Summary
Här presenterar vi ett protokoll för moduleringen av intrakardiellt autonoma nervsystemet och bedömningen av dess påverkan på grundläggande elektrofysiologi, arrhythmogenesis och läger dynamics med en ex vivo av installationsprogrammet.
Abstract
Sedan dess uppfinning i sent 19: e talet fortsätter av ex vivo hjärtat perfusion systemet att vara ett relevant verktyg för att studera ett brett spektrum av fysiologisk, biokemisk, morfologisk och farmakologiska parametrar i centralt denervated hjärtan. Här beskriver vi en setup för moduleringen av intrakardiellt autonoma nervsystemet och bedömningen av dess påverkan på grundläggande elektrofysiologi, arrhythmogenesis och cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) dynamics. Intrakardiellt autonoma nervsystemet moduleras av mekaniska dissektion av förmaksflimmer fett kuddar-i vilken murina ganglier finns främst — eller genom användningen av globala samt riktade farmakologiska interventioner. En octapolar Elektrofysiologisk kateter införs i höger förmak och höger kammare och epikardiell placerade multi elektrod matriser (MEA) för högupplösta mappning används för att bestämma hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis. Förster resonans energiöverföringen (bandet) imaging utförs för realtid övervakning av cAMP-nivåerna i olika hjärt regioner. Neuromorphology studeras med hjälp av antikroppsbaserade färgning av hela hjärtan med neuronala märkpennor för att vägleda identifiering och modulering av specifika mål av intrakardiellt autonoma nervsystemet i de utförda studierna. Ex vivo av inställningen tillåter för ett stort antal reproducerbara experiment på kort tid. Dock delvis öppna karaktär av installationen (t.ex., under MEA mätningar) försvårar konstant temperaturkontroll och bör hållas till ett minimum. Här beskrivs metoden gör det möjligt att analysera och modulera intrakardiellt autonoma nervsystemet i decentraliserade hjärtan.
Introduction
Av ex vivo hjärtat perfusion systemet fortsätter att vara ett relevant verktyg för att utföra ett brett spektrum av fysiologisk, biokemisk, morfologisk och farmakologiska studier i centralt denervated hjärtan1,2 ,3,4,5 sedan dess uppfinning i sena 19: e talet6. Hittills har detta system fortfarande används flitigt för olika ämnen (t.ex., ischemi reperfusion) eller studera hjärt farmakologiska effekter7,8, och är ett grundläggande verktyg i kardiovaskulär forskning. Livslängden på denna metod resulterar från flera fördelar (t.ex., mätningar utförs utan påverkan av centrala nervsystemet eller andra organ, systemiska cirkulationen eller cirkulerande hormoner). Om det behövs kan läkemedel läggas på ett kontrollerat sätt till perfusion bufferten eller tillämpas på specifika strukturer direkt. Experiment är reproducerbara och ett relativt högt antal experiment kan utföras i en kort tidsperiod. (Delvis) öppna karaktär av installationen kan göra temperaturreglering svår och måste beaktas. Även om det av systemet används också i större arter9, mindre djur används främst som den experimentella setup är mindre komplex och en större biologisk variabilitet (t.ex., transgen mus modeller) kan användas.
I experimentella inställningen av detta protokoll är påverkan av intrakardiellt autonoma nervsystemet på grundläggande elektrofysiologiska parametrar, ventrikulär arrhythmogenesis, epikardiell överledning och cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) dynamics utvärderas. Ett stort antal intrakardiellt ganglier, som främst finns i de förmaksflimmer fett kuddar och är nu väl känt att styra hjärtats elektrofysiologi oberoende från neurala centralstyrning, är antingen kvar intakt eller manuellt bort med noggrann mekanisk dissektion. En farmakologisk modulering av det autonoma nervsystemet utförs antingen globalt genom att lägga till läkemedel perfusion bufferten eller lokalt genom riktade modulering av förmaksflimmer ganglier. Efter experiment är hjärtan väl lämpade för en immunohistological bedömning som alla blodkroppar har tagits bort på grund av kontinuerlig perfusionen, vilket kan öka kvaliteten på färgning.
