Summary
Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.
Abstract
A galinha embrionária é comumente usada como um organismo modelo confiável para o desenvolvimento de vertebrados. Sua acessibilidade e incubação curta período é ideal para a experimentação. Atualmente, o estudo destas vias do desenvolvimento do embrião de galinha é realizado através da aplicação de inibidores e drogas em locais localizados e em baixas concentrações, usando uma variedade de métodos. Em vitro tecido cultivo é uma técnica que permite o estudo dos tecidos separados do organismo hospedeiro, enquanto ao mesmo tempo ignorando muitas das limitações físicas presentes ao trabalhar com embriões inteiro, tais como a susceptibilidade de embriões para altas doses de substâncias químicas potencialmente letais. Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para cultivo a galinha embrionários meia cabeça em vitro, que apresenta novas oportunidades para o exame de processos de desenvolvimento, além dos métodos actualmente estabelecidos.
Introduction
A galinha embrionária (Gallus gallus) é um organismo de excelente modelo comumente usado no campo da biologia. Seu período de incubação é de aproximadamente 21 dias e muitos ovos podem ser incubados simultaneamente, tornando a experimentação rápida e eficiente. Talvez mais importante, o embrião é também facilmente manipulado, permitindo o estudo extensivo de processos-chave do desenvolvimento e dos genes e proteínas que impulsionam estes processos.
O olho embrionárias de galinha é um órgão complexo que se desenvolve através da interação de um número de diferentes tecidos semelhantes a muitos outros sistemas do corpo. Esse método permite que o estudo do desenvolvimento desses tecidos, particularmente em estágios avançados de desenvolvimento. Por exemplo, a retina multi-camadas pode ser de particular interesse para os que estudam o desenvolvimento do sistema nervoso. Métodos alternativos que permitem o estudo de outros tecidos oculares, tais como a córnea, o corpo de vitreal, a lente, a esclera e as pálpebras são de benefício para os investigadores. O olho embrionárias de galinha também contém uma série de ossos chatos, os ossículos scleral, que podem ser usados como um modelo para o estudo da indução óssea intramembranosa e ossificação em vertebrados1.
Atualmente, existem vários métodos utilizados para estudar o desenvolvimento embrionário. Microinjeções de inibitórios anticorpos ou outras moléculas inibidoras2,3, cirurgicamente microbeads embebido em inibidor4e eletroporação5 são todos os métodos que podem ser usados para downregulate genes ou proteínas de interesse em um embrião. Métodos similares são usados para upregulate proteínas. Esses métodos não são sem suas limitações. Por exemplo, ao usar produtos químicos para alterar o desenvolvimento embrionário, os efeitos letais sobre o embrião devem ser avaliados, e isso limita o uso dos métodos acima mencionados para sites localizados de aplicação em doses baixas o suficiente para garantir a sobrevivência da embrião.
In vitro , tecido cultivo tem sido utilizado em uma ampla gama de organismos, para estudar o desenvolvimento e pode ser usado para contornar algumas das limitações acima mencionadas. Por exemplo, os fêmures6, pena botões7,8e membros9 do frango todos foram estudadas usando tecido cultivo métodos, como têm os testículos de rato10 e as raízes e caules de plantas11. Esses métodos concedem cientistas um alto grau de controle sobre o desenvolvimento de tecidos, tais como a capacidade de variar a temperatura e alterar a disponibilidade de nutrientes. O isolamento do tecido do embrião inteiro também torna muito menos suscetíveis aos efeitos letais de produtos químicos, permitindo estudos de manipulação em escala global em altas concentrações. Outra vantagem notável em vitro cultivo é a preservação do ambiente celular do tecido; o arranjo dos tecidos permanece relativamente inalterado, tornando possível estudar as interações entre diferentes tecidos tipos9. Assim, em vitro abre portas adicionais experimental de cultivo se aproxima não disponível nos modelos no vivo ou no ovo .
Atualmente, estudar o desenvolvimento do olho embrionárias de galinha usando produtos químicos é particularmente desafiadora. Um número de membranas extraembryonic cobre o embrião, tornando difícil aplicar microbeads ou produtos químicos; o embrião também é muito ativo dentro do ovo, como ele fica mais velho, complicando ainda mais um método já difícil. Este protocolo permite acesso fácil para os olhos e seus tecidos circundantes, eliminando as barreiras, proporcionando também novas oportunidades para examinar os processos de desenvolvimento dentro do olho. Este protocolo foi criado para estudar a indução de scleral ossículos dentro do olho embrionário.
