Summary
यहां, हम एक organotypic संवर्धन प्रोटोकॉल मौजूद इन विट्रो में भ्रूण चिकन अंगों को विकसित करने के लिए । इस विधि का उपयोग, भ्रूण चिकन ऊतक के विकास का अध्ययन किया जा सकता है, जबकि संस्कृति पर्यावरण पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री को बनाए रखने.
Abstract
भ्रूण चिकन सामांयतः हड्डीवाला विकास के लिए एक विश्वसनीय मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसकी पहुंच और लघु गर्मी अवधि यह प्रयोग के लिए आदर्श बनाता है । वर्तमान में, चिकन भ्रूण में इन विकासात्मक रास्ते का अध्ययन स्थानीयकृत साइटों पर अवरोधकों और दवाओं को लागू करने और कम तरीकों की एक किस्म का उपयोग सांद्रता द्वारा आयोजित किया जाता है । इन विट्रो टिशू संवर्धन में एक तकनीक है कि मेजबान जीव से अलग ऊतकों के अध्ययन में सक्षम बनाता है, जबकि एक साथ शारीरिक सीमाओं के कई वर्तमान को दरकिनार जब पूरे भ्रूण के साथ काम करने के लिए, जैसे भ्रूण की संवेदनशीलता के रूप में संभावित घातक रसायनों की उच्च खुराक । यहां, हम संवर्धन के लिए एक organotypic संवर्धन प्रोटोकॉल मौजूद भ्रूण चिकन आधा सिर इन विट्रो, जो वर्तमान में स्थापित तरीकों से परे विकासात्मक प्रक्रियाओं की परीक्षा के लिए नए अवसर प्रस्तुत करता है ।
Introduction
भ्रूण चिकन (गैलस गैलस) एक उत्कृष्ट मॉडल सामांयतः जीव विज्ञान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया जीव है । इसकी मशीन अवधि लगभग 21 दिन है और कई अंडे एक साथ किया जा सकता है, प्रयोग त्वरित और कुशल बनाने । शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, भ्रूण भी आसानी से हेरफेर है, प्रमुख विकासात्मक प्रक्रियाओं और जीन और प्रोटीन है कि इन प्रक्रियाओं ड्राइव के व्यापक अध्ययन को सक्षम करने से ।
भ्रूण चिकन आंख कई अन्य शरीर प्रणालियों के समान विभिन्न ऊतकों की एक संख्या की बातचीत के माध्यम से विकसित करता है कि एक जटिल अंग है । इस विधि से इन ऊतकों के विकास का अध्ययन, विशेष रूप से विकास के उन्नत चरणों में सक्षम बनाता है । उदाहरण के लिए, बहु स्तरित रेटिना तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने वालों के लिए विशेष रुचि का हो सकता है. वैकल्पिक तरीकों कि कॉर्निया के रूप में अंय नेत्र ऊतकों के अध्ययन को सक्षम, vitreal शरीर, लेंस, श्वेतपटल, और पलकें शोधकर्ताओं को लाभ के हैं । चिकन भ्रूण आंख भी फ्लैट हड्डियों की एक श्रृंखला, scleral ossicles, जो intramembranous हड्डी प्रेरण और रीढ़1में हड्डी बन जाना के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल हैं ।
वर्तमान में, वहां भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक संख्या हैं । निरोधात्मक एंटीबॉडी या अंय निरोधात्मक अणुओं के Microinjections2,3, शल्य चिकित्सा में प्रत्यारोपित microbeads में भीगे4, और electroporation5 सभी तरीकों कि जीन downregulate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक भ्रूण में ब्याज की प्रोटीन । इसी तरह के तरीके प्रोटीन को विनियमित करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये विधियां उनकी सीमाओं के बिना नहीं हैं । उदाहरण के लिए, जब रसायनों का उपयोग भ्रूण के विकास को बदलने के लिए, पर घातक प्रभाव का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और इस aforementioned तरीकों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त मात्रा कम खुराक पर आवेदन के स्थानीयकृत साइटों को सीमित भ्रूण.
