Summary
여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.
Abstract
미 발달 닭 척 추가 개발에 대 한 신뢰할 수 있는 모델 생물으로 주로 사용 됩니다. 접근성 및 짧은 인큐베이션 기간 적합 실험에 대 한 합니다. 현재, 닭 태아에 있는이 발달 경로 연구는 저 해제 및 지역화 된 사이트에서 다양 한 방법 사용 하 여 낮은 농도에서 마약을 적용 하 여 실시 됩니다. 생체 외에서 조직 배양은 조직 호스트 유기 체에서 동시에 전체 배아, 배아의 민감성 등을 작업할 때 현재 물리적 한계의 대부분을 무시 하면서 분리의 연구를 가능 하 게 하는 기술 잠재적으로 치명적인 화학 제품의 높은 복용량. 여기, 우리는 배아 치킨 반 머리 생체 외에서현재 설립된 방법 넘어 개발 프로세스의 시험에 대 한 새로운 기회를 선물 한다 경작을 위한 프로토콜을 경작 하는 organotypic 제시.
Introduction
배아 닭고기 (갈 루스 갈 루스)는 생물학의 분야에서 일반적으로 사용 되는 우수한 모델 유기 체. 그 잠복기는 대략 21 일 고 많은 계란 수 있습니다 알을 품을 동시에, 신속 하 고 효율적인 실험을 만들기. 아마도 가장 중요 한 것은, 태아는 또한 쉽게 조작, 광범위 한 연구와 유전자와 이러한 프로세스를 구동 하는 단백질의 주요 개발 프로세스의 사용.
미 발달 닭 눈은 개발을 통해 다양 한 다른 조직 비슷한 많은 다른 시체는 시스템의 상호 작용 하는 복잡 한 기관 이다. 이 메서드는 개발의 고급 단계에서 특히이 조직 개발의 연구를 수 있습니다. 예를 들어 다층된 망막 신경 시스템의 개발을 공부 하 고 그에 게 특히 관심이 될 수 있습니다. 와 같은 각 막, vitreal, 렌즈, sclera, 몸과 눈 꺼 풀 연구자에 게 도움이 다른 눈 조직의 연구를 활성화 하는 방법에 대 한 대체. 닭 배아 눈에는 편평한 뼈, intramembranous 뼈 유도 및 척추1에서 나오고의 연구에 대 한 모델로 사용 될 수 있는 scleral 이소골의 일련을 포함 되어 있습니다.
현재, 배아 발달을 공부 하는 데 사용 하는 방법 수가 있다. 억제 항 체 또는 다른 억제 분자2,3, microinjections 수술 microbeads 억제 물4에 배어 이식 및 electroporation5 는 downregulate 유전자를 사용할 수 있는 모든 방법을 또는 태아의 단백질입니다. 비슷한 메서드는 upregulate 단백질에 사용 됩니다. 이러한 방법을 그들의 제한 없이 되지 않습니다. 예를 들어 화학 물질을 사용 하 여 변경 하는 배아 개발을 태아에 치명적인 영향을 평가 해야 합니다, 그리고 이것의 생존을 보장 하기 위해 충분히 낮은 복용량에서 응용 프로그램의 지역화 된 사이트에 앞서 언급 한 방법의 사용을 제한 합니다 태아입니다.
생체 외에서 조직 배양 연구 개발 생물의 넓은 범위에서 사용 되었습니다 그리고 상기 제한 중 일부를 무시 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 femora6, 깃털 꽃 봉 오리7,8및 사지9 닭의 모든 되었습니다 공부 마우스10 와 뿌리의 고환 및 식물11의 줄기 조직 배양 방법를 사용 하 여. 이러한 방법을 과학자 제어 온도 변동 양분 가용성을 변경 하는 등 조직 개발의 높은 학위를 부여 합니다. 전체 태아에서 직물의 절연은 또한 높은 농도에서 세계적인 규모에 대 한 조작 연구를 활성화 하는 화학 제품의 치명적인 효과를 훨씬 덜 취약 합니다. 체 외에서 배양 하는 또 다른 주목할 만한 이점은 이다 조직의 셀룰러 환경 보존 조직 배열 다른 조직 유형9사이의 상호 작용을 공부 하는 게 가능 하, 상대적으로 변경 되지 않습니다. 따라서, 체 외에서 배양 열립니다 문을 추가 실험 접근 비켜 또는 vivo에서 모델에서 사용할 수 없습니다.