Teknikerna som beskrivs övergripande mål är att erbjuda nya perspektiv för detaljerade studier om effekterna av det autonoma nervsystemet på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis i mus hjärtat. En anledning att använda denna teknik är att det är möjligt att studera och förändra det autonoma nervsystemet utan påverkan av centrala nervsystemet. En stor fördel är lätt anställning av farmakologiska experiment, i vilka potentiella pro- eller antiarytmiska egenskaper av gamla och nya agenter kan testas. Dessutom finns transgena och knockout musmodeller av olika hjärtsjukdomar att undersöka mekanismerna bakom arytmier, hjärtsvikt eller metabola sjukdomar. Detta tillvägagångssätt har ökat vår förståelse för hur det autonoma nervsystemet på nivån förmaksflimmer kan påverka ventrikulära hjärtats elektrofysiologi och induktion av arytmier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur godkändes av de lokala myndigheterna i den staten i Hamburg, de Universitetar av Hamburg djurvård och användning kommittéer.
1. beredning av av apparaten
Obs: Ett kommersiellt tillgängliga av perfusion system används.
- Bered en modifierad Krebs-Henseleit (119 mM av natriumklorid, 25 mM av natriumbikarbonat, 4.6 mM kalium klorid, 1,2 mM av kaliumfosfat, monobasiskt, 1,1 mM av magnesiumsulfat, 2,5 mM av kalciumklorid, 8,3 mM av glukos och 2 mM natrium pyruvat). Tillsätt en blandning av 95% oxygen/5% koldioxid till perfusion lösning för att förhindra kalcium nederbörd. Filtrera bufferten med en porstorlek på 0,22 µm.
- Lägga till en farmakologisk agent bufferten att undersöka dess effekt på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis som behövs.
- Starta vattenbadet och placera perfusion lösningen inklusive en blandning av 95% oxygen/5% koldioxid i den. Justera temperaturen i vattenbadet, så att perfusion lösningen temperaturen direkt innan kanylen är ~ 37 ˚C.
- Starta pumpen rullen och fyll apparaten med perfusion lösningen så snart rätt temperatur nås.
- Justera pumpen innan du bifogar hjärtat, så att inga luftbubblor finns kvar i kanylen när du monterar det på apparaten.
2. hård - och mjukvara förberedelse
- Anslut en digital system för datainsamling och dess motsvarande mjukvara till av utrustningen för en kontinuerlig registrering av perfusionstrycket, flöde, och puls.
- Ange den riktade perfusionstrycket i allmänna inställningar till 80 mmHg.
- Starta inspelningen.
- Använda en elektrofysiologi kateter (Tabell för material) med platina elektroder, en elektrod ytan av 0,5 x 0,5 mm och en elektrod avstånd 0,5 mm för dataregistrering och stimulering med en utsedda digital stimulans generator.
- Placera katetern nära området där hjärtat placeras efter den bifogade filen på apparaten.
- Förbereda stimulering genom att välja 2 elektroder från katetern och använda en Cykellängd 100 MS.
3. beredning av hjärtat
- Lägg kallt (~ 2-4 ˚C) perfusion buffert (10-20 mL och 40-50 mL, så att hela skålen täcks) till de 2 Petriskålarna (diameter på 6 cm och 10 cm) och skålen med en kanyl och placera dem på glass direkt nästa och under mikroskopet. Förbereda en dubbel Knut runt kanylen.
- Punktskatt snabbt hjärtat efter cervikal dislokation genom att öppna bröstkorgen med hjälp av Mayo sax och smala mönster pincett. Sedan gripa om aorta och vena cava ovan diafragma använder London tången och punktskatt hjärt-lung blocket genom att skära alla kärl och bindväv nära ryggraden med skelning saxen.
- Överföra hjärt-lung blocket till första skålen (6 cm diameter) fylld med iskall bufferten och ta försiktigt bort lungorna utan att skada hjärtat med hjälp av skelning sax och London pincett. Placera sedan hjärtat under mikroskopet och ta försiktigt bort tymus, matstrupen och luftstrupen med hjälp av våren sax och Dumont SS pincett.
- Använd våren saxen för att klippa ett hål på 1,5-2 mm i den övre delen av höger förmak för införande av katetern. Skär ett hål i lungartären. Sedan skär aorta direkt under supraaortic grenar och ta bort vävnad från aorta, så att Knut kan kopplas enkelt.