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Protocol
Nota: Para estágios do embrião, utilizam o Hamburger e Hamilton12 (HH) tabela de preparo.
1. o embrião incubação
- Incube os ovos fertilizados de galinha numa incubadora estéril, controlo de temperatura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade.
- Vire os ovos 1 x por dia e permitir que incube ao HH34 (fertilização pós de 8 dias).
2. preparação e esterilização dos materiais
- Para 12 embriões, autoclave 2 L de água destilada, 1 L de solução salina de garota de 0,85%, 12 pipetas de vidro, 1 caixa de tecido de papel, 24 2,5 x 2,5 cm quadrados de papel de filtro semi porosa e praças 24 2,5 x 2,5 cm de fio de aço de malha com as bordas curvadas para baixo. Para esterilizar os materiais, autoclave-los a 121 ° C durante pelo menos 15 minutos.
Nota: A esterilização dos materiais pode ser feita com antecedência. - Esterilize a incubadora com etanol 70% limpando os lados, prateleiras e porta. Coloque 2 recipientes plásticos contendo autoclavado destilaram água dentro da incubadora para manter a umidade. Escaldar a incubadora de cultura a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade. Certifique-se da que incubadora está completamente escura; se a porta for transparente, cubra com papel alumínio.
- Escaldar a 100 mL de meio nutritivo e 1 mL de penicilina, colocando-os na incubadora de cultura.
- Cobrir a área de trabalho com uma toalha de papel e esterilizar o banco por pulverização com etanol a 70%. Esterilize 2 pares de pinças, tesouras de dissecação, uma lâmina de barbear e uma colher de plástico com etanol a 70% de forma semelhante.
- Pratos de Petri estéril 100mm lugar 12 e 24 pratos de Petri estéril 35mm no banco para uso. Certifique-se de que pratos permanecem num saco estéril até o uso.
3. embrião preparação
Nota: A partir deste momento, use uma máscara de protecção contra o pó para evitar a contaminação das culturas. Uma infecção bacteriana ou fúngica vai estragar a cultura... e há um risco de se espalhar rapidamente a todas as culturas na incubadora.
- Crack abrir o ovo e transferir o embrião para um prato de Petri de 100mm contém solução salina 0,85% garota. Estágio o embrião de acordo com as características anatômicas descritas no Hamburger e Hamilton encenando orientações12 e confirmar o embrião está no HH34.
- Cortar o pescoço e depois dividem a cabeça do embrião na linha usando uma lâmina de barbear esterilizada. Usando a pinça estéril, remova o cérebro. Deixe o bico intacto.
4. cultura Setup
- 2 lugar dos pratos de Petri 35mm dentro de um prato de Petri de 100 mm.
- Coloca uma malha de arame de aço no interior de cada prato de Petri de 35 mm.
- Usando fórceps, transferi 1 das cabeças bisseccionadas para um pedaço de papel de filtro semi porosas de 2,5 x 2,5 cm com o olho virado para cima. Certifique-se o tecido é seguro e não escorregar inclinando-o ligeiramente.
- Usando a pinça, coloque cuidadosamente o tecido do olho e o papel de filtro em cima da malha de arame de aço em 1 dos pratos Petri 35mm, criando um palco Erguido com o tecido do olho em cima.
- Repita as etapas de 4.3 e 4.4, com a outra metade de cabeça.
- Utilizando uma pipeta de vidro estéril, cuidadosamente adicione meio nutritivo diretamente em cada placa de Petri 35mm até atingir o nível do filtro de papel. Não mergulhe a cabeça meia no meio de nutrientes.
- Adicione 50 µ l de 10.000 U/mL de penicilina-estreptomicina no meio de nutrientes em cada placa de Petri.
- Dobre um pedaço de papel de seda em um pequeno quadrado e coloque-a dentro do prato de Petri de 100mm. Umedecê-la com água destilada esterilizada.
- Coloque o prato de cultura dentro da incubadora estéril, escura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade por até 4 dias.
- Repita as etapas 3 e 4 para cada embrião.
Nota: O número de embriões necessários dependerá da experiência específica; aqui, descrevemos o protocolo para 12 embriões.
5. cultura manutenção
- Uma vez por dia, encha os recipientes de plástico na incubadora com água destilada esterilizada.
- Verifique diariamente todas as culturas para infecções bacterianas ou fúngicas. Culturas que têm desintegrou-se ou em que o meio mudou de cor estão infectadas. Descarte todas as culturas que estão infectadas.
