Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.
Abstract
O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.
Introduction
Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.
Ativar o 'perigo' sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .
Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.
Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.
Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.
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Protocol
Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.
1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs)
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
- Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Impostos especiais de consumo ossos tíbia-fíbula e fêmur usando uma tesoura cirúrgica e colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 10 cm.
- Use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o tecido fora tanto quanto possível na tampa do cm 10 cultura prato e isolar tíbias e fêmures de colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 6 cm.
- Use lâminas cirúrgicas para ambas as extremidades de tíbias e fêmures. Use 3 mL de PBS em seringa de 3 ml com agulha 23G para liberar o conteúdo da medula de uma extremidade dos ossos para um tubo cônico contendo 12 ml de PBS. Repita este passo 3 x para cada extremidade dos ossos.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise de 1ml ACK para 5 minutos para remover células vermelhas do sangue.
- Adicione 9 ml de PBS para diluir o tampão de Lise ACK e centrifugar 300 x g por 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender com 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% não-essenciais aminoácidos (x 100), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoetanol e 5% de penicilina/estreptomicina).
Nota: O nível de endotoxinas tem que ser menos de 0.1 EU/ml no FBS. - Passar a suspensão de células através de um filtro de célula 40 μm e levar 20 µ l de suspensão de células e misture com 80 µ l de trypan azul para contar o número de células vivas usando citômetro.
- Ajuste o número de células a 1 x 106 células/ml com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml.
- 3 ml de 1 x 106 células/ml em cada poço da placa de 6 a placa e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
Nota: As células da medula óssea de um rato é em torno de 3-5 x 107 células, indicando que pode ser colocada de 2 para 3 placas de 6 boas. - No dia 3, remova todos os 3 ml de meio de cultura de cada poço, adicionar 2 ml PBS fresca em cada poço, e em seguida agite suavemente a placa para garantir a remoção de todas as células não-aderentes.
- Substitua 3 ml de meio de cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 em cada poço de 10 ng/ml. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
- No dia 5, diretamente Adicione outro 3 ml meio cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml em cada poço. Incube as celulas em 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
Nota: O volume total em cada poço agora é 6 ml. - No dia 7, coloque o prato inteiro no gelo por 10 minutos. Pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar o frouxamente aderentes BMDCs como os iDCs em suspensão.
Nota: Os macrófagos aderentes ainda estão conectados à placa. Procedimentos e suavemente a baixa temperatura são a chave para evitar a ativação de DC para afetar ainda mais experiências. - Centrifugar a suspensão celular de 300 x g, durante 5 minutos e ressuspender com meio de cultura fresco para novas experiências.
Nota: BMDCs podem ser identificadas com fluorescência-etiquetada CD11c anticorpo por citometria de fluxo e mostramos nossa estratégia associada de BMDCs para novas experiências na Figura 1.
2. caracterizar o Gene TolDC e perfil de proteína
- Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
Nota: CDDO-DFPA, um sintético triterpenoides, é um fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 indutor de fator (Nrf2) e inibidor de fator nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a outros agentes para indução de TolDCs de iDCs, tais como IL-10, vitamina D3, dexametasona ou Baía 11-7085 e modificar esta etapa para uma condição ideal para cada agente. - Adicione 10 ou 100 ng/ml de LPS pela incubação 4-24 hrs para induzir mDCs (tempo de incubação é diferente devido a medição do mRNA ou proteína).
- Delicadamente, pipetar o meio de cultura em cada poço e colher a suspensão de células usando uma pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g, durante 5 minutos para coletar as células e o sobrenadante, respectivamente.
- Analisar as superfície ligantes de Pelotas o celular por citometria de fluxo, tais como ligantes estimulatórios: CD40, CD80 e CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligantes inibitórios: PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
- Isolar o RNA de Pelotas a célula e analisar o RNA e o sobrenadante amostras para os níveis de citocinas perfil e gene e proteína por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e ELISA, respectivamente.
Nota: por exemplo, citocinas inflamatórias: TNF-α, relato, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL-23 ou anti-inflamatórios citocinas: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.
3. avaliar a função de TolDCs In Vitro e In Vivo
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Ensaio de Syngeneic de proliferação de células T
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
- Prepare o buffer de MACS usando 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA em 500 ml de PBS. Esterilize o buffer por filtragem através de um filtro de 0,2 µm.
Nota: Mantenha o buffer no gelo durante o experimento a seguir. - Para obter o CD4+ T células, eutanásia em ratos transgénicos do OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica.