- Hålla de förmaksflimmer fett kuddar, inklusive stora atrially ligger ganglionated plexi, runt vänster förmak intakt eller helt ta bort dem genom noggrann dissektion.
- Överföra hjärtat till skålen med kanylen och placera den under mikroskopet. Dra aorta över kanylen med Dumont SS tången och vigas beredda tätt runt aorta. Se till att kanylen inte är placerad för djupt i aorta så att aortaklaffen och koronar fartyg kvar gratis.
- Fäst kanylen snabbt av apparaten. Kontrollera att det inte finns några bubblor kvar i kanylen.
- Växla till perfusionstrycket till 80 mmHg, så att ett konstant tryck perfusion.
- Sätt katetern försiktigt in i höger förmak och höger kammare utan att vidröra eller skada hjärtat och fäst katetern kanylen med tejp.
- Börja stimulering med den förberedda cykellängden 100 ms för första 20 min Jämviktstiden tid.
- Stäng i kammaren så att en stabil temperatur.
4. elektrofysiologiska parametrar och Arrhythmogenesis
- Applicera en programmerad stimulering via de distala eller proximala elektroderna av katetern vid två gånger förmaks- eller kammarflimmer pacing tröskeln att utvärdera de elektrofysiologiska parametrarna som beskrivs i följande steg.
- Bestämma sinusknutan återhämtningstiden med maximal avkastning cykel längd efter 10 s av fast ränta pacing på en S1S1 Cykellängd 120 ms 100 ms och 80 ms.
- Fastställa den Wenckebach punkten som den längsta S1S1 cykellängden (8 stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms stegvis minskning) med en förlust på 11 AV nodal överledning. Avgöra de atrioventrikulär nodal refraktärperioder som den längsta S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms och 100ms; en kort tillsammans extrastimulus med en 2 ms stegvis S1S2 minskning) med en förlust av AV nodal överledning.
- Avgöra de förmaks- och refraktärperioder som den längsta S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms och 100ms; en kort tillsammans extrastimulus med en 2 ms stegvis S1S2 minskning) med ett frånvarande förmaks- eller kammarflimmer svar10,11.
- Utföra en programmerad extrastimulation (S1S1: 120 ms 100 ms och 80 ms, följt av upp till 3 extra beats; 60-20 ms med en 2 ms stegvis minskning) eller burst pacing protokoll (5 s vid S1S1: 50-10 ms med en stegvis minskning 10 ms) i linje med de Lambeth konventioner till eva luate den ventrikulära arrhythmogenesis10,11,12.
5. epikardiell överledning mätningar
Obs: Post unipolär epikardiell electrograms genom att använda en 128-kanal, datorstödd inspelningssystem med en samplingsfrekvens på 25 kHz för högupplösta mappning. Använda en 32 multi elektrod array (MEA; mellan elektrod avstånd: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Observera att uppgifterna var bandpass filtreras (50 Hz) och digitaliserade med 12 bitar och en räckvidd på 20 mV.
- Placera MEA i det angivna området av hjärtat och lägga till grundstötningen i en annan del av hjärtat13,14,15.
- Placera en epikardiell stimulering katetern nära MEA och starta en konstant stimulering.
- Starta inspelningen efter bekräftelse av bra kontakt av elektroder genom att kontrollera signalkvaliteten och amplitud.
- Använd en offline analys för bestämning av vinkar förökning hastighet och spridning i överledning riktning.
6. Förster resonans energi överföra bandet-baserade cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) Imaging
Obs: För bandet-baserade mätningar, skörda hjärtan från CAG-Epac1-läger transgena möss16.
- Använd en egen inbyggd bildsystem runt en stereomikroskopet15,17.
- Placera stereomikroskopet framför hjärtat och justera för skärpa.
- Excitera cAMP sensorn med en ljuskälla [e.g., Använd en enda våglängd light emitting diode (440 nm)]. Dela upp utsläpp ljus i givaren och acceptor kanaler med en stråldelare (för ett cyan fluorescerande protein/gul fluorescerande protein par, Använd en 565dcxr dichroic spegel och D480/30 och D535/40 utsläpp filter).
