Her presenterer vi en organotypic dyrking protokollen å vokse embryonale kylling organer i vitro. Bruker denne metoden, kan utviklingen av embryonale kylling vev studeres, samtidig opprettholde en høy grad av kontroll over kultur miljøet.
Embryonale kylling er ofte brukt som en pålitelig modell organisme for virveldyrenes utvikling. Sin tilgjengelighet og kort inkubering gjør periode det ideelt for eksperimentering. Foreløpig er studiet av disse utviklingsmessige stier i kylling embryoet utført ved å bruke hemmere og narkotika lokaliserte områder og lave konsentrasjoner bruker en rekke metoder. In vitro vev dyrking er en teknikk som muliggjør studiet av vev atskilt fra verten organisme, mens samtidig omgåelsen mange av fysiske begrensninger når arbeider med hele embryoer, som mottakelighet av embryo til høye doser av potensielt dødelig kjemikalier. Her presenterer vi en organotypic dyrking protokoll for dyrking av embryonale chicken halv hodet i vitro, som presenterer nye muligheter for undersøkelse av utviklingsprosesser utover metodene er etablert.
Embryonale kylling (Gallus gallus) er en utmerket modell organisme brukte innen biologi. Inkubasjonstiden er omtrent 21 dager og mange egg kan være inkubert samtidig gjør eksperimentering raskt og effektivt. Kanskje viktigst, embryoet også enkelt endres, slik at den omfattende undersøkelsen av viktige utviklingsprosesser og gener og proteiner som driver disse prosessene.
Embryonale kylling øyet er en komplisert organ som utvikler via samspillet av en rekke forskjellige vev lik for mange andre kroppens systemer. Denne metoden muliggjør studiet av utviklingen av disse vev, særlig i avanserte stadier av utviklingen. For eksempel kan flerlags netthinnen være av spesiell interesse for de som studerer utvikling av nervesystemet. Alternative metoder som muliggjør studiet av andre øye vev som hornhinnen, vitreal kroppen, linsen, sclera og øyelokkene er til nytte for forskere. Kylling embryonale øyet inneholder også en rekke flate bein, Innbukking ossicles, som kan brukes som modell for studiet av intramembranous bein induksjon og forbening i virveldyr1.
Foreløpig er det en rekke metoder for å studere embryonale utvikling. Microinjections hemmende antistoffer eller andre hemmende molekyler2,3, implantert kirurgisk microbeads dynket i hemmer4og electroporation5 er alle metoder som kan brukes til å downregulate gener eller proteiner av interesse i et embryo. Lignende metoder brukes upregulate proteiner. Disse metodene er ikke uten sine begrensninger. For eksempel når du bruker kjemikalier endre embryonale utviklingen, dødelige effekten på fosteret må vurderes, og dette begrenser bruken av de nevnte metodene lokaliserte områder av programmet ved doser lav nok til å sikre survivability av den fosteret.
In vitro vev dyrking er brukt i en rekke organismer for å studere utviklingen og kan brukes til å omgå noen av nevnte begrensningene. For eksempel har i femora6, fjær knopper7,8og lemmer9 av kylling alle blitt studert ved hjelp av vev dyrking metoder, som har prøvene av musen10 og røtter og stengler planter11. Disse metodene gi forskerne en høy grad av kontroll over den vev utviklingen, svinger temperaturen og endre næringsstoffer tilgjengeligheten. Isolasjon av vev fra hele fosteret gjør det også langt mindre utsatt for dødelige virkningen av kjemikalier, dermed muliggjør manipulasjon studier på en global skala på høyere konsentrasjoner. En annen betydelig fordel av i vitro dyrking er bevaring av vevets mobilnettet miljø; ordningen av vev forblir relativt uendret, gjør det mulig å studere interaksjonen mellom ulike vev typer9. Dermed tilnærminger i vitro dyrking åpner dørene til flere eksperimentelle ikke tilgjengelig i vivo eller ovo modeller.
For tiden er studerer utviklingen av embryonale kylling øyet bruker kjemikalier spesielt utfordrende. En rekke extraembryonic membraner dekke embryoet, gjør det vanskelig å bruke microbeads eller kjemikalier; fosteret er også svært aktiv i egg som det blir eldre, ytterligere kompliserende en allerede vanskelig metode. Denne protokollen gir enkel tilgang til øyet og dens omkringliggende vev, eliminere disse barrierene, gir nye muligheter til å undersøke utviklingsprosesser i øyet. Denne protokollen ble etablert for å studere induksjon av Innbukking ossicles i embryonale øyet.
Denne protokollen gjør bruk av etablerte vev dyrking teknikker for å oppnå vekst av en kylling øye fra embryonale dag 8 (HH34) i vitro for 4 dager. Denne rutenett-dyrking metoden ble opprinnelig beskrevet av Trowell15. Vi har optimalisert en protokoll fra Pinto og Hall 1991 studien16 utnytte en semi porøs membran med rutenett å studere induktiv signaler mellom separerte vev lag av embryonale kylling øye15. Bruker denne metoden, kultiv…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) for sitt innledende arbeid i utviklingen av protokollen. Forfatterne vil også takke Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) for sin tekniske ekspertise og assistanse med filming og produksjon av audiovisuelle delen av manuskriptet. Daniel Andrews ble støttet av finansiering fra MSVU og naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC) via en lavere Student forskning prisen. Tamara A. Franz-Odendaal støttes av en NSERC funn tilskudd.
35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
forceps | FST | n/a | fine forceps |
chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
paper towel | n/a | n/a | store-bought |