Summary
Здесь мы представляем organotypic культивирование протокол вырастить эмбриональные куриные органов в пробирке. С помощью этого метода, развитие эмбриона курицы ткани могут быть изучены, сохраняя при этом высокую степень контроля над окружающей среде культуры.
Abstract
Эмбриональные куриные обычно используется как организм надежная модель для развития позвоночных. Его доступность и короткий инкубационный период делает его идеально подходит для экспериментов. В настоящее время изучение этих путей развития в куриного эмбриона проводится путем применения ингибиторов и наркотики на локализованных участках и при низких концентрациях, с использованием различных методов. В vitro культивирования тканей — это метод, который позволяет исследование тканей, отделены от организм хозяина, минуя одновременно многих физических ограничений при работе с весь эмбрионов, например восприимчивость эмбрионов высокие дозы потенциально смертоносных химических веществ. Здесь мы представляем organotypic протокол для культивирования эмбриональные куриные половины головы в пробирке, который открывает новые возможности для изучения процессов развития за пределами в настоящее время установленных методов культивирования.
Introduction
Эмбриональные куриные (Gallus gallus) является организма отличную модель широко используется в области биологии. Ее инкубационный период составляет около 21 дней, и много яиц может быть инкубировали одновременно, делая эксперименты быстро и эффективно. Возможно самое главное, эмбрион также легко манипулировать, позволяя обширное исследование из ключевых процессов развития и генов и белков, которые управляют эти процессы.
Эмбриональные куриные глаз это сложный орган, который развивается через взаимодействия целого ряда различных тканях похож на многих других систем организма. Этот метод позволяет исследование развития этих тканей, особенно на поздних стадиях развития. К примеру многослойные сетчатки может быть особый интерес для тех, кто изучает развитие нервной системы. Альтернативные методы, позволяющие изучение других тканей глаза, такие как роговицы, тело vitreal, объектив, склера и веки пользу исследователей. Глаз эмбриональные куриные также содержит ряд плоских костей, склеры косточки, которые могут быть использованы в качестве модели для изучения intramembranous кости индукции и окостенения в позвоночных1.
В настоящее время существует целый ряд методов, используемых для изучения эмбрионального развития. Микроинъекции ингибирующее антител или других ингибирующее молекулы2,3, хирургически имплантированных микрошарики, пропитанной ингибитор4, и электропорации5 все методы, которые могут быть использованы для помощью генов или протеинов интереса в эмбрион. Подобные методы используются для upregulate белков. Эти методы не являются без их ограничения. Например, при использовании химических веществ изменять эмбрионального развития, должны быть оценены смертоносное воздействие на эмбрион, и это ограничивает использование вышеупомянутых методов локализованные сайты применения при дозах достаточно низким для обеспечения живучести эмбриона.
В vitro культивирования тканей используется в широком диапазоне организмов для изучения развития и может использоваться для обхода некоторых из вышеуказанных ограничений. К примеру бедрах6, перо бутоны7,8и9 конечностей курица все были изучены с помощью ткани, культивирование методы, как яичках мыши10 и корни и стебли растений11. Эти методы предоставляют ученые высокую степень контроля над развитием ткани, такие как способность к колебаниям температуры и изменять доступность питательных веществ. Изоляции ткани от всей эмбрионов также делает его гораздо меньше подвержены смертоносного воздействия химических веществ, таким образом позволяя манипуляции исследований в глобальном масштабе в более высоких концентрациях. Другим заметным преимуществом в vitro культивирование является сохранение ткани клеточной среды; расположение тканей остается относительно неизменным, что делает его возможным изучение взаимодействия между различными ткани типы9. Таким образом, в пробирке культивирования открывает двери для дополнительных экспериментальных подходов не доступны в естественных условиях или в ovo модели.
В настоящее время изучение развития эмбриона курицы глаза с помощью химических веществ является особенно сложным. Количество extraembryonic мембраны покрытия эмбриона, что делает его трудно применять микрошарики или химических веществ; эмбрион также очень активны в яйцо, как он становится старше, еще более усложняют метод уже трудно. Этот протокол позволяет легкий доступ для глаз и окружающих тканей, устранение этих барьеров, а также предоставляет новые возможности для изучения процессов развития в глаза. Этот протокол был создан для изучения индукции склеры косточки внутри эмбриона глаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: На стадии эмбриона, используйте гамбургер и Гамильтон12 (HH) Промежуточная таблица.
