें बटन दबाएं ।
    4. प्रत्येक फ्रेम और क्षेत्र के लिए मतलब ग्रे मूल्यों के साथ एक तालिका प्राप्त करने के लिए बहु माप विंडो और प्रेस बहु में रुचि के क्षेत्र चुनें । किसी Excel पत्रक में सभी डेटा की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं ।
    5. वि चित्रित छवि स्टैकपर क्लिक करें । एक ही कार्य करने के लिए चरण 6.10.4 में के रूप में और एक ही एक्सेल शीट में मतलब ग्रे मान पेस्ट करें ।
  11. सही कच्चे डेटा को स्वीकार करने के लिए-दाता के माध्यम से खून-कारक के लिए ऑफ़लाइन17।
    1. निंनलिखित सूत्र का प्रयोग करें, जहां बी खून के माध्यम से कारक है:
      अनुपात = (YFP-बी एक्स
    2. खून से कारक बी के माध्यम से निर्धारित इमेजिंग एक दिल केवल और YFP चैनल में दाता प्रतिदीप्ति के प्रतिशत को मापने के लिए केवल और माप (b = YFP/

7. Neuromorphology

नोट: बरकरार murine दिलों की पूरी माउंट immunostainings का उपयोग करके intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र का विश्लेषण । ध्यान दें कि intracardiac गैंग्लिया के बहुमत epicardial वसा ऊतक फेफड़े की नसों के करीब में स्थानीयकृत रहे हैं ।

  1. neurofilament के चित्रण के लिए अलग दाग का प्रयोग करें (सामान्य न्यूरॉन संरचनाओं; चिकन विरोधी NF-H, 1:3000), tyrosine hydroxylase (गु, सहानुभूति न्यूरॉनी संरचनाओं; खरगोश α गु, 1:1000), व choline acetyltransferase (ChAT, parasympathetic न्यूरॉन संरचनाओं; बकरी α मारिए, 1:50).
  2. Langendorff तंत्र में छिड़काव के बाद, 24 घंटे के लिए formalin के 10 मिलीलीटर में माउस दिल ठीक है और उंहें फॉस्फेट में स्टोर-बफर खारा (पंजाब) में 4 ˚ सी ।
  3. ब्लीच सेंध के ब्लीच में दिल (4:1:1 मेथनॉल: हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान एच2में 30% (डब्ल्यू/dimethyl sulfoxide (DMSO)) 4 ˚ सी पर 1 सप्ताह के लिए और उंहें बाद में पंजाब के लिए (१००%, ७५%, ५०%, 25%, 1 एच प्रत्येक) में उतरते मेथनॉल की एक श्रृंखला में फिर से निर्जलीकरण । 18.
  4. 4 ˚ सी में एक सौंय आंदोलन के साथ एक 24 अच्छी प्लेट प्रारूप में निंनलिखित की मशीन प्रदर्शन:
    1. Permeabilize 1% में दिल ट्राइटन-X-100/पंजाबियों (पंजाब-टी) 3x 1 h के लिए कमरे के तापमान पर उंहें एक अवरुद्ध बफर में रातोंरात अवरुद्ध करने से पहले [5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)/पंजाब-टी + ०.२% सोडियम azide] ।
    2. इस प्रकार के रूप में एंटीबॉडी पतला: बकरी α चैट (1:50), खरगोश α ध (1:1000), चिकन α neurofilament (1:3000); फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500; या निर्माता के निर्देशों के अनुसार); chromogenic ्र के लिए biotinylated सेकंडरी एंटीबॉडी (1:200; या निर्माता के निर्देशों के अनुसार).
  5. 4 ˚ सी में 1 सप्ताह के लिए एक अवरुद्ध बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में नमूनों की मशीन
  6. 4 दिनों के लिए एक अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडीी गर्मी से पहले पंजाब में 3 x 15 मिनट के लिए दिलों को धो लें ।
  7. पंजाब में 3 x 15 मिनट के लिए दिलों को धो-टी और उंहें कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए एक बढ़ते मध्यम में और एक avidin-बायोटिन जटिल जांच किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग की दुकान ।
  8. पूर्व एक वाणिज्यिक बफर में 1 एच के लिए दिलों की मशीन 3, 3 ' के लिए-diaminobenzidine (ढाब), उंहें एक में एक दृश्य नियंत्रण के तहत विकसित करने से पहले एक ढाब युक्त बफर निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
  9. डबल आसुत जल में नमूनों की दुकान ।
  10. आयल वर्गों के लिए, निर्जलीकरण और आयल में दिलों को एंबेड ।
    1. 4-µm मोटे सेक्शन काट लें और उन्हें प्रयोगशाला की रूटीन प्रक्रियाओं के अनुसार deparaffinize । क्या और कैसे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की जरूरत है प्रदर्शन करने की जरूरत है हर व्यक्ति के लिए स्थापना के लिए स्थापित किया जा सकता है क्योंकि यह एंटीबॉडी संयोजन पर निर्भर करता है ।
    2. ०.२% ट्राइटन-x-100/Tris-बफ़र्ड खारा (टीबीएस) में 10 मिनट के लिए वर्गों Permeabilize, इसके बाद 3 X 5 मिनट टीबीएस में बहाकर ।
    3. कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए 3% BSA/टीबीएस के साथ उंहें ब्लॉक ।
    4. उंहें 4 ˚ सी पर रात भर मशीन [प्राथमिक एंटीबॉडी: बकरी α चैट (1:50), खरगोश α (1:500), चिकन α neurofilament (1:1000)] या कमरे के तापमान पर 2 ज (प्रतिदीप्ति-बला माध्यमिक एंटीबॉडी, 1:500) में 1% BSA/टीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट के बीच में बहाकर टीबीएस ।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए bisbenzimide H33342 trihydrochloride के 1 µ g/एमएल जोड़ें या एक अलग परमाणु धुंधला विधि का उपयोग करें ।
    6. माउंट फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एक बढ़ते माध्यम में स्लाइड ।