इन विट्रो टिशू संवर्धन में विकास का अध्ययन करने के लिए जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है और aforementioned सीमाओं के कुछ बाईपास करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, femora6, पंख कलियों7,8, और चिकन के9 अंगों सभी ऊतक संवर्धन तरीकों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, के रूप में माउस का परीक्षण किया है10 और जड़ों और पौधों11के उपजा है । इन तरीकों वैज्ञानिकों के ऊतकों के विकास पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री प्रदान करते हैं, इस तरह के तापमान में उतार चढ़ाव और पोषक तत्वों की उपलब्धता में परिवर्तन करने की क्षमता के रूप में । पूरे भ्रूण से ऊतक के अलगाव भी यह अब तक कम रसायनों के घातक प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है, इस प्रकार उच्च सांद्रता पर एक वैश्विक स्तर पर हेरफेर अध्ययन को सक्षम करने । इन विट्रो संवर्धन का एक अंय उल्लेखनीय लाभ ऊतक सेलुलर पर्यावरण का संरक्षण है; ऊतकों की व्यवस्था अपेक्षाकृत अपरिवर्तित बनी हुई है, यह विभिन्न प्रकार के ऊतक9के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव बना. इस प्रकार, इन विट्रो संवर्धन में vivo या ovo मॉडल में उपलब्ध नहीं अतिरिक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए दरवाजे खोलता है ।
वर्तमान में, भ्रूण चिकन आंख के विकास का अध्ययन रसायनों का उपयोग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । extraembryonic झिल्ली के एक नंबर भ्रूण को कवर, यह microbeads या रसायनों को लागू करने के लिए मुश्किल बना; भ्रूण भी अंडे के भीतर बहुत सक्रिय है के रूप में यह बड़ा हो जाता है, आगे एक पहले से ही कठिन विधि उलझी । इस प्रोटोकॉल आंख और उसके आसपास के ऊतकों के लिए आसान पहुंच सक्षम बनाता है, इन बाधाओं को नष्ट करने, जबकि भी नए अवसर प्रदान करने के लिए आंख के भीतर विकासात्मक प्रक्रियाओं की जांच । इस प्रोटोकॉल भ्रूण आंख के भीतर scleral ossicles की प्रेरण अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: भ्रूण चरणों के लिए, नाश्ते का उपयोग और हैमिल्टन12 (एचएच) स्टेजिंग तालिका ।
1. भ्रूण की मशीन
- ३७ ° c ± 1 डिग्री सेल्सियस और ~ ४०% आर्द्रता पर एक बाँझ, तापमान नियंत्रित मशीन में अंडे निषेचित चिकन अंडों ।
- प्रति दिन अंडे 1x बारी और उंहें HH34 (8 दिनों के बाद निषेचन) के लिए गर्मी की अनुमति ।
2. सामग्री की तैयारी एवं बंध्याकरण
- 12 भ्रूण के लिए, आसुत जल के आटोक्लेव 2 L, 1 एल के ०.८५% चिकी खारा, 12 ग्लास पिपेट, कागज ऊतक के 1 बॉक्स, 24 २.५ सेमी x २.५ सेमी-छिद्रित फिल्टर कागज के चौकों, और 24 २.५ सेमी x २.५ सेमी इस्पात तार के चौकों के किनारों के साथ नीचे घुमावदार । सामग्रियों को निष्फल करने के लिए, उंहें कम से आटोक्लेव 15 मिनट के लिए १२१ ° c पर रखें ।
नोट: सामग्रियों का autoclaving एडवांस में किया जा सकता है । - पक्ष, अलमारियों पोंछते, और दरवाजे से ७०% इथेनॉल के साथ मशीन निष्फल । जगह 2 प्लास्टिक मशीन के अंदर आसुत पानी autoclaved युक्त कंटेनर नमी बनाए रखने के लिए । ३७ ° c ± 1 ° c और ~ ४०% आर्द्रता के लिए संस्कृति मशीन गर्म । सुनिश्चित करें कि मशीन पूरी तरह से अंधेरा है; यदि दरवाजा पारदर्शी है, यह टिनफॉईल के साथ कवर ।