6. fixação
- Após o cultivo, remover todos os pratos da incubadora.
- Usando um par de pinças, remova suavemente o olho do papel de filtro, tomando cuidado para não rasgar o tecido.
- Reparar o tecido do olho em paraformaldeído 4% em 1x tampão fosfato salino durante a noite a 4 ° C ou em formol a 10% neutro de buffer durante a noite em temperatura ambiente.
- Armazene o tecido a 4 ° C em 1 x fosfato salino.
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Representative Results
Usando esse método, olho embrionárias de galinha pode ser cultivado desde o dia 8 do seu desenvolvimento (HH34) em vitro por 4 dias. Quatro dias de desenvolvimento no ovo corresponde ao HH38.
Este método de cultivo apoia o desenvolvimento de brotos de pena em torno do olho e nas pálpebras (figura 1B). Estes botões de penas não estão presentes no ovo em HH34 antes do cultivo (figura 1A), indicando que o desenvolvimento do broto de penas é iniciado durante o período de cultivo, como é no ovo13 (Figura 1). As pálpebras e membrana nictitante crescer para cobrir o olho durante o cultivo (figura 1B). As pálpebras aparecem mais maduras após o em vitro cultivo do que no início do cultivo em HH34 (figura 1A), mas são menos desenvolvidos do que em HH38 (Figura 1). Este dados mostram que os principais aspectos do desenvolvimento embrionário são suportados, embora com um pequeno atraso.
Após o cultivo, dissequei a porção anterior do olho para mostrar as papilas conjuntivais (um anel transiente de saliências epiteliais de 13-14), que actuam como mais um marco indicando que os eventos do desenvolvimento são suportados em cultura. Normalmente, estas papilas estão completamente formadas por HH34 (Figura 1) e degenerado ao longo do tempo como eles induzem condensações de skeletogenic na mesênquima subjacente; Eles desaparecem por HH381 (Figura 1F). Nossos dados mostram que essa degeneração ocorre em vitro (Figura 1E) e é precedida por um achatamento das papilas seguindo o padrão no ovo de desenvolvimento. Inocente de condensações, no entanto, não são visíveis nas amostras em vitro , ao contrário de em HH38 (Figura 1F). Usamos a fosfatase alcalina, coloração, que detecta atividade osteoblástica precoce para avaliar a indução destas condensações14; Este processo ocorre juntamente com a degeneração do papilas conjuntival no ovo. A indução de condensações o skeletogenic, que começa na HH34 (Figura 1), prosseguir em vitro , como evidenciado pela fosfatase alcalina coloração (Figura 1-H). Essas condensações, no entanto, são não tão grande como eles estão em HH3814 (Figura 1I), novamente indicando que há um pequeno atraso no desenvolvimento. Estimamos que os 4 dias de cultivo representam cerca de 2 dias de desenvolvimento embrionário; Portanto, um atraso de cerca de 50%. Coletivamente, esses resultados mostram que a indução e o desenvolvimento dos ossos intramembranosa, as condensações scleral, é suportado em vitro e que os processos de desenvolvimento como crescimento da pálpebra e formação de botões pena avançar em Vitro.