- Garantera en stabil temperatur genom att sätta en plastfolie runt kammaren.
- Ta bilder med en vetenskaplig complementary metal-oxide-semiconductor (sCMOS) kamera. Samordna ljuskälla och kamera bild fånga med en öppen källkod bildprogram såsom mikro-Manager.
- För att starta bild förvärv, Skjut den Multi-D Acq. knappen och Ställ in en time-lapse, som förvärvar en bild var 10 s, med lämplig exponeringstid, vilket beror på styrkan i fluorescerande signalen (cirka 100 ms).
- Använd den tidigare beskrivna och tillgängliga GRÄMA online och GRÄMA online 2 plugins17 att dela upp bilden i två kanaler, Välj Regionkommittén sevärdheter och övervaka baserat på spårning.
- Under förvärv, BEGJUTA hjärtat med modifierade Krebs-Henseleit lösningen som innehåller olika ämnen, beroende på experimentet.
- Vid slutet av experimentet, Stäng av förvärvet genom att trycka på stopp -knappen och spara i en bunt med bilder.
- Analysera de FRET data offline med en dedicerad mjukvara som kan dela upp bilderna i två identiska sektioner för givare och acceptor kanaler och kan utföra bandet analys i flera regioner-of-intresse.
Obs: En dedikerad plug-in (GRÄMA offline) behövs, som tillhandahålls i Sprenger o.a. 17.- Starta programvaran. Öppna analys genom att gå till Plugins -menyn, och klicka sedan på MicroManager, och sedan på Öppna Småpetaren fil.
- Kör GRÄMA offline plugin för att dela den time-lapse i två identiska bilder för de gemensamma fiskeripolitiken och YFP kanalerna.
- Använd verktyget Frihand val för att markera regionen intresset YFP bilden. Tryck på knappen Lägg till att lägga till valet i fönstret Multi .
- Välj region för intresse i fönstret Multi och tryck på Multi att få ett bord med grå medelvärden för varje bildruta och region. Kopiera och klistra in alla data i ett Excelark.
- Klicka på den gemensamma fiskeripolitiken bildstapel. Utföra samma åtgärder som i steg 6.10.4 för den gemensamma fiskeripolitiken-stacken och klistra in de grå medelvärdena i samma Excel-blad.
- Korrigera raw-data offline för genomlysningseffekten faktorn av givaren till acceptorn kanal17.
- Använd följande formel, där B är den genomlysningseffekten-faktorn:
Baserat på = (YFP - B x CFP) / GFP - Bestäm genomlysningseffekten faktorn B av imaging ett hjärta som uttrycker GFP endast och mäta andelen donator fluorescensen i YFP kanalen (B = YFP / CFP).
- Använd följande formel, där B är den genomlysningseffekten-faktorn:
7. Neuromorphology
Obs: Analysera intrakardiellt autonoma nervsystemet med hjälp av hela-mount immunostainings intakt murina hjärtan. Notera att majoriteten av intrakardiellt ganglierna är lokaliserade i epikardiell fettvävnaden nära pulmonell venerna.
- Använda olika färgningar för skildringen av neurofilament (allmänna neuronala strukturer, kyckling anti-NF-H, 1:3, 000), tyrosin hydroxylas (TH, sympatiska neuronala strukturer, kanin α TH, 1:1, 000), och kolin kolinacetyltransferas (ChAT, parasympatiska neuronala strukturer. geten α chatt, 1:50).
- Efter perfusionen i den av apparaten, fixa mus hjärtan i 10 mL formalin för 24 h och lagra dem i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ˚C.
- Bleach hjärtan i Dents blekmedel (4:1:1 metanol: väteperoxid lösning 30% (w/w) i H2O: dimetyl sulfoxid (DMSO)) för 1 vecka vid 4 ˚C och rehydrera dem därefter till PBS i en serie av fallande metanol i PBS (100%, 75%, 50%, 25%, 1 h varje) 18.
- Utföra de följande inkubationer i ett 24-brunn-platta format med en mild agitation vid 4 ˚C:
- Permeabilize hjärtan i 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) för 3 x 1 h i rumstemperatur innan du blockerar dem över natten i en blockerande buffert [5% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-T + 0,2% natriumazid].