현재, 화학 물질을 사용 하 여 미 발달 닭 눈의 개발을 공부 하 고 특히 도전 이다. Extraembryonic 막 수 커버 태아, 어렵게 적용 microbeads 또는 화학 제품; 태아 그것 수록, 더는 이미 어려운 방법 복잡 계란 내에서 매우 적극적 이기도 합니다. 이 프로토콜에는 눈 및 그 주변 조직, 또한 눈 내 개발 프로세스를 검사 하는 새로운 기회를 제공 하면서이 방 벽을 제거 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 눈 내 scleral 이소골의 유도 연구 설립 되었다.
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Protocol
참고: 배아 단계에 대 한 햄버거와 해밀턴12 (HH) 준비 테이블을 사용 합니다.
1. 배아의 부 화
- 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 온도 제어 인큐베이터에서 수정 된 닭 알을 품 어.
- 계란 1 차례 하루 x HH34을 알을 품을 수 있도록 (8 일 후 수정).
2. 준비 및 재료의 살 균
- 12 배아, 압력솥 증류수, 0.85% 병아리 염 분, 12 유리 펫, 종이 조직과 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각 반 다공성 필터 종이, 강선의 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각형의 1 상자 1 L 2 L 메쉬 곡선 아래쪽 가장자리에 대 한. 자료, 소독 압력솥 적어도 15 분 동안 121 ° C에서 그들.
참고: 재료의 압력가 마로 소독 사전에 할 수 있습니다. - 측면, 선반, 및 문을 닦아 하 여 70% 에탄올과 인큐베이터를 소독. 장소 2 플라스틱 용기 포함 압력가 하는 습도 유지 하기 위해 인큐베이터 안에 증류수. 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에 문화 인큐베이터 prewarm 인큐베이터는 완전히 어두운; 확인 문은 투명, 은박지와 커버.
- 문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 영양소 매체의 및 페니실린의 1 mL 100 mL를 prewarm.
- 종이 수건으로 작업 영역을 커버 하 고 70% 에탄올을 분사 하 여 벤치를 소독. 비슷한 방식으로 소독 집게, 해 부가 위, 면도날, 및 70% 에탄올과 플라스틱 숟가락의 2 쌍.
- 장소 12 살 균 100 mm 페 트리 접시 그리고 사용에 대 한 벤치에 접시 24 살 균 35 m m. 요리 사용까지 멸 균 가방에 남아 확인 합니다.
3. 배아 준비
참고:이 시점에서 앞으로, 문화를 훼손 하지 않도록 보호 먼지 얼굴 마스크를 착용 하십시오. 세균 이나 곰 팡이 감염 문화를 망칠 것입니다 그리고 그것은 인큐베이터에서 모든 문화에 빠르게 확산의 위험.
- 균열 계란 열고 100 mm 페 트리 접시 0.85% 병아리 염 분을 포함 하는 배아를 전송 합니다. 해 부 특징에 따라 배아 햄버거와 해밀턴 준비 지침12 에서 설명 하 고 태아를 확인 단계는 HH34에서 이다.
- 목 고 소독된 면도날을 사용 하 여 중간에 태아의 머리를 이등분. 소독 집게를 사용 하 여 두뇌를 제거 합니다. 부리는 그대로 둡니다.
4. 문화 설치
- 한 100 mm 페 트리 접시 안에 35 mm 페 트리 접시의 장소 2.
- 각 35 mm 페 트리 접시 안에 강철 와이어 메쉬를 배치 합니다.