- Colocar o baço com 2 ml de PBS em um prato de cultura de 6 cm e usar a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o baço, passando um filtro de célula 40 μm.
- Recolha a suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min.
- Ressuspender as células em 400 μl de tampão de MACS.
- Adicionar 100 μl de CD4+ T Cell biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 5 minutos.
Nota: O anticorpo cocktail vincula em outros tipos de célula, exceto CD4+ T células, tais como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-classe II, Ter-119 e TCRγ/δ. - Adicione 300 μl de tampão de MACS e 200 μl de antigrânulos biotina (Tabela de materiais) a 4° C por 10 minutos.
- Lugar da coluna composta de esferas ferromagnéticas (Tabela de materiais) e filtro de pré-separação juntos no magnético campo e enxaguá-lo com 3 ml de tampão de MACS.
- Adicione 9 ml de tampão de MACS nas células e centrifugar 300 x g por 5 min.
- Ressuspender as células em 3 ml de tampão de MACS e aplique na coluna. Coleta de passagem contendo CD4+ T células.
- Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS e também coletar o escoamento.
- Para obter o pan esplênica DCs, eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica. Coloque o baço em um prato de cultura de 6cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (colagenase 2 mg/ml D dissolvido em HBSS contendo cálcio, magnésio).
- Injecte 1 ml da solução de colagenase D o baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Corte o baço em pequenos pedaços com uma tesoura pequena.
- Agitar e incubar a temperatura ambiente por 25 minutos.
- Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M à temperatura ambiente por 5 minutos.
Nota: Os passos de 3.1.13-3.1.14 são essenciais para aumentar o rendimento do DCs. - Agora use a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o chorume do baço, passando um filtro de célula 40 μm e coletar a suspensão de células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos.
- Ressuspender as células em 350 μl de tampão MACS, 50 µ l de reagente de bloqueio de FcR e 100 μl de Pan células dendríticas biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 10 minutos.
Nota: O anticorpo cocktail contra antígenos que não são expressas por DCs. - Lave as células pela adição de 9 ml de tampão de MACS e centrifugar a 300 x g por 5 minutos.
- Ressuspender as células em 800 μl de tampão de MACS e adicionar 200 μl de antigrânulos biotina a 4 ° C por 10 minutos.
- Repita as etapas de 3.1.9-3.1.11 para coletar DCs.
- Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS duas vezes e também coletar o escoamento.
- Tratar a 2 x 105 DCs/ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C para 1 hr separadamente, rótulo o CD4+ T células (1 x 107/ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajustar o volume para obter a concentração final de 2 x 106 T células/ml.
- Em seguida, em uma placa de 96 poços, co cultura 100 μl de células dendríticas tratadas com o mesmo volume de CD4 CFSE-rotulado+ T cells, ambos colhidos os passos acima para obter 01:10 proporção. Agora adicione 100 ng/mL ovalbumina (OVA) peptídeo 323-329 por bem e medir a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação.
Nota: O número de células e a relação de DCs e T células foram otimizadas de nossa anterior trabalho37.
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Induzir o passivo EAE injetando BMDCs pulsada com mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) (35-55)
- Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 hr.
- Adicionar 10 ng/ml de LPS para incubação 24 hrs.
- Adicionar 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubação 4 hrs.
- A suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min. da colheita.
- Ressuspender as células com PBS e contar as células.
- Por via subcutânea injete 200 μl de 2 x 106 células de camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas de idade (100 μl em cada pata traseira).
- No dia da injeção de BMDC e 48 hrs. mais tarde, injetar 200 ng de toxina pertussis (PTX) em cada rato.
- Repita etapas 3.2.6-3.2.7 uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
- Avalie os sintomas clínicos da EAE diariamente usando critérios padrão37 (0.5-manco cauda final, cauda 1-manco, fraqueza do membro posterior de 2-moderado, 3-grave membro posterior fraqueza, paralisia dos membros posteriores de 4-completo, estado 5-quadriplegia ou moribundo, morte-6).
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Representative Results
A diferenciação e seleção de BMDCs:
Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de forma e também aumentou a população de CD11c+ células. No dia 4, BMDCs foram ampliadas em tamanho e iniciou a formação de cluster. Aderidas macrófagos também foram convertidos e observados na parte inferior da placa com uma forma alongada. No dia 5, formam-se grandes aglomerados tamanhos de BMDCs. No dia 6, um grande número de BMDCs flutuantes e semi aderentes também foram observado. BMDCs foram colhidas no dia 7 e analisadas por citometria de fluxo para CD11c expressão como um marcador específico de murino DCs. Como mostrado em uma trama de citometria de fluxo representativo na figura 1B, cerca, 83,6% dos BMDCs expressando CD11c foram obtidos por esse método.