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Representative Results

चित्रा 1 2 बहु इलेक्ट्रोड सरणियों (रहत) सहित Langendorff सेटअप की एक छवि से पता चलता है. प्रयोग करने से पहले, intracardiac कैथेटर प्रवेशनी के करीब तैनात है सही atrium में एक त्वरित और आसान प्रविष्टि की सुविधा के लिए और equilibration शुरू कर सकते हैं जब तक एक कम समय अवधि सुनिश्चित करने के लिए । चैंबर के निचले हिस्से बढ़ सकता है ( चित्रा 1में तीर देखें) ताकि चैंबर पूरी तरह से बंद है और एक स्थिर तापमान की गारंटी देता है ।

चित्रा 2 अलग प्रतिनिधि हृदय के दाग को दर्शाया गया है । चित्रा 2a में एक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) एक तेल अनुभाग के दाग प्रस्तुत किया है । अनुकरणीय इज़ाफ़ा (चित्रा बीसी) में, एक अलिंद नाड़ीग्रंथि की एक immunohistochemical धुंधला मुख्य रूप से parasympathetic कोशिकाओं को दर्शाता है (लाल, चैट सकारात्मक) कम कई सहानुभूति कोशिकाओं की तुलना में (हरे, वें सकारात्मक). चित्रा 2cमेंई तंत्रिका के एक immunohistochemical धुंधला (चित्रा 2c, हरे, neurofilament) और सहानुभूति फाइबर (चित्रा 2d, लाल, गु) के रूप में अच्छी तरह से दो छवियों के ओवरले (चित्रा 2E) का चित्रण कैसे तंत्रिका तंतुओं पीछे निलय की ओर कोरोनरी साइनस के माध्यम से atria से पार ।

चित्रा 3 murine दिल सही atrium और सही निलय में एक डाला octapolar कैथेटर और पूर्वकाल वाम निलय पर रखा एक epicardial बहु इलेक्ट्रोड सरणी (मेे) के साथ Langendorff तंत्र के प्रवेशनी से जुड़ा से पता चलता है ( चित्र 3ए) । आर. वी. में इलेक्ट्रोड्स के जरिए वेंट्रिकुलर अतालता झेलते हुए परीक्षण को चित्रा बीमें प्रस्तुत किया गया है. दिल में एक वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता की प्रेरण आंशिक अलिंद वितंत्रीभवन के बाद अधिक बार हुई । बढ़े हुए मेे (आरेख 3 c) इलेक्ट्रोड्स का योजनाबद्ध लेआउट प्रस्तुत किया जाता है । यह सभी इलेक्ट्रोड के एक स्थिर epicardial संपर्क सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 3d में ऑफलाइन-विश्लेषित epicardial एक मेे द्वारा दर्ज आचरण दर्शाया गया है ।

चित्रा 4 एक पूरे दिल में Langendorff तंत्र में प्रतिगामी perfused जा रहा है झल्लाहट माप से पता चलता है. दिल के विभिंन क्षेत्रों की जरूरत के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र 4a) । एक वैश्विक और साथ ही फार्मास्यूटिकल्स के स्थानीय सामयिक आवेदन इस सेटअप में आसानी से संभव है (चित्रा 4B) ।