- पोषक तत्व मध्यम और उंहें संस्कृति मशीन में रखकर पेनिसिलिन की 1 मिलीलीटर की गर्म १०० मिलीलीटर ।
- एक कागज तौलिया के साथ कार्यक्षेत्र को कवर और यह ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा बेंच निष्फल । संदंश, विच्छेदन कैंची, एक उस्तरा ब्लेड, और एक समान तरीके से ७०% इथेनॉल के साथ एक प्लास्टिक चंमच के 2 जोड़े निष्फल ।
- स्थान 12 बाँझ १०० मिमी पेट्री व्यंजन और 24 बाँझ ३५ मिमी पेट्री व्यंजन उपयोग के लिए बेंच पर. सुनिश्चित करें कि व्यंजन उपयोग तक बाँझ बैग में रहते हैं ।
3. भ्रूण की तैयारी
नोट: इस बिंदु के बाद से, संस्कृतियों दूषित से बचने के लिए एक सुरक्षात्मक धूल चेहरा मुखौटा पहनते हैं । एक जीवाणु या कवक संक्रमण संस्कृति को बर्बाद कर देगा और वहां के एक जोखिम यह मशीन में सभी संस्कृतियों को जल्दी फैल रहा है ।
- क्रैक अंडा खुला और एक १०० mm पेट्री ०.८५% लड़की खारा युक्त पकवान को भ्रूण हस्तांतरण । शारीरिक विशेषता हैमबर्गर और हैमिल्टन12 दिशा निर्देशों स्टेजिंग और पुष्टि भ्रूण में वर्णित के अनुसार भ्रूण HH34 पर है ।
- गर्दन काट और फिर एक निष्फल उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर midline में भ्रूण के सिर bisect । बाँझ संदंश का उपयोग, मस्तिष्क को दूर. चोंच को ज्यों का त्यों छोड़ दें.
4. कल्चर सेटअप
- १ १०० mm पेट्री डिश के अंदर ३५ mm पेट्री डिश के 2 प्लेस ।
- प्रत्येक ३५ mm पेट्री डिश के अंदर एक स्टील वायर मेष प्लेस ।
- संदंश का उपयोग करना, bisected सिर के 1 स्थानांतरण २.५ सेमी x २.५ सेमी के एक टुकड़े करने के लिए ऊपर का सामना करना पड़ आंख के साथ अर्द्ध-असुरक्षित फिल्टर कागज । सुनिश्चित करें कि ऊतक सुरक्षित है और इसे थोड़ा झुका द्वारा पर्ची नहीं है ।
- संदंश का प्रयोग, ध्यान से आंख के ऊतकों और ३५ mm पेट्री व्यंजन के 1 में इस्पात तार जाल के शीर्ष पर फिल्टर कागज जगह, शीर्ष पर आंख के ऊतकों के साथ एक उठाया मंच बनाने ।
- चरण ४.३ और ४.४ अन्य अर्ध सिर के साथ दोहराएँ ।
- एक बाँझ कांच पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से प्रत्येक ३५ mm पेट्री डिश में सीधे पोषक तत्व मध्यम जोड़ें जब तक यह फिल्टर कागज के स्तर तक पहुंचता है । पोषक मध्यम में आधे सिर को जलमग्न न करें ।
- प्रत्येक पेट्री डिश में पोषक मध् यम को १०,००० U/mL पेनिसिलिन-streptomycin के ५० µ l को जोड़ें ।
- एक छोटे से वर्ग में ऊतक कागज का एक टुकड़ा गुना और यह १०० mm पेट्री डिश के अंदर जगह है । यह autoclaved आसुत पानी के साथ गीला ।
- ३७ ° c ± 1 डिग्री सेल्सियस और ~ ४०% आर्द्रता पर बाँझ, अंधेरे मशीन में संस्कृति पकवान प्लेस 4 दिनों के लिए ।
- प्रत्येक भ्रूण के लिए चरण 3 और 4 दोहराएं ।
नोट: आवश्यक भ्रूण की संख्या विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करेगा; यहां, हम 12 भ्रूण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन ।
5. कल्चरल मेंटेनेंस
- एक बार प्रति दिन, ताजा, autoclaved आसुत पानी के साथ मशीन में प्लास्टिक कंटेनर ऊपर ।
- बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण के लिए दैनिक सभी संस्कृतियों की जांच करें । संस्कृतियों कि महत्त्वाकांक्षा है या जिसमें मध्यम रंग बदल गया है संक्रमित हैं । संक्रमित सभी संस्कृतियों को त्यागें ।