1. эмбриона инкубации
- Инкубируйте яйца оплодотворенные куриные в инкубатор стерильные, контролем температуры при 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности.
- Поверните яйца 1 x в день и позволяют им инкубировать в HH34 (8 дней после оплодотворения).
2. Подготовка и стерилизации материалов
- Для 12 эмбрионов, автоклав, 2 Л дистиллированной воды, 1 Л 0,85% куриных физраствора, 12 стеклянной пипетки, 1 коробка бумажных салфеток, 24 2,5 х 2,5 см квадратов полу пористой фильтровальной бумаги и 24 2,5 х 2,5 см площадей стальной проволоки сетки с краями загнутыми вниз. Для стерилизации материалов, автоклав их при температуре 121 ° C по меньшей мере 15 мин.
Примечание: Автоклавирование материалов можно сделать заранее. - Стерилизуйте инкубатор с 70% этанола, вытирая стороны, полки и дверцы. Место 2 пластиковые контейнеры, содержащие газобетона дистиллированной воды внутри инкубатор для поддержания влажности. Prewarm инкубатор культуры до 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности. Убедитесь, что инкубатор полностью темно; Если дверь является прозрачным, накройте фольги.
- Prewarm 100 мл питательной среды и 1 мл пенициллина, помещая их в инкубатор культуры.
- Обложка области с бумажным полотенцем и стерилизовать скамейке путем распыления с 70% этиловом спирте. Стерилизуйте 2 пары щипцы, Рассечение ножницами, лезвием бритвы и пластиковой ложкой с 70% этанола в подобной манере.
- Петри стерильные 100 мм место 12 и 24 Петри стерильные 35 мм на скамейке для использования. Убедитесь, что блюда остаются в стерильный пакет до использования.
3. эмбриона подготовка
Примечание: С этого момента, носите маски защитные пыли во избежание загрязнения культур. Бактериальной или грибковой инфекции будет уничтожить культуру, и существует опасность его распространения быстро для всех культур в инкубаторе.
- Трещина открыть яйцо и переноса эмбриона в чашке Петри 100 мм, содержащие 0,85% куриных физиологического раствора. Стадии эмбриона в соответствии с анатомическими особенностями описанные в гамбургер и Гамильтон, постановка рекомендации12 и подтвердить эмбрион находится HH34.
- Вырезать шею и затем пополам голова эмбриона на средней линии с использованием стерилизованные лезвия бритвы. С помощью стерильный пинцет, удалите мозга. Клюв оставьте нетронутыми.
4. Культура установки
- 2 место из 35 мм Петри внутри одной чашке Петри 100 мм.
- Поместите сетку стальной проволоки внутри каждой чашке Петри 35 мм.
- С помощью щипцов, передать 1 глав пополам кусок 2,5 x 2,5 см, полу пористой фильтровальной бумаги с глаз вверх. Обеспечить ткани является безопасным и не соскользнуть, слегка наклоняя его.
- С помощью щипцов, тщательно место тканей глаза и фильтровальную бумагу поверх сетки стальной проволоки в 1 35 мм Петри, создавая поднял этап с тканей глаза на вершине.
- Повторите шаги с 4.3 и 4.4 с другими половину головы.
- Тщательно с помощью стерильной стеклянной пипетки, добавьте питательной среды непосредственно в каждой чашке Петри 35 мм, пока он не достигнет уровня фильтр-бумаги. Не погружайте половину головы в питательной среде.
- Добавьте 50 мкл 10 000 ед/мл пенициллин стрептомицином питательной среды в каждой чашке Петри.
- Сложите кусок оберточной бумаги в небольшой площади и поместите его в 100 мм Петри. Смачивают газобетона дистиллированной водой.
- Место культуры блюдо в стерильной, темные инкубатора при 37 ° C ± 1 ° C и ~ 40% влажности до 4 дней.
- Повторите шаги 3 и 4 для каждого эмбриона.
Примечание: Количество эмбрионов необходимо будет зависеть от конкретного эксперимента; Здесь мы описываем протокол для 12 эмбрионов.
5. Культура обслуживания
- Один раз в день пополните пластиковые контейнеры в инкубаторе свежий, газобетона дистиллированной водой.