Figure 1
चित्रा 1: बहु इलेक्ट्रोड arrays सहित Langendorff सेटअप (रहत) । octapolar उत्तेजना और रिकॉर्डिंग कैथेटर जिस क्षेत्र में दिल संलग्न किया जाएगा के करीब रखा गया है । कक्ष के निचले हिस्से को ऊपर की ओर ले जाया जाएगा (सफेद तीर) के बाद दिल को उपकरण से जुड़ी हुई है ताकि एक स्थिर तापमान सुनिश्चित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कार्डिएक पूरे माउंट स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के कुछ हिस्सों चित्रण दाग । क) एक कार्डिएक एच और ई सना हुआ आयल खंड (स्केल बार 1 मिमी) का चित्रण । ख) एक immunohistochemically सना हुआ अलिंद नाड़ीग्रंथि की एक अनुकरणीय इज़ाफ़ा मुख्य रूप से parasympathetic कोशिकाओं (लाल, चैट सकारात्मक) को दर्शाता है कम कई सहानुभूति कोशिकाओं की तुलना में (हरे, गु-सकारात्मक; स्केल बार ७५ µm) । सी-ई) प्रतिनिधि immunohistochemical के दाग तंत्रिका (चित्रा 2c, हरे, neurofilament, NF) और सहानुभूति फाइबर (चित्रा 2d, लाल, गु, और उनके ओवरले चित्रा 2Eमें) कोरोनरी साइनस (सीएस) के माध्यम से atria से पार पीछे निलय । अनुकरणीय फाइबर ऐरोहेड द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. तारका निरूपित अलिंद गैंग्लिया. स्केल बार 1 मिमी. ला, वाम atrium; LV, वाम निलय; NF, neurofilament; पीवी, फुफ्फुसीय नसों; रा, सही atrium; RAA, अधिकार अलिंद संलग्नता; आर. एल., सम्यक निलय. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3: Langendorff सेटअप का उपयोग कर अंतर और epicardial माप. a. यह पैनल Langendorff प्रणाली के भीतर एक murine दिल का एक उदाहरण दिखाता है । intracardiac octapolar कैथेटर, जो सही atrium और निलय में डाला जाता है, और एक epicardial बहु इलेक्ट्रोड सरणी (मेे) चित्रित कर रहे हैं । ख. अतालता संवेदनशीलता (नियंत्रण) के बिना फट उत्तेजना का उपयोग कर या एक आत्म के प्रेरण के साथ वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता [आंशिक अलिंद वितंत्रीभवन (पैड) के बाद] चित्रित कर रहे हैं । C. epicardial मेे योजनाबद्ध इलेक्ट्रोड लेआउट की वृद्धि के साथ दर्शाया गया है । D. वेव प्रचार वेग एक कस्टम-निर्मित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । isochrones के बीच की दूरी 2 मी । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Figure 4
चित्रा 4: एक Langendorff सेटअप में झल्लाहट माप. एक प्रतिगामी perfused दिल में झल्लाहट माप के दौरान एदो differentcAMP प्रतिदीप्ति चैनल [पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) और सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एक) को चित्रित कर रहे हैं । यदि आवश्यक हो, दिल के विभिंन भागों (जैसे, atria और निलय) (स्केल बार: 1 मिमी) का विश्लेषण किया जा सकता है । इस पैनल के एक प्रतिनिधि झल्लाहट प्रयोग है, जो atrium और वाम निलय में एक औषधीय उत्तेजना के दौरान शिविर के स्तर के उपाय से पता चलता है । सबसे पहले, हार्ट adenylyl cyclase उत्प्रेरक NKH477, एक forskolin analogon, शिविर के स्तर को बढ़ाने के साथ प्रणालीबद्ध perfused था । तो निकोटीन सामयिक लागू किया गया था और अलिंद गैंग्लिया, जो तीव्रता से कम शिविर के स्तर पर लक्षित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, प्रसिद्ध Langendorff पूर्व vivo हार्ट छिड़काव प्रणाली हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmogenesis पर intracardiac न्यूरॉन्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है विभिन्न मानचित्रण और उत्तेजना तकनीकों का उपयोग करके जिसमें endocardial और epicardial दृष्टिकोण शामिल हैं ।