- Späd antikropparna som följer: get α chatt (1:50), kanin α TH (1:1, 000), kyckling α neurofilament (1:3, 000); sekundära antikroppar för fluorescerande märkning (1: 500, eller enligt tillverkarens instruktioner); biotinylerade sekundära antikroppar kromogen märkning (1: 200, eller enligt tillverkarens instruktioner).
- Inkubera exemplaren i primära antikroppar utspätt i en blockerande buffert för 1 vecka vid 4 ˚C.
- Tvätta hjärtan för 3 x 15 min i PBS-T innan den sekundära antikroppar inkubationen i en blockerande buffert i 4 dagar.
- Tvätta hjärtan för 3 x 15 min i PBS-T och lagra dem i en monteringsmedium för fluorescerande färgning för 3 h i rumstemperatur eller Använd en avidinen-biotin komplexa upptäckt kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Preinkubera hjärtan för 1 h i en kommersiell buffert för 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB), innan utveckla dem under en visuell kontroll i en DAB-innehållande buffert enligt tillverkarens anvisningar.
- Lagra exemplaren i dubbel destillerat vatten.
- För paraffin avsnitt, torkar och bädda in hjärtan i paraffin.
- Skär 4 µm tjocka sektioner och deparaffinize dem enligt laboratoriets rutinförfaranden. Om och hur antigen retrieval behöver utföras måste fastställas för varje individuell inställning eftersom den beror på kombinationen antikropp.
- Permeabilize avsnitten för 10 min i 0,2% Triton X-100/Tris-buffrad koksaltlösning (TBS), följt av 3 x 5 min tvättar i TBS.
- Blockera dem med 3% BSA/TBS för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera dem över natten vid 4 ° c [primär antikroppar: get α chatt (1:50), kanin α TH (1: 500), kyckling α neurofilament (1:1, 000)] eller 2 h (fluorescens-märkt sekundära antikroppar, 1: 500) i rumstemperatur 1% BSA/TBS med 3 x 5 min tvättar TBS i mellan.
- Lägg till 1 µg/mL bisbenzimide H33342 trihydrochloride till sekundär antikropp lösning eller Använd en annan nukleär färgning metod.
- Montera bilder i en monteringsmedium för fluorescerande färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en bild av av installationen inklusive 2 multi elektrod matriser (åtgärder). Innan experimentet placeras intrakardiellt katetern nära kanylen att underlätta en snabb och enkel isättning i höger atrium/höger hjärtkammare och säkerställa en kort tid tills Jämviktstiden kan börja. Den nedre delen av kammaren kan vara förhöjd (se pilarna i figur 1) så att kammaren är helt stängd och garanterar en stabil temperatur.
Figur 2 visar olika representativa hjärt infärgning. I figur 2A en hematoxylin och eosin presenteras (H & E) färgning av en paraffin avsnitt. I den exemplariska utvidgningen (figur 2B) visar en immunhistokemisk färgning av ett förmaksflimmer ganglion huvudsakligen parasympatiska cellerna (röd, chatt-positiv) jämfört med mindre många sympatiska celler (grön, TH positiva). I figur 2 c-E skildrar en immunhistokemisk färgning av neurala (figur 2 c, grön, neurofilament) och sympatiska fibrer (figur 2D, röd, TH) samt en överlagring av de två bilderna (figur 2E) hur neurala fibrerna Travers från förmaken via koronar sinus mot bakre ventriklarna.
Figur 3 visar murint hjärtat ansluten till kanylen av av apparaten med en insatt octapolar kateter i höger förmak och höger kammare och en epikardiell multi elektrod array (MEA) placeras på den främre vänstra ventrikeln ( Figur 3A). Ventrikulär arytmi resistensbestämning via elektroderna i RV presenteras i figur 3B. Induktion av en ventrikulär takykardi i hjärtan inträffade oftare efter partiell förmaksflimmer denervering. I den utvidgade MEA (figur 3 c) presenteras Schematisk layout av elektroderna. Det är viktigt att säkerställa en stabil epikardiell kontakt av alla elektroder. I figur 3D avbildas offline-analyseras epikardiell överledning registreras av en MEA.