Indução e caracterização genética de TolDCs:
Alguns dos agentes conhecidos por induzir TolDCs, tais como a vitamina D338 e dexametasona39, são conhecidos por para baixo-regula a expressão de ligantes de superfície DC, incluindo MHC II e moléculas de co-estimulação CD40, CD80 e CD86. Por outro lado, no contexto de LPS ou ou induzida por CD40L maturação de DCs, inibidores de calcineurina ciclosporina A e FK506 não mostraram nenhum efeito sobre a expressão de CD83, CD80, CD86 e MHC II33. Como demonstrado pela análise de citometria de fluxo, a indução de TolDC por CDDO-DFPA não teve nenhum efeito significativo na expressão de DCs, incluindo CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 ligante superfície induzida por LPS. (Figura 2).
Além disso, a análise comparativa de transcriptoma e citocinas de BMDCs tratados com ou sem CDDO-DFPA na presença ou ausência de LPS retratado o perfil do gene inflamatória modulada. Tratamento de CDDO-DFPA reduziu significativamente LPS induzida por citocinas pró-inflamatórias genes como IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFa, IL-6 e IL-23 (Figura 3A-3F). Estes são conhecidos citocinas para Th1 (IFN-γ e IL-12) e Th17 (IL-6 e IL-23) diferenciação de células. Além disso, o CDDO-DFPA tratamento BMDCs mostrou a maior expressão de genes de citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-4, IL-10, TGF-β e HO-1 (Figura 4A-4D). Estes genes anti-inflamatórios são conhecidos modulador de auto-imunidade, promovendo Th2 (IL-4) e a diferenciação de células Treg (IL-10 e TGF-β). 40 aqui é importante notar que o distintivo de IL-12−; de produção de citocinas IL-10+ 36, a indução da expressão de HO-113e a inibição da EDN-141 induzida pelo tratamento CDDO-DFPA, são todos conhecido para autenticar DCs tolerogenic função.
Caracterização funcional e celular de TolDCs em vitro
Proliferação celular de T mediada por DC é conhecida por ser desencadeada pelo noivado de co-estimulação ligante de superfície, bem como a secreção de citocinas e mediadores solúveis7. No entanto, TolDCs inibir respostas de células T através de vários mecanismos: através da indução de células T anergy, promovendo ativamente a exclusão de células auto-reativas e promovendo a polarização de ingênuo T células Tregs42. Já informamos a caracterização funcional de CDDO-DFPA induzida por TolDCs37. Anergy de células t e exclusão de células auto-reativas T podem ser analisados independentemente pela verificação de marcadores de superfície ou coloração anexina V/7-AAD. No entanto, confirmamos indiretamente este fenótipo medindo o índice de proliferação de células T. Por isso, nós utilizados ratos transgénicos OTII C57BL/6 células T e expô-los a DCs syngeneic extraído de camundongos C57BL/6 e tratados com ou sem CDDO-DFPA. Esses DCs foram lavados e co cultivadas com CFSE manchada de células T com um peptídeo de óvulos. Observou-se uma redução significativa na proliferação de células T por DCs pré-tratados CDDO-DFPA, sugerindo seu fenótipo tolerogenic (Figura 5).
Na vivo caracterização funcional de TolDCs em um modelo pré-clínicos de auto-imunidade
Finalmente, a funcionalidade de TolDCs induzida por DFPA pode ser testada em qualquer um de um número de pré-clínicos em vivo modelos caracterizadas auto-imunes ou inflamatórias características. Desde então, EAE é um modelo murino pré-clínicos amplamente aceitado da doença do sistema nervoso central clínica imune-mediada, MS43, isto utilizamos em nosso estudo atual. A fim de continuar a analisar o na vivo funcionalidade de CDDO-DFPA induzida TolDCs, nós desafiou-os em um modelo murino pré-clínicos da EAE passiva. Por isso, BMDCs foram cultivados com ou sem CDDO-DFPA na presença de LPS e MOG (35-55). Essas células foram então injetadas repetidamente como protocolo regular representado na figura 6A e ratos observaram-se rotineiramente para a manifestação dos sinais clínicos. Como esperado, LPS e MOG (35-55) pulsada BMDCs mostrou sintomas clínicos da EAE, entretanto; CDDO-DFPA aprontado BMDCs tratados grupo mostrou início retardado de doença com sintomas clínicos significativamente reduzidas (Figura 6B). Esses resultados validam o fenótipo imunossupressora de TolDCs induzida por tratamento CDDO-DFPA.