6. निर्धारण
- संवर्धन के बाद, मशीन से सभी व्यंजन निकालें ।
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, धीरे फिल्टर कागज से आंख हटाने के लिए, ध्यान ऊतक आंसू नहीं ले ।
- 1x फॉस्फेट में 4% paraformaldehyde में नेत्र ऊतक ठीक-4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात खारा या में 10% तटस्थ बफर formalin कमरे के तापमान पर रातोंरात ।
- 4 ° c में ऊतक की दुकान 1x फॉस्फेट-बफर खारा में ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस विधि का प्रयोग, एक भ्रूण चिकन आंख 4 दिनों के लिए इन विट्रो में अपने विकास (HH34) के 8 दिन से संस्कृतिित किया जा सकता है । ovo विकास के चार दिन HH38 से मेल खाती है ।
यह संवर्धन विधि आंखों के आसपास और पलकों पर पंख कलियों के विकास का समर्थन करता है (आंकड़ा 1b) । ये पंख कलियों संवर्धन (चित्रा 1a) से पहले HH34 पर ovo में मौजूद नहीं हैं, यह दर्शाता है कि पंख कली विकास संवर्धन अवधि के दौरान शुरू की है, के रूप में यह13 ovo मेंहै (चित्रा 1C) । पलकों और nictitating झिल्ली संवर्धन (चित्रा 1b) के दौरान आंख को कवर करने के लिए विकसित। पलकों के बाद अधिक परिपक्व दिखाई देते हैं इन विट्रो संवर्धन पर संवर्धन के शुरू में से HH34 (चित्र 1a) लेकिन कम HH38 (चित्रा 1C) की तुलना में विकसित कर रहे हैं । इस डेटा से पता चलता है कि भ्रूण विकास के प्रमुख पहलुओं का समर्थन कर रहे हैं, हालांकि कुछ छोटे देरी के साथ ।
संवर्धन के बाद, हम आंख के पूर्वकाल भाग विदारक नेत्रश्लेष्मला पपिले (13-14 उपकला घुसपैठ की एक क्षणिक अंगूठी), जो अभी तक एक और ऐतिहासिक संकेत है कि विकास की घटनाओं संस्कृति में समर्थन कर रहे है के रूप में कार्य दिखाने के लिए । आमतौर पर, इन पपिले पूरी तरह से HH34 (चित्रा 1 डी) द्वारा बनाई गई हैं, और समय पर पतित के रूप में वे अंतर्निहित mesenchyme में skeletogenic संघनित्र प्रेरित; वे1 HH38 (चित्रा 1F) से गायब हो जाते हैं । हमारे डेटा से पता चलता है कि इस अध कि विट्रो में होता है (चित्रा 1E) और विकास के ovo पैटर्न में निम्नलिखित पपिले के एक समतल से पहले है. दाग संघनित्र, तथापि, में इन विट्रो नमूनों में दिखाई नहीं दे रहे हैं, HH38 पर विपरीत (चित्रा 1F) । हम alkaline फॉस्फेट धुंधला है, जो जल्दी osteoblast गतिविधि का पता लगाता है आगे इन संघनित्र14की प्रेरण का आकलन करते थे; यह प्रक्रिया ovo मेंनेत्रश्लेष्मला पपिले के अध कि के साथ होती है । skeletogenic संघनित्र, जो HH34 (चित्रा 1G) में शुरू होता है की प्रेरण, इन विट्रो में आगे बढ़ना है के रूप में alkaline फॉस्फेट धुंधला (चित्रा ज) द्वारा सबूत । इन संघनित्र, तथापि, के रूप में बड़े रूप में वे14 HH38 (चित्रा 1I) में नहीं हैं, फिर से संकेत है कि वहां विकास में एक छोटी सी देरी है । हमारा अनुमान है कि संवर्धन के 4 दिन भ्रूण के विकास के लगभग 2 दिनों का प्रतिनिधित्व करते हैं; इसलिए के बारे में ५०% की देरी । सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि प्रेरण और intramembranous हड्डियों के विकास, scleral संघनित्र, इन विट्रो में समर्थित है और विकास प्रक्रियाओं जैसे कि पलक विकास और पंख कली गठन में आगे बढ़ना विट्रो.