Figur 4 visar bandet mätningar i en hela hjärtat att vara retrogradely perfusion i den av apparaten. Olika delar av hjärtat kan analyseras som behövs (figur 4A). Såväl globala som lokala topisk användning av läkemedel är lätt möjligheten i denna setup (figur 4B).
Figur 1: av installationen inklusive multi elektrod matriser (MEAs). Octapolar stimulering och inspelning katetern placeras nära området där hjärtat kommer att bifogas. Den nedre delen av kammaren kommer att flyttas uppåt (vita pilar) efter hjärtat har kopplats till apparaten så att en stabil temperatur är säkerställd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hjärt hela mount infärgning som skildrar delar av det autonoma nervsystemet. A) skildring av en hjärt H & E-färgade paraffin avsnitt (skala bar 1 mm). B) en exemplarisk utvidgning av en immunohistochemically målat förmaksflimmer ganglion visar huvudsakligen parasympatiska cellerna (röd, chatt-positiv) jämfört med mindre många sympatiska celler (grön, TH-positiv; skala bar 75 µm). C-E) Representant immunhistokemiska färgningar av neurala (figur 2 c, grön, neurofilament, NF) och sympatiska fibrer (figur 2D, röd, TH, och deras överlägg i figur 2E) färdas från förmaken via koronar sinus (CS) mot den bakre ventriklarna. Exemplarisk fibrer är markerade med pilar. Asterisker beteckna förmaksflimmer ganglier. Skala bar 1 mm. LA, vänster förmak; LV, vänster kammare; NF, neurofilament; PV, pulmonell vener; RA, höger förmak; RAA, höger förmak bihang; RV, höger kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intra- och epikardiell mätningar med hjälp av setup. A. denna panel visar ett exempel på en murin hjärtat inom av systemet. Intrakardiellt octapolar katetern, som infogas i höger förmak och kammare och en epikardiell multi elektrod array (MEA) skildras. B. arytmi resistensbestämning använder burst stimulering utan (kontroll) eller med induktion av en själv avsluta ventrikulär takykardi [efter partiell förmaksflimmer denervering (PAD)] är avbildade. C. epikardiell MEA avbildas med en utvidgning av layouten Schematisk elektrod. D. vinkar förökning velocity analyserades med en skräddarsydd programvara. Avståndet mellan isochrones är 2 m/s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: FRET mätningar i en av setup. A. två differentcAMP biosensor fluorescens kanaler [gul fluorescerande protein (YFP) och cyan fluorescerande protein (GFP)] under bandet mätningar i en retrograd perfunderade hjärtat skildras. Om det behövs olika delar av hjärtat (t.ex., atria och ventrikeln) kan analyseras (skalstapeln: 1 mm). B. i denna panel visas ett representativt bandet experiment, som mäter cAMP-nivåerna under en farmakologisk stimulering i den förmak och vänster kammare. Hjärtat var först, systemiskt perfusion med viktreglerande cyclase aktivare NKH477, en forskolin analogon, att öka cAMP-nivåerna. Då var nikotin lokalt tillämpas och riktade till förmaksflimmer ganglier, som akut minskat cAMP-nivåerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript presenteras det välkända av ex vivo hjärtat perfusion systemet som ett verktyg för att studera effekterna av intrakardiellt nervceller på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis med hjälp av olika kartläggning och stimulering tekniker inklusive endokardiella och epikardiell strategier.
Flera delar av protokollet är avgörande för installationen. Först, är det viktigt att använda en förberedelse teknik där de förmaksflimmer fett kuddar bo intakt eller avlägsnas snabbt utan att skada hjärtmuskeln. Andra har en rätt storlek öppning skäras i höger förmak för en enkel isättning av octapolar katetern in i höger förmak och höger kammare. Katetern ska glida lätt i höger kammare utan att generera någon press. Under kvarstad på katetern till kanylen, bör katetern inte doppa djupare i ventrikeln, att undvika hjärt skada. Tredje, temperaturkontroll är en viktig del av alla av uppställningar1,2,5. Den termiska avdelningen är stängd under arytmi provning, att säkerställa en stabil temperatur. Men för MEA eller bandet recordings, kammaren behöver vara åtminstone delvis öppen och tillåter mätningar. Inspelningstid bör hållas till ett minimum eller andra tekniker för att minska värmeförlust, som att sätta en plastfolie runt kammaren vid längre mätningar ska utföras. Fjärde, MEAs bör placeras på samma anatomiska platser i alla experiment. God kontakt, vilket bekräftas av stora amplituder i realtid analysen, kan uppnås genom att använda två MEAs på motsatt platser så att en motvikt produceras. Det femte påverkas bandet mätningar av rörelse. För att minska spontan rörelse, är hjärtat tempo på en stabil frekvens av intrakardiellt katetern. För ytterligare stabilisering, kan en tub med en liten vakuum stabilisera apexen.