- 집게를 사용 하 여 전송 bisected 머리의 1 2.5 c m x 2.5 c m 반 다공성 필터 종이 위로 향하도록 눈으로. 조직과 보안은 약간 그것을 기울이기로 벗어 버리는 하지 않습니다 확인 합니다.
- 집게를 사용 하 여 신중 하 게 장소 눈 조직 및 필터 종이 위에 올려진된 무대 위에 눈 조직으로 만드는 35mm 페 트리 요리의 1 강철 와이어 메쉬.
- 4.3 및 4.4 다른 절반 머리와 단계를 반복 합니다.
- 필터 종이의 수준에 도달할 때까지 각 35 mm 페 트리 접시에 직접 영양소 매체를 추가 신중 하 게 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여. 영양소 중에 반 머리를 잠수함 하지 마십시오.
- 각 페 트리 접시에 영양 보통 10000 U/mL 페니실린-스의 50 µ L를 추가 합니다.
- 작은 광장으로 조직 종이 접어과 100 mm 페 트리 접시 안에 배치. 압력가 증류수와 함께 축 축 하 게.
- 최대 4 일 동안 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 어두운 인큐베이터에 문화 접시를 놓습니다.
- 각 태아에 대 한 3-4 단계를 반복 합니다.
참고: 배아의 수 특정 실험;에 따라 달라 집니다 필요 여기, 우리는 12 배아에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
5. 문화 유지 보수
- 하루에 한 번, 신선한, 압력가 증류수와 인큐베이터에서 플라스틱 용기를 가기.
- 세균 이나 곰 팡이 감염에 대 한 모든 문화는 매일 확인 합니다. 문화는 붕괴 또는 매체 색상을 변경 되었습니다 감염 됩니다. 감염 되는 모든 문화를 삭제 합니다.
6입니다. 고정
- 인큐베이터에서 모든 요리를 제거 하는 경작, 다음.
- 부드럽게 집게의 쌍을 사용 하 여, 조직을 찢 어 하지 않도록 주의 복용 필터 종이에서 눈을 제거 합니다.
- 4 ° C에서 하룻밤 염 인산 염 버퍼 x 1 또는 10% 중립 버퍼링 말린 하룻밤 실 온에서 4 %paraformaldehyde 눈 조직을 수정 했다.
- 인산 염 버퍼 염 분 x 1에 4 ° C에서 티슈를 저장 합니다.
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Representative Results
이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 눈 수 수 경작 하루 8 개발 (HH34)의 생체 외에서 에서 4 일 동안. 비켜에 개발의 4 일 HH38에 해당 합니다.
이 자란 방법 깃털 싹 눈 주위와 눈 꺼 풀 (그림 1B)에 개발을 지원 합니다. 이러한 깃털 싹 존재 비켜 HH34에서 경작 (그림 1A), 이전 비켜에서13 (그림 1C)은 깃털 새싹 개발 자란 기간 시작 됩니다 나타내는 되지 않습니다. 눈 꺼 풀과 nictitating 막 자란 (그림 1B). 동안 눈을 충당 하기 위해 성장 눈 꺼 풀은 체 외에서 배양 보다 HH34에서 경작의 시작 후 더 성숙 나타납니다 (그림 1A) 하지만 덜 보다 HH38에서 개발 된 (그림 1C). 이 데이터 이기는 하지만 몇 가지 작은 지연으로 배아 발달의 핵심적인 측면은 지원 보여줍니다.