Figura 1: desenvolvimento e Caracterização fenotípica de BMDCs: (A) células da medula óssea foram expelidas de ossos tíbia e fêmur de camundongos C57BL/6 e ainda mais diferenciadas para BMDCs. Uma formação de aglomerado de célula apropriada foi rastreada pela microscopia de luz durante todo o período de diferenciação (escala bares, 100µm). (B) a diferenciação de BMDCs foi confirmada pela expressão superfície CD11c, como analisado por FACS. Gráficos retratam o percentual do CD11c expandido+ população da pilha. (C) Gating estratégia de células BMDCs. foram primeiro condomínio fechado para excluir os restos (FSC vs CCD). Um portão de exclusão dubleto foi utilizado para portão em camisolas células (FL2-W vs. FL2-A). Dentro das células singlet, células vivas foram bloqueadas na trama AAD-7 (7-AAD vs FSC). Então as células ainda mais foram analisadas e fechadas na expressão CD11c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: DC célula superfície ligante expressão é inalterada por CDDO-DFPA. As células foram previamente tratadas na presença ou ausência de CDDO-DFPA (200 nM) por 1 hora antes da estimulação com LPS (100 ng/ml) por 24 hrs. Superfície de célula de expressão de CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 foi analisada por citometria de fluxo. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CDDO-DFPA alterou o fenótipo genético e proteína de imunogênicas DCs. BMDCs pre-foram tratados na presença ou ausência de CDDO-DFPA (50-400 nM) por 1 hora antes da adição de LPS (100 ng/ml), e também colhido para extração do RNA (4 hrs.) ou permitiu a condição de meio de cultura para 24 hrs. antes da coleta para análises de citocina. Os níveis de IL-12 (B), TNFa (D), IL-6 (E) e IL-23 (F) foram medidos por qRT-PCR e ELISA. Considerando que o nível de IFN-γ (A) foi medido por qRT-PCR e EDN-1 (C) por ELISA sozinha. Os resultados são expressos em média ± D.P. de três experimentos. * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 em comparação com os grupos tratados com LPS. Teste-t de student não pareado. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicado com a permissão dos direitos autorais." Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: CDDO-DFPA induzido fenótipo TolDCs confirmado pela expressão de gene e proteína. BMDCs foram previamente tratadas na presença ou ausência de CDDO-DFPA (10-400 nM) por 1 hora antes da adição de LPS (100 ng/ml), e as células foram colhidas para a extração de RNA após 24 hrs. Os níveis de IL-4 (A), IL-10 (B) e TGF-β (C) foram medidos por qRT-PCR. (D) célula proteína lisados foram coletados em 12 hrs. para as análises e os níveis de HO-1 e β-actina expressão era determinada pela mancha ocidental. Os resultados são expressos em média ± D.P. de três experimentos. * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 em comparação com os grupos tratados com LPS. Teste-t de student não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: CDDO-DFPA expostos DCs suprimir a proliferação de células T. DCs foram pré-tratados com CDDO-DFPA (100-400 nM) por 1 hora apenas e, em seguida, lavado e co culta com CFSE manchadas de células T em um 01:10 proporção. (A) esplênica de células T e DCs foram isoladas de ratos transgénicos C57BL/6 OTII e camundongos C57BL/6, respectivamente. CDDO-DFPA DCs pré-tratados co foram cultivados com CFSE manchadas de células T com (com) ou sem (w/o) adição de óvulos durante a incubação. Proliferação de células t foi determinada pela citometria de fluxo no dia 2. Gráficos retratam o percentual da divisão de células T em relação ao números de divisão de células T. Os dados são uma representação de 3 experimentos independentes. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: MOG aprontado passiva induzida por DC EAE é revogada por TolDCs. (A) indução EAE por MOG (35-55)-pulsada BMDCs. BMDCs maduros foram tratados na presença ou ausência de CDDO-DFPA (400 nM) e posteriormente pulsado com MOG (35-55) por 4 horas. Um total de 200 μl de 2 × 106 células foi administrado por via subcutânea em região de flanco de camundongos C57BL/6 uma vez cada semana durante um total de quatro injeções. Cada vez, PTX foi administrado por injeção i.p. imediatamente e novamente 2 dias depois (dia 0 no 4º ciclo). (B) clínicos foram gravadas afinal quatro injeções, usando critérios padrão. Todos os dados foram apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0,05. Vários testes t com análise Holm-Sidak (n = 7 ratos em cada grupo). Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalmente, a função de imunorreguladores de TolDCs foi confirmada, demonstrando a sua capacidade de reduzir a célula T proliferação em vitro e sua eficácia para suprimir a auto-imunidade em in vivo, utilizando o modelo EAE pré-clínicos murino de MS.