Figura 1 . Características morfológicas de em vitro cultivadas, olhos, olhos HH34 e olhos HH38. A - F são imaculado e G - eu estão manchadas para a enzima fosfatase alcalina (AP) distinguir os osteoblastos ativos dentro os scleral condensações. A, De G mostrar os olhos no início do período de cultivo em HH34. B, Ee H mostram os olhos após 4 dias de em vitro cultivo. C, Fe mostram os olhos depois de 4 dias no ovo de cultivo, em HH38. Todos os olhos são vistos lateralmente. (A) a conjuntival papilas são visíveis em um anel em torno da córnea. Um asterisco indica papila #12, o primeiro de que forma. A seta indica a borda da pálpebra na região nasal do olho. (B) as papilas conjuntivais têm aplainado e começou a se degenerar. A seta indica um crescente broto de penas. (C) o conjuntival papilas completamente degenerado e são cobertas por pálpebras e membrana nictitante. A seta aberta indica a borda da pálpebra na região nasal do olho. A seta sólida indica um crescente broto de penas. (D) um dissecado porção anterior do olho HH34. O asterisco indica papila #12. (E) A dissecados da porção anterior de um HH34 + 4 em vitro olho mostrando papilas achatadas. As papilas na região temporal (seta sólida) começaram a se degenerar; Estas são as mais antigas papilas no ringue. (F) uma dissecado da porção anterior do olho com as pálpebras e as membranas nictitante removidas, mostrando que todas as papilas degenerado de HH38. As linhas tracejadas delinear a posição de dois adjacentes condensações imaculadas. (G) A HH34 olho manchado para AP mostrando skeletogenic muito pequenas condensações indicativos do início da indução. (H) A HH34 + 4 olho manchado para AP mostrando alargada, crescendo skeletogenic condensações. (eu) A HH38 olho manchado para AP mostrando skeletogenic grandes condensações. Todas as barras da escala são 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo faz uso de tecido estabelecido técnicas de cultivo para o crescimento de um olho galinha embrionário dia 8 (HH34) em vitro por 4 dias. Este método de cultivo a grade foi originalmente descrito por Trowell15. Nós aperfeiçoamos um protocolo de Pinto e do Hall 1991 estudo16 utilizando uma membrana semi porosa com a grade para estudar sinais indutivos entre camadas de tecido separada da galinha embrionários olho15. Usando esse método, Roach cultivadas de fêmur de frango 14 - velho dia6. Esse método também provou ser eficaz em cultivo rato tecidos6,17. O uso do filtro de papel é fundamental para o sucesso do protocolo como ajuda o tecido para assumir nutrientes do meio efetivamente sem saturar ou submergir o tecido.
Meio nutritivo em um pH adequado é fundamental para o crescimento ideal. O meio deve ser próximo do pH fisiológico e o uso do vermelho de fenol a médio ou como um indicador proporciona uma vantagem em que as alterações de pH podem ser facilmente detectadas. Mídia livre de soro pode ser usada, e mudando a mídia diariamente não é necessário e não afeta os resultados. O protocolo foi desenvolvido utilizando um meio comercialmente disponível (ver Tabela de materiais), que contém altos níveis de aminoácidos e glicose; sem suplementação adicional da mídia é necessária. A maioria das ocorrências de crescimento do tecido pobre usando este protocolo ocorreram quando os meios nutritivos foi também a um pH inadequado ou contaminado.
O olho pode sobreviver e crescer para até 4 dias em vitro, começando em embrionário dia 8, quando o protocolo é realizado sob condições ideais. Uma limitação do presente protocolo é que a capacidade de sobrevivência é impactada além de 4 dias de cultivo. Assim, os processos de desenvolvimento que abrangem um período de tempo mais longo exigirá modificações ao protocolo. Outra limitação do protocolo é a ausência de um fluxo sanguíneo ativo e vascularização. Os vasos sanguíneos são importantes para muitos processos de desenvolvimento, não apenas para o fornecimento de nutrientes para o tecido9, que é conseguido in vitro através de ação capilar através do papel de filtro em que assenta o tecido.
Este protocolo pode ser usado para estudar o desenvolvimento de órgãos inteiras ou pedaços grandes de tecido em vitro. Órgãos de vertebrados são altamente complexos, e seu desenvolvimento é regulamentado por muitos padrões spatiotemporal distintos. O estudo destas vias do desenvolvimento baseia-se na capacidade de manipular os sinais que regulação-los. Métodos atuais de limitam esta manipulação para áreas relativamente pequenas, localizadas e concentrações baixas o suficiente para evitar a mortalidade embrionária. Por exemplo, o método ex ovo de cultivo o embrião de frango inteiro em cultura18 ou o método de janela ovos19 realizar manipulações são limitadas em que o embrião de qualquer inteiro deve ser tratado, o que pode causar letalidade, ou somente uma pequena área localizada é tratada. A vantagem do protocolo aqui apresentado é que o efeito desses sinais pode ser estudado em órgãos inteiras ou grandes quantidades de tecido, sem afetar a viabilidade embrionária. Este protocolo não requer qualquer suplementação com dióxido de carbono, como em anteriores protocolos15. O atraso no desenvolvimento que observamos é uma vantagem em que podem ser estudados processos de desenvolvimento rápidos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Gregory Haller (Mount Saint Vincent University), por seu trabalho preliminar no desenvolvimento do protocolo. Os autores também gostaria de agradecer a Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) por seus conhecimentos técnicos e assistência com a filmagem e produção da parte do áudio/visual do manuscrito. Daniel Andrews foi suportado pelo financiamento do MSVU e as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) através de um prêmio de pesquisa de estudante de graduação. Tamara A. Franz-Odendaal é suportada por um fundo de descoberta NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
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