चित्रा 1 . रूपात्मक के लक्षण इन विट्रो कल्चर्ड आंखें, HH34 आंखें, और HH38 आंखें । एक - च दाग और जी रहे है मैं alkaline फॉस्फेट (एपी) एंजाइम scleral संघनित्र के भीतर सक्रिय osteoblasts भेद के लिए दाग रहे हैं । एक, डी, और जी HH34 पर संवर्धन अवधि के शुरू में आंखें दिखाओ । बी, ई, और एच शो आंखें के बाद 4 दिनों के इन विट्रो संवर्धन. सी, एफ, और मैं ovo संवर्धन में , HH38 में के 4 दिनों के बाद आंखें दिखाओ । सभी आंखें बाद में देखा जाता है । (क) नेत्रश्लेष्मला पपिले कॉर्निया के आसपास की एक अंगूठी में दिखाई दे रहे हैं । तारांकन चिह्न papilla #12, पहले प्रपत्र के लिए एक इंगित करता है । तीर आंखों के नाक क्षेत्र में पलक की धार इंगित करता है । (ख) नेत्रश्लेष्मला पपिले ने समतल किया है और पतित होना शुरू कर दिया है. तीर एक बढ़ पंख कली इंगित करता है । (ग) नेत्रश्लेष्मला पपिले पूरी तरह से पतित है और पलकें और nictitating झिल्ली से आच्छादित हैं । खुले तीर आंखों के नाक क्षेत्र में पलक की धार को इंगित करता है । ठोस तीर एक बढ़ पंख कली इंगित करता है । (घ) HH34 आँख का एक विच्छेदित पूर्वकाल भाग. तारक papilla #12 इंगित करता है । (ङ) एक HH34 के एक विच्छेदित पूर्वकाल भाग + 4 इन विट्रो आंख चपटा पपिले दिखा । लौकिक क्षेत्र में पपिले (ठोस तीर) के लिए पतित शुरू कर दिया है; रिंग में ये सबसे पुरानी पपिले हैं । (च) पलकें और nictitating झिल्ली के साथ एक HH38 आंख के एक विच्छेदित पूर्वकाल भाग, दिखा रहा है कि सभी पपिले पतित है । डैश्ड रेखाएं दो सन्निकट अनदाग संघनित्र की स्थिति को बाह्यरेखांकित कर रही हैं । (छ) एक HH34 आंख बहुत छोटे skeletogenic संघनित्र प्रेरण की शुरुआत का संकेत दिखा एपी के लिए दाग । (एच) एक HH34 + 4 आंख बढ़े, बढ़ती skeletogenic संघनित्र दिखा एपी के लिए दाग । (I) एक HH38 आंख बड़े skeletogenic संघनित्र दिखा एपी के लिए दाग । सभी स्केल पट्टियां 1 मिमी हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल की स्थापना की ऊतक संवर्धन तकनीक का उपयोग करने के लिए भ्रूण दिवस 8 से एक चिकन आंख के विकास को प्राप्त करने के लिए बनाता है (HH34) 4 दिनों के लिए इन विट्रो में । यह ग्रिड-संवर्धन विधि मूल रूप से Trowell15द्वारा वर्णित किया गया था । हम पिंटो और हॉल १९९१ अध्ययन16 से एक प्रोटोकॉल अनुकूलित एक अर्द्ध ग्रिड के साथ असुरक्षित झिल्ली भ्रूण चिकन नेत्र15के अलग ऊतक परतों के बीच आगमनात्मक संकेतों का अध्ययन का उपयोग । इस विधि का प्रयोग, एक प्रकार की मछली 14 दिन पुराने चिकन फीमर6। इस विधि भी संवर्धन माउस के ऊतकों में प्रभावी साबित किया है6,17. फिल्टर कागज का उपयोग प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह ऊतक के माध्यम से प्रभावी ढंग से संतृप्त या submersing ऊतक के बिना पोषक तत्वों को लेने के लिए मदद करता है ।
एक उचित पीएच में पोषक तत्व मध्यम इष्टतम विकास के लिए महत्वपूर्ण है । मध्यम पर या शारीरिक पीएच के पास होना चाहिए, और एक संकेतक के रूप में माध्यम में phenol लाल का उपयोग करें कि पीएच परिवर्तन आसानी से पता लगाया जा सकता है में एक लाभ प्रदान करता है । सीरम मुक्त मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है, और मीडिया को बदलने दैनिक आवश्यक नहीं है और परिणाम को प्रभावित नहीं करता है । प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें), जो एमिनो एसिड और ग्लूकोज के उच्च स्तर शामिल का उपयोग कर विकसित किया गया था; मीडिया की कोई और पूरकता की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर गरीब ऊतक विकास की सबसे आवृत्तियों हुई जब पोषक तत्वों मीडिया एक अनुचित पीएच या दूषित पर या तो था ।