- Ежедневно проверяйте всех культур для бактериальной или грибковой инфекции. Инфицированы культур, распались или в котором среды изменил цвет. Отмена всех культур, которые заражены.
6. Фиксация
- После культивирования, удалите все блюда из инкубатора.
- Используя пару щипцов, аккуратно удалите глаз из фильтровальной бумаги, стараясь не рвать ткань.
- Исправьте тканей глаза в параформальдегида 4% в 1 x фосфат амортизированное saline на ночь при 4 ° C или в нейтральных амортизированное формалина 10% на ночь при комнатной температуре.
- Магазин ткани на 4 ° C в 1 x фосфат амортизированное saline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью этого метода, эмбриональные куриные глаз может культивированный от 8 день его развития (HH34) в vitro на 4 дня. Четыре дня в ovo развития соответствует HH38.
Этот метод культивирования поддерживает развитие бутонов перо вокруг глаз и на веках (рис. 1B). Эти перья почки не являются настоящей в ovo в HH34 до культивирования (рис. 1а), указав, что перо бутон развития инициируется культивирования период, как это в ovo13 (рис. 1 c). Веки и мембраны мигательная расти для покрытия глаза во время культивирования (рис. 1B). Веки появляются более зрелой после в vitro культивирования чем в начале культивирования в HH34 (рис. 1A), но менее развито, чем в HH38 (рис. 1 c). Эти данные показывают, что поддерживаются ключевые аспекты эмбрионального развития, хотя и с небольшой задержкой.
После культивирования, мы анализировали переднюю часть глаза, чтобы показать конъюнктивы сосочки (переходных кольцо эпителиальных выступы 13-14), которые действуют как еще один ориентир, указав, что развития событий поддерживаются в культуре. Как правило, эти сосочки полностью формируются HH34 (рис. 1 d) и дегенеративного с течением времени, как они вызывают skeletogenic конденсации в базовом Мезенхима; они исчезают на HH381 (Рисунок 1F). Наши данные показывают, что эта дегенерация происходит в пробирке (Рисунок 1E) и предшествует уплощение сосочков после в ovo модели развития. Безупречная конденсации, однако, не видны в образцах, в пробирке , в отличие от в HH38 (Рисунок 1F). Мы использовали окрашивание, щелочной фосфатазы, который обнаруживает ранняя активность остеобластов для дальнейшей оценки индукции этих конденсации14; Этот процесс происходит наряду с дегенерация конъюнктивы сосочков в ovo. Индукции skeletogenic конденсации, который начинается в HH34 (рис. 1 g), приступить в пробирке , что подтверждается щелочной фосфатазы, окрашивание (рис. 1 H). Эти конденсации, однако, не как большой как они находятся на HH3814 (Рисунок 1I), снова означает, что есть небольшая задержка в развитии. Мы оцениваем что 4 дней культивирования представляют примерно 2 дня эмбрионального развития; Поэтому задержка около 50%. Коллективно эти результаты показывают, что индукция и развитие intramembranous костей, склеры конденсации, является поддерживаемой в пробирке и процессов развития, таких как веко роста и формирования бутона перо продолжить в in vitro.