Em nosso protocolo, iDCs foram gerados e diferenciadas de precursores de murino da medula óssea com a combinação de GM-CSF e IL-4. Outros protocolos usaram ligantes de formulários, como tirosina quinase 3 (Flt3L) em meio de cultura para gerar iDCs44. Embora o uso de Flt3L aumenta o rendimento de iDCs, estes CIDS geralmente levam 2 mais dias (9) a colheita, em comparação com GM-CSF/IL-4 adição (7 dias)44. Mais importante, iDC gerado a partir de Flt3L muitas vezes diferenciar em ambos os conjuntos (CD8– e CD8+) e pDCs45 que eram funcionalmente e fenotipicamente equivalentes ao estado estacionário DCs in vivo. No entanto, GM-CSF/IL-4 invariavelmente induz a diferenciação da iDC para conjuntos (CD8–) apenas44 e durante a maturação, eles demonstraram caracteres similares de inflamatória DCs46. Vale ressaltar que saiba que o GM-CSF/IL-4 geralmente é usada em ensaios clínicos e de pesquisa básica por causa da vantagem de diferenciar o DCs de monócitos ou CD34+ progenitores44. Ficou demonstrado que iDCs gerados a partir desses dois métodos produzem células morfologicamente diferentes, que também possuem marcadores de superfície celular diferentes e apresentam perfis distintos de citocina após sua ativação. Além disso, TolDCs induzidas por esses métodos variam em sua capacidade de migrar em resposta a Fatores Quimiotáticos e induzir a célula de T antígeno-específicos respostas44,45. Nós entendemos que CD8+ DCs podem apresentar mais potencial na indução de TolDC devido à sua capacidade única de cross-tolerance47. No entanto, então é necessário mais celular classificação de BMDCs derivado de Flt3L para investigar o CD8 específicas+ DC subconjunto. Além disso, desde então, GM-CSF/IL-4 induzida BMDCs são superiores na estimulação de células T e a produção de mediadores inflamatórios seguindo LPS tratamento44,45, encontramos esta estratégia deu resultados mais reprodutíveis nosso experimentos.
BMDCs derivados de GM-CSF/IL-4 início de expressar CD11c dia 4 e para enriquecer a expressão após dia 648. Este procedimento de cultura pode ser sustentado até dia 10-12 com uma menor densidade de chapeamento de células da medula óssea e uma baixa dose de GMC-SF no dia 8-1049. Neste protocolo, CDDO-DFPA (triterpenoides sintético) e LPS foram adicionados em tandem, como agentes para induzir tolerância DC e maturação, respectivamente. Recentemente, informou que os iDCs colhidas das culturas utilizando este método de geração de BMDC apresentam um fenótipo de TolDC funcional quando pré-tratados com CDDO-DFPA37. Vale ressaltar que o CDDO-DFPA, que só foi adicionado à culturas após colheita de iDC (dia 7)37, em contraste com agentes como vitamina D3, que deve ser adicionado à culturas várias vezes durante a iDC diferenciação (dia 2, 4, 6)50. Além disso, esta indução de TolDCs pela vitamina D3 pode depender de diversos mecanismos que devem ser iniciados durante e após a diferenciação de iDC51. Nossos dados sugerem que adicionar CDDO-DFPA durante a diferenciação do iDC não teve impacto sobre a pureza de CD11c + DCs dose-dependente diminuir o rendimento de iDCs no dia 7 (dados não mostrados). Nossas análises também sugerem que a maior concentração de CDDO-DFPA usado nesses experimentos pode ser tóxica para as células progenitoras de medula óssea, mesmo que o iDC mostrou viabilidade normal com esta concentração de CDDO-DFPA37. Prevê-se que a indução de TolDC pode ser otimizada por análises cuidadosas do impacto do tempo e duração da exposição a agentes como o CDDO-DFPA.