आंख जीवित है और 4 दिनों के लिए इन विट्रो मेंहो जाना, भ्रूण 8 दिन में शुरू कर सकते हैं, जब प्रोटोकॉल इष्टतम शर्तों के तहत किया जाता है । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि जीवित संवर्धन के 4 दिनों से परे प्रभावित है । इस प्रकार, विकास प्रक्रियाओं है कि एक लंबी समय सीमा अवधि प्रोटोकॉल में संशोधनों की आवश्यकता होगी । प्रोटोकॉल की एक और सीमा एक सक्रिय रक्त प्रवाह और vascularization का अभाव है । रक्त वाहिकाओं कई विकास प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, न सिर्फ पोषक तत्वों की डिलीवरी के लिए9ऊतक, जो फिल्टर कागज के माध्यम से केशिका कार्रवाई के माध्यम से इन विट्रो में हासिल की है जिस पर ऊतक टिकी हुई है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए पूरे अंगों या इन विट्रो मेंऊतक के बड़े टुकड़े के विकास का अध्ययन किया जा सकता है । हड्डीवाला अंगों अत्यधिक जटिल हैं, और उनके विकास के कई विशिष्ट spatiotemporal पैटर्न द्वारा विनियमित है । इन विकासात्मक रास्ते के अध्ययन के लिए संकेत है कि उंहें विनियमित हेरफेर करने की क्षमता पर निर्भर करता है । वर्तमान तरीके अपेक्षाकृत छोटे, स्थानीयकृत क्षेत्रों के लिए इस हेरफेर सीमा, और कम पर्याप्त सांद्रता के लिए भ्रूण की घातकता से बचने के लिए । उदाहरण के लिए, संवर्धन के पूर्व ovo विधि18 संस्कृति या विंडो अंडे19 करने के लिए विधि में पूरे चिकन भ्रूण का संचालन करने के लिए जोड़तोड़ में सीमित है कि या तो पूरे भ्रूण का इलाज किया जाना चाहिए, जो घातकता पैदा कर सकता है, या केवल एक छोटे स्थानीयकृत क्षेत्र का इलाज किया है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इन संकेतों का प्रभाव पूरे अंगों या ऊतक की बड़ी मात्रा पर अध्ययन किया जा सकता है, भ्रूण व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना । इस प्रोटोकॉल के पहले प्रोटोकॉल15में के रूप में कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किसी भी पूरकता की आवश्यकता नहीं है । विकास में देरी है कि हम मनाया कि तेजी से विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है में एक फायदा है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों प्रोटोकॉल के विकास में अपने प्रारंभिक काम के लिए ग्रेगरी हॉल (माउंट सेंट विंसेंट विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । लेखक भी निकोलस जोंस का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा (माउंट सेंट विंसेंट विश्वविद्यालय) अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सहायता के लिए फिल्मांकन और पांडुलिपि के ऑडियो/दृश्य भाग के उत्पादन के साथ । डैनियल एंड्रयूज MSVU से धन द्वारा समर्थित और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (NSERC) एक स्नातक छात्र अनुसंधान पुरस्कार के माध्यम से किया गया । टेलर ए फ्रांज-Odendaal एक NSERC डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