Рисунок 1 . Морфологические характеристики в пробирке искусственного глаза, глаза HH34 и HH38 глаза. A - F безупречный и G - я витражи для фермента щелочной фосфатазы (AP) различать активные остеобластов в пределах склеры конденсации. A, Dи G шоу глаза в начале периода культивирования на HH34. B, Eи H Показать глаз после 4 дней в vitro культивирования. C, Fи Показать глаз после 4 дней в ovo культивирования, в HH38. Все глаза находятся сбоку. (A) конъюнктивы сосочки являются видимыми в кольцо вокруг роговицы. Звездочка указывает сосочка #12, первая форма. Стрелка указывает край века в носовой части глаза. (B) конъюнктивы сосочков плоский и начинают вырождаться. Стрелка указывает на растущую перо бутон. (C) конъюнктивы сосочков полностью вырождается и покрыты веки и мигательная мембраны. Открытый стрелка указывает край века в носовой части глаза. Твердых стрелка указывает на растущую перо бутон. (D) A расчлененных передней части глаза HH34. Звездочка указывает сосочка #12. (E) A расчлененный передняя часть HH34 + 4 в vitro глаз показаны сглаженные сосочки. Сосочки в височной области (твердых стрелка) начали вырождается; Это старейший сосочков на ринге. (F) A расчлененных передняя часть HH38 глаз с веки и мигательная мембраны удалены, показаны, что все сосочки выродились. Пунктирные линии изложить позицию двух прилегающих неокрашенных конденсации. (G) HH34 глаз витражи для AP показаны очень маленькие skeletogenic конденсации свидетельствует о начала индукции. A HH34 (H) + 4 глаз витражи для AP показаны расширенного, растет skeletogenic конденсации. (я) HH38 глаз витражи для AP показаны большие skeletogenic конденсации. Все бары масштаба являются 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол использует установленные ткани, культивирование методы для достижения роста, курица глаза от эмбриональных день 8 (HH34) в vitro на 4 дня. Этот метод культивирования сетки первоначально был описан Trowell15. Мы оптимизировали протокол от Пинто и холл в 1991 исследование16 используя полу пористые мембраны с сеткой для изучения индуктивный сигналов между слоями разделенных тканей эмбриона курицы глаз15. С помощью этого метода, плотва культивировали 14 - дневных куриные бедра6. Также этот метод доказал свою эффективность в культивировании мыши тканей6,17. Использование фильтра бумаги решающее значение для успеха протокола, как это помогает ткани принимать питательные вещества от среднего эффективно без насыщения или submersing ткани.
Питательная среда в надлежащего рН имеет решающее значение для оптимального роста. Средство должно быть на или вблизи физиологических рН и использование фенола красного в среде как индикатор дает преимущество в том, что могут быть легко обнаружены изменения рН. Сыворотка свободных средств массовой информации могут быть использованы, и меняется ежедневно средства массовой информации не является необходимым и не влияет на результаты. Протокол был разработан с использованием имеющегося среднего (см. Таблицу материалы), который содержит высокий уровень аминокислот и глюкозы; необходимо без дальнейших добавок СМИ. Большинство случаев роста бедных тканей, используя этот Протокол произошел, когда питательных средах либо ненадлежащего рН или загрязненных ими.
Глаз может выжить и развиваться для до 4 дней в пробирке, начиная эмбриональных день 8, когда протокол выполняется при оптимальных условиях. Одно ограничение этого протокола является, что живучести влияние за пределы 4 дней культивирования. Таким образом процессы развития, которые охватывают более длинный интервал потребует изменений к протоколу. Еще одно ограничение протокола является отсутствие активного кровотока и васкуляризация. Кровеносные сосуды имеют важное значение для многих процессов развития, не только для доставки питательных веществ в ткани9, который достигается в пробирке через капиллярность через фильтровальную бумагу, на которой зиждется ткани.
Этот протокол может использоваться для изучения развития всего органов или большие куски ткани в пробирке. Позвоночных органы являются весьма сложными, и их развитие регулируется многих различных пространственно-временных структур. Изучение этих путей развития опирается на способность манипулировать сигналами, которые регулируют их. Нынешние методы ограничения этой манипуляции сравнительно небольших, локальных областей и достаточно низкой концентрации во избежание эмбриональных летальность. Например, метод ex ovo культивирования весь куриного эмбриона культуры18 или метод для окна яйца19 проводить манипуляции ограничены в том, что либо весь эмбрион должен рассматриваться, который может вызвать летальность, или только малые локализованной области рассматривается. Преимущество протокола, представленные здесь заключается, что эффект этих сигналов могут изучаться на весь органов или большое количество ткани, не затрагивая эмбриональных жизнеспособность. Этот протокол не требует каких-либо добавок с углекислым газом, как и ранее протоколов15. Задержка в развитии, которое мы наблюдали является преимуществом в том, что быстрого развития процессов могут быть изучены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели поблагодарить Грегори Халлер (Маунт Сент Винсент университет) за его предварительную работу по разработке протокола. Авторы хотели бы также поблагодарить Николас Джонс (Университет Маунт Сент-Винсент) для его технического опыта и помощи с съемок и производства аудио визуальной части рукописи. Дэниэл Эндрюс был поддержан финансирование от МСВУ и естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) через награду исследования студент бакалавриата. Тамара а. Франц-Odendaal поддерживается грантом Сенти обнаружения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