En fördel med av systemet är att hjärtan kan användas senare för immunohistological bedömningar av hjärt nervsystemet. Kontinuerlig perfusionen tar bort de flesta röda blodkroppar som har en hög nivå av autofluorescens19, förbättra kvaliteten på färgning. Efter formalin fixering, kan hjärtan förvaras i en temperatur kontrollerad (4 ˚C) miljö i fosfatbuffrad koksaltlösning för upp till ett år utan märkbara förändringar i färgning kvalitet.
Den viktigaste funktionen av denna inställning är att alla mätningar utförs i ett centralt denervated hjärta. De huvudsakligen parasympatiska förmaksflimmer intrakardiellt ganglierna är den sista relän posterar inom hjärta20 som den sympatiska ganglion stellatum ligger intrathoracically och tas därför bort under beredning. Även om intrakardiellt nervceller får ingen central inmatning, har det visat att de är fortfarande aktiva på ett fysiologiskt sätt som ljusaktivering av hjärtats sympatiska nerver ökar hjärtfrekvensen och hjärt kontraktila kraft21. I linje med dessa fynd stöder den funktionella betydelsen av intrakardiellt nervceller i centralt denervated hjärtat, visat vi nyligen deras inverkan på kammarfunktion och arrhythmogenesis15.
En fördel med denna centralt denervated inställning är att det tillåter forskare att studera kommunikationen mellan olika intrakardiellt regionala neurala nätverk (t.ex., samspelet mellan förmak och kammare)15. Dessa skillnader kan vara relevanta för patienter efter hjärttransplantation hos vilka behandling med den selektiva sinusknutan modulator ivabradin förbättrar överlevnad, jämfört med behandling med enbart betablockerare metoprolol succinat22. I ett framtida steg direkt elektrisk stimulering av parasympatiska (vagusnerven) eller sympatiska strukturer (Ggl. stellatum23) kommer för att förbättra vår kunskap om samspelet mellan den extra- och intrakardiellt autonoma nervsystemet.
Det är viktigt att komma ihåg det parasympatiska och sympatiska fibrer är mestadels Co lokaliserade så att nuvarande behandlingar som kateter ablation av förmaksflimmer eller kammarflimmer kommer oundvikligen att ändra båda strukturer. I den här beskrivna setup, kan lokala farmaceutiska modifiering av riktade strukturer (t.ex., specifika stimulering av parasympatiska ganglier) studeras. Förutom riktade ändringar är globala perfusion med olika läkemedel (t.ex. betablockerare) lätt möjligheten, så att eventuella proarytmiska eller antiarytmiska egenskaper hos olika agenter kan studeras. Med denna setup, kan interventioner och olika tekniker testas under stimulering eller hämning av olika delar av intrakardiellt autonoma nervsystemet, avslöja information av specifika delar av det autonoma nervsystemet inverkan på hjärtfunktion och arrhythmogenesis. Murina inställningen tillåter vidare studera hjärtats autonoma nervsystemet i påstår av sjukdom som hjärtinfarkt, hjärtsvikt eller diabetes.
Sammanfattningsvis, enkla och välkända av ex vivo hjärtat perfusion systemet ger en flexibel grund för att ändra och undersöka effekterna av intrakardiellt nervceller på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Hartwig Wieboldt för hans utmärkta tekniskt bistånd, och UKE mikroskopi Imaging Facility (Umif) av den University Medical Center Hamburg-Eppendorf för Mikroskop och stöd. Denna forskning var finansierade av Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. och av DZHK (tyska centrum för kardiovaskulär forskning) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