경작, 후 우리 conjunctival 용의자 (13-14 상피 돌출의 일시적인 반지), 또 다른 랜드마크 개발 이벤트 문화에서 지원 되는지 나타내는 행동을 보여 눈의 앞쪽 부분을 해 부. 일반적으로, 이러한 papillae 완전히 HH34에 의해 형성 된다 (그림 1D), 그리고 시간이 지남에 그들은 기본 mesenchyme;에서 skeletogenic condensations 유도 타락 한 그들은 HH381 (그림 1 층) 사라집니다. 우리의 데이터가이 변성에서 체 외에서 (그림 1E) 개발 비켜에서 패턴을 따라 하는 용의자의 병합 앞 보여줍니다. 그러나 흠 없는 condensations,에 표시 되지 않은 생체 외에서 샘플 달리 HH38에서 (그림 1 층). 우리가 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소, 얼룩이 지기 더 이러한 condensations14;의 유도 평가 하기 위해 초기 osteoblast 활동 감지 이 과정에서 비켜에conjunctival 용의자의 퇴보와 함께 발생합니다. 감 응 작용 skeletogenic condensations의 HH34에서 시작 됩니다 (그림 1 H) 얼룩 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 입증 (그림 1G), 체 외에서 진행지 않습니다. 그러나 이러한 condensations,, 아니라 큰 HH3814 (그림 1I), 그들은 다시 나타내는 있습니다 개발 지연입니다. 우리는 경작 대표 배아 개발;의 약 2 일의 4 일 견적 따라서 약 50%의 지연. 이러한 결과 유도 및 intramembranous 뼈, scleral condensations의 개발은 지원 생체 외에서 그리고 눈 꺼 풀 성장과 깃털 꽃 봉 오리 형성 등 개발 프로세스에서 를 진행 체 외.
그림 1 . 형태학 특성 시험관에 눈, HH34 눈, 그리고 HH38 눈 교양. A - F 는 스테인드 및 G - scleral condensations 내에서 활성 osteoblasts 구별 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 효소에 대 한 얼룩이 있습니다 . A, D와 HH34에서 자란 기간의 시작에 G 쇼 눈. B, E및 H 체 외에서 배양의 4 일 후 눈을 표시합니다. C, F, 그리고 내가 비켜에서 경작, HH38에서의 4 일 후 눈을 표시 합니다. 모든 눈은 옆으로 볼 수 있습니다. (A)는 conjunctival 용의자 링 각 막 주변에서 볼 수 있습니다. 별표 시 #12, 첫 번째 폼을 나타냅니다. 화살표는 눈의 코 지역에서 눈 꺼 풀의 가장자리를 나타냅니다. (B) conjunctival 용의자는 평평 하 고 퇴 화 하기 시작. 화살표는 성장 깃털 꽃 봉 오리를 나타냅니다. (C)는 conjunctival 용의자는 완전히 전락 하 고 눈 꺼 풀과 nictitating 막에 의해 보호 됩니다. 열기 화살표는 눈의 코 지역에서 눈 꺼 풀의 가장자리를 나타냅니다. 단단한 화살표 성장 깃털 꽃 봉 오리를 나타냅니다. (D) A HH34 눈의 해 부 앞쪽 부분. 별표가 나타냅니다 시 #12. (E) A는 HH34 + 일반된 용의자를 보여주는 4 체 외에 눈의 앞쪽 부분 해 부. 임시 지역 (고체 화살표)에서 용의자 타락 한; 시작 이들은 반지에서 가장 오래 된 용의자입니다. (F) A 해 부 눈 꺼 풀 및 nictitating 막 제거, 모든 용의자는 퇴 화를 보여주는 HH38 눈의 앞쪽 부분. 파선 두 개의 인접 한 흠 없는 condensations의 위치를 설명합니다. (G) A HH34 눈 매우 작은 skeletogenic condensations 유도의 시작의 표시 보여주는 ap 스테인드. (H) A HH34 + 4 눈 확대, 성장 하는 skeletogenic condensations 보여주는 ap 스테인드. (나) A HH38 눈 큰 skeletogenic condensations를 보여주는 ap 스테인드. 모든 스케일 바는 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 닭 눈 배아 주 8에서에서 (HH34)의 성장을 달성 하기 위해 설립 된 조직 배양 기술을 사용 생체 외에서 4 일 동안. 이 그리드 경작 방법 Trowell15에 의해 원래 기술 되었다. 우리는 핀 토와 홀의 1991 연구16 배아 닭 눈15의 분리 된 조직 층 사이 유도 신호를 공부 하는 그리드와 반 다공성 멤브레인을 활용 하 여 프로토콜을 최적화. 이 메서드를 사용 하 여, 바퀴벌레 14 일 오래 된 닭의 대 퇴 골6교양. 이 방법은 또한 마우스 조직6,17경작에 효과가 입증 되었습니다. 필터 종이의 사용은 영양분을 받아들이고 매체에서 효과적으로 포화 또는 submersing 조직 없이 조직 도움으로 프로토콜의 성공에 중요 합니다.