प्रोटोकॉल के कई भागों सेटअप के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, यह एक तैयारी तकनीक है जिसमें अलिंद वसा पैड बरकरार रहने या मायोकार्डियम घायल बिना जल्दी से हटा दिया जाता है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरा, एक अच्छी तरह से खोलने के आकार सही atrium और सही निलय में octapolar कैथेटर का एक आसान सम्मिलन के लिए सही atrium में कटौती की जानी है । कैथेटर किसी भी दबाव पैदा करने के बिना सही निलय में आसानी से पर्ची चाहिए । प्रवेशनी को कैथेटर के लगाव के दौरान, कैथेटर गहरी निलय में डुबकी नहीं, हृदय की चोट से बचने के लिए करना चाहिए । तीसरा, तापमान नियंत्रण सभी Langendorff setups के एक महत्वपूर्ण हिस्सा है1,2,5। थर्मल कक्ष अतालता परीक्षण के दौरान बंद कर दिया है, एक स्थिर तापमान सुनिश्चित करने । लेकिन विदेश मंत्रालय या झल्लाहट रिकॉर्डिंग के लिए, चैंबर के लिए कम से आंशिक रूप से माप की अनुमति के लिए खुला होना चाहिए । या तो रिकॉर्डिंग समय एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए, या अन्य तकनीकों तापमान हानि को कम करने के लिए, अब माप के दौरान चैंबर के आसपास एक प्लास्टिक लपेटो डाल की तरह, प्रदर्शन किया जाना चाहिए. चौथा, सभी प्रयोगों में एक ही संरचनात्मक स्थानों पर रहत रखी जानी चाहिए. अच्छा सतह संपर्क है, जो वास्तविक समय विश्लेषण में बड़े आयाम की पुष्टि की है, विपरीत स्थलों पर दो रहत का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है ताकि एक counterbalance का उत्पादन किया है । पांचवां, झल्लाहट माप आंदोलन से प्रभावित हैं । सहज आंदोलन को कम करने के लिए, दिल intracardiac कैथेटर द्वारा एक स्थिर आवृत्ति पर paced है । अतिरिक्त स्थिरीकरण के लिए, एक मामूली वैक्यूम के साथ एक ट्यूब एपेक्स को स्थिर कर सकते हैं ।

Langendorff प्रणाली का एक लाभ यह है कि दिल हृदय तंत्रिका तंत्र के immunohistological आकलन के लिए बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है । सतत छिड़काव सबसे लाल रक्त कोशिकाओं है जो19autofluorescence के एक उच्च स्तर है निकालता है, धुंधला की गुणवत्ता में सुधार । formalin निर्धारण के बाद, दिलों को नियंत्रित तापमान में संग्रहित किया जा सकता है (4 ˚ ग) फास्फेट में एक साल तक के लिए बफर खारा गुणवत्ता धुंधला में ध्यान देने योग्य परिवर्तन के बिना ।

इस सेटअप की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि सभी माप एक केंद्रीय denervated दिल में प्रदर्शन कर रहे हैं । मुख्य रूप से parasympathetic अलिंद intracardiac गैंग्लिया दिल के भीतर पिछले रिले स्टेशन20 के रूप में सहानुभूति नाड़ीग्रंथि stellatum intrathoracically स्थित है और इसलिए तैयारी के दौरान हटा दिया जाता है । हालांकि intracardiac न्यूरॉन्स कोई केंद्रीय इनपुट मिलता है, यह दिखाया गया है कि वे अभी भी एक शारीरिक तरीके से हृदय सहानुभूति नसों के photoactivation के रूप में सक्रिय हैं दिल की दर और कार्डियक सिकुड़ा बल21बढ़ जाती है. इन निष्कर्षों के साथ लाइन में केंद्रीय denervated दिल में intracardiac ंयूरॉंस के कार्यात्मक महत्व का समर्थन, हम हाल ही में वेंट्रिकुलर समारोह और arrhythmogenesis पर अपने प्रभाव का प्रदर्शन किया15।

इस केंद्रीय denervated सेटअप का एक लाभ यह है कि यह शोधकर्ता विभिंन intracardiac क्षेत्रीय तंत्रिका नेटवर्क के बीच संचार का अध्ययन करने की अनुमति देता है (जैसे, atrium और निलय के बीच बातचीत)15। ये मतभेद हृदय प्रत्यारोपण के बाद रोगियों के लिए प्रासंगिक हो सकता है जिनके साथ इलाज के लिए चयनात्मक साइनस नोड मॉडुलन ivabradine में सुधार, बीटा ब्लॉकर metoprolol succinate22के साथ उपचार की तुलना में । एक भविष्य के कदम में, parasympathetic (vagus तंत्रिका) या सहानुभूति संरचनाओं (जीजीएल. stellatum23) के प्रत्यक्ष विद्युत उत्तेजना अतिरिक्त और intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के बीच बातचीत के बारे में हमारी जानकारी में सुधार करने में मदद मिलेगी ।

यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि parasympathetic और सहानुभूति फाइबर ज्यादातर सह स्थानीयकृत रहे है ताकि अलिंद या वेंट्रिकुलर अतालता के कैथेटर पृथक की तरह वर्तमान उपचार अनिवार्य रूप से दोनों संरचनाओं को संशोधित करेगा । यहां वर्णित सेटअप में, लक्षित संरचनाओं के स्थानीय दवा संशोधन (जैसे, parasympathetic गैंग्लिया की विशिष्ट उत्तेजना) का अध्ययन किया जा सकता है । लक्षित संशोधनों के अलावा, विभिंन दवाइयों (जैसे, बीटा ब्लॉकर्स) के साथ वैश्विक छिड़काव आसानी से संभव है, ताकि संभावित proarrhythmic या विभिंन एजेंटों के antiarrhythmic गुणों का अध्ययन किया जा सकता है । इस सेटअप का उपयोग करना, हस्तक्षेप और विभिंन तकनीकों उत्तेजना या intracardiac स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के विभिंन भागों के निषेध के दौरान परीक्षण किया जा सकता है, पर स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के विशिष्ट भागों के प्रभाव की जानकारी का खुलासा कार्डियक फंक्शन और arrhythmogenesis । इसके अलावा, murine सेटअप रोधगलन, दिल की विफलता या मधुमेह की तरह रोग के राज्यों में कार्डियक स्वायत्त तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देता है ।

अंत में, सरल और प्रसिद्ध Langendorff पूर्व vivo हार्ट छिड़काव प्रणाली को संशोधित करने और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और arrhythmogenesis पर intracardiac न्यूरॉन्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक लचीला आधार प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Hartwig Wieboldt शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और उ्के माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा (ि ऊम्फ) विश्वविद्यालय के चिकित्सा केंद्र हैंबर्ग-माइक्रोस्कोप और समर्थन प्रदान करने के लिए Eppendorf । इस अनुसंधान bythe Förderverein डेस Universitären Herzzentrums हैंबर्ग e.V. और DZHK द्वारा वित्त पोषित किया गया (हृदय अनुसंधान के लिए जर्मन केंद्र) [FKZ 81Z4710141] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate Sigma-Aldrich 401676 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880 Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 Modified Krebs-Henleit solution
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra Sigma-Aldrich P8574 Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22 EMD Millipore SCGPT05RE Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulation
Hexamethonium chloride Sigma-Aldrich H2138 Neuromodulation
Nicotine free base 98-100% Sigma-Aldrich N3876 Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128 Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco / Invitrogen 18912-014 Whole mount staining
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787 Whole mount staining
Albumin bovine fraction V Biomol, Hamburg, Germany 11924.03 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG R&D Systems AP182B Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG R&D Systems AP192P Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY R&D Systems BAD010 Whole mount staining
Vectashield mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA H-1000 Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA PK-4000 Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus Abcam plc, Cambridge, UK ab103723 Whole mount staining
HistoClear DiaTec, Bamberg, Germany HS2002 Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA VEC-H-1400 Immunohistochemistry
Perfusion system HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany  73-4343 Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand PL3508 PowerLab 8/35 Langendorff setup
Octapolar catheter CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA custom Langendorff setup
Stimulus generator STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany STG4002-160µA Stimulation setup
Stimulation software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Stimulus II Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany USB-ME128-System MEA setup
Multi-electrode array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany EcoFlexMEA36 MEA setup
Multi-electrode array recording software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Rack MEA setup
Spring scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15003-08 Heart Preparation
Strabismus Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14575-09 Heart Preparation
Mayo Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14110-15 Heart Preparation
Dumont SS Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11203-25 Heart Preparation
London Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11080-02 Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11003-13 Heart Preparation
Plastic Wrap Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States Consumable Materials
Stereomicroscope Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany FRET
LED CoolLED, Andover, UK pE-100 FRET
DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA DV2-SYS FRET
DualView filter set Photometrics, Tucson, AZ, USA 05-EM FRET
optiMOS scientific CMOS camera Qimaging, Surrey, BC, Canada 01-OPTIMOS-R-M-16-C FRET
Imaging software   Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA FRET
Analysis Software Image J software; Public Domain, NIH, USA FRET

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References

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चिकित्सा अंक १३५ स्वायत्त तंत्रिका तंत्र वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता स्वायत्त गैंग्लिया intracardiac तंत्रिका तंत्र पृथक अचानक हृदय मृत्यु
एक <em>पूर्व Vivo</em> Langendorff प्रणाली में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और Arrhythmogenesis पर Intracardiac न्यूरॉन्स का प्रभाव
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Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. … More

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).

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