적절 한 pH에 영양소 매체 최적의 성장을 위해 중요 하다. 매체에 또는 생리 적 pH 및 매체에서 페 놀 레드를 사용 하 여 표시기 pH 변화는 쉽게 감지 될 수 있는 이점을 제공 해야 합니다. 혈 청 무료 미디어를 사용할 수 있습니다, 그리고 미디어를 매일 변경 필요 하지 않습니다 결과는 영향을 미치지 않습니다. 프로토콜은 상업적으로 사용할 수 있는 매체를 사용 하 여 개발 되었다 (참조 테이블의 자료), 아미노산, 포도 당;의 상부를 포함 하 미디어의 아무 추가 보충이 필요 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 가난한 조직 성장의 대부분 발생 영양소 미디어 부적 절 한 pH에서 또는 오염 된 때 발생 했습니다.
눈 생존 하 고 최대 4 일에서 생체 외에서배아 하루 8, 프로토콜 최적의 조건 하에서 수행 되는 때부터 성장할 수 있습니다. 이 프로토콜의 한 가지 한계는 생존은 경작의 4 일 이상 영향을 것입니다. 따라서, 더 긴 기간에 걸쳐 개발 프로세스 프로토콜에 대 한 수정이 필요 합니다. 프로토콜의 또 다른 한계는 활성 혈액 흐름과 vascularization의 부재 이다. 혈관은 뿐 아니라 조직9, 영양소의 배달에 대 한 많은 개발 프로세스에 대 한 중요 한 조직 달려있다 필터 종이 통해 모 세관 작용을 통해 체 외 달성입니다.
이 프로토콜은 전체 장기 또는 조직에서을 체 외에서의 큰 조각을의 개발 연구에 사용할 수 있습니다. 척 추가 있는 장기는 매우 복잡 한, 그리고 그들의 개발은 많은 고유 spatiotemporal 패턴에 의해 규제 됩니다. 이러한 발달 경로 연구 그들을 통제 하는 신호를 조작 하는 기능에 의존 합니다. 현재 메서드는 상대적으로 작은, 지역화 된 영역, 그리고 배아 치 사 율을 피하기 위해 충분히 낮은 농도이 조작을 제한 합니다. 그 중 전체 태아 치료를 해야 합니다, 치 사 율, 발생할 수 있습니다 또는 예를 들어 문화18 또는 창 계란19 조작을 실시 하는 방법은 전체 닭 배아 배양의 비켜 ex 메서드 제한 됩니다는 지역화 된 작은 지역 처리 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 장점은 이러한 신호 효과 미 발달 생존 능력을 영향을 주지 않고 전체 장기 또는 조직의 다량에 공부 될 수 있다. 이 프로토콜은 이전 프로토콜15에서 이산화탄소와 어떤 보완이 필요 하지 않습니다. 우리가 관찰 하는 개발 지연에는 이점을 신속한 개발 프로세스를 공부 될 수 있다입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 프로토콜의 개발에 그의 예비 작업에 대 한 그레고리 할 러 (마운트 세인트 빈센트 대학)를 감사 하 고 싶습니다. 저자 그의 기술적 전문성과 촬영 및 원고에 대 한 오디오/비디오 부분의 생산에 대 한 니콜라스 존스 (마운트 세인트 빈센트 대학)를 감사 하 고도 싶습니다. 다니엘 앤드류 스에서 MSVU 및 자연 과학 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 통해 학부 학생 연구 보너스 자금에 의해 지원 되었다. 타마라 A. 프란츠-Odendaal NSERC 발견 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
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