É importante considerar os métodos alternativos e os mecanismos através dos quais CIDS podem ser induzido a mDCs pelos outros do que de LPS, como CD40L, TNF-α e IFN-γ52. Maturação de DC por LPS através de receptores Toll-like 4(TLR4) leva a ativação de diversos fatores de transcrição, incluindo o fator nuclear-κB (NF-κB), p38 mitogen-ativado proteína quinase (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) e extracelular sinal-regulado de proteína quinase (ERK1/2). A maturação dos DCs por CD40L e TNF-α através de receptores CD40 e TNF induz respectivamente da via do NF-κB. Em contraste, IFN-γ estimula um caminho diferente, incluindo a ativação da quinase de Janus (JAK), tirosina quinase (TYK) e o transdutor de sinal e ativador de proteínas de transcrição (STATs), e estes efeitos a jusante também são complementados por ativação do NF-κB via52. Além disso, enquanto o perfil de expressão de gene de maturação CD40L TNF-α-base/DC sugere que esses DCs polarizar as células T em direção a uma célula de Th2 resposta53, maturação DC por IFN-γ é fortemente inclinada para um de resposta Th1 célula54. Portanto, esses outros indutores de maturação DC, que estão ligadas à diferenciação na direção de subconjuntos de célula T específica não são empregados no presente protocolo.
Vários relatórios têm demonstrado que ex vivo-DCs diferenciadas são capazes de induzir o espectro completo de sintomas clínicos de EAE e patologia em ratos55. O método de indução de EAE passiva por ex vivo ativado DCs tem sido adotado com várias modificações por diferentes laboratórios. A combinação de indução de EAE passiva e ativa pela administração de MOG preparado BMDCs, 7 dias antes da imunização com MOG e completa adjutor de Freund (CFA) resulta em maiores escores de sintomas clínicos (escore clínico de pico: 3.5) em comparação com a EAE passiva indução pela administração do MOG aprontado BMDCs sozinhos (escore clínico de pico: 2)56. Resultados com este método combinando MOG aprontado BMDCs com MOG imunização sugere o início da doença acontece no dia 9, após a imunização com MOG e CFA56. No entanto, uma vez que é sabido que o CFA provoca inflamação significativa no local de administração57, nós utilizaram passiva indução EAE pela administração de DCs sozinhos em nosso protocolo a fim de efetivamente analisar o efeito da TolDCs durante a EAE. A fim de confirmar ainda mais o fenótipo funcional de TolDCs, um deve também testá-los em suprimir os sintomas clínicos de ratos EAE ativos. A via de administração de DCs é também fundamental para a indução de sintomas EAE58. Conforme relatado pelo nosso laboratório e por outros, injeção subcutânea de BMDCs para a região de flanco de camundongos C57BL/6 uma vez por semana para um total de 3-4 injeções induz uma pontuação clínica pico da EAE em torno de 2-2.5 com o aparecimento da doença podem ser reproduzidos no dia 11-1237 ,58. Nós fornecemos um pequeno clip para demonstrar os diferentes sintomas clínicos entre ativo e passivo indução de EAE (vídeo 1).
As reconhecidas limitações do nosso protocolo incluem o tempo necessário pelos métodos utilizados e a dependência de um microambiente não-fisiologicamente relevante para a diferenciação de BMDC. No entanto, quando o anticorpo enriquecido métodos de separação da coluna de coleção para DCs e células T de murino baço podem ser mais eficiente uma vez, sofre um baixo rendimento da população DC desejado. Assim, a vantagem do método de desenvolvimento de DC derivadas da medula óssea é o rendimento mais elevado da escala log das populações DC quando comparado à separação de coluna anticorpo do baço inteiro. Conforme observado acima, as DCs geradas em vitro por esse método requer uma alta concentração de suplementação de citocinas, que não é fisiologicamente relevante para DCs na vivo microambiente59 e também não garante a longo prazo sustentabilidade da DC. O GM-CSF usado em nosso protocolo também não é uma citocina essencial para normal DC diferenciação na vivo60. No entanto, o protocolo de geração de BMDC proposto reproducibly produz uma alta fração de funcionalmente TolDCs e deve ser visto como um método altamente confiável e reprodutível para gerar DCs funcionais com propriedades tolerogenic.
Em conclusão, o TolDCs gerado a partir do protocolo descrito aqui pode ser efetivamente caracterizado avaliando seus perfis de expressão de gene e proteína, determinando a sua capacidade de modular a célula T-dependente respostas imunes em vitroe avaliar sua função como uma terapia celular adotiva para suprimir EAE indução na vivo. Nosso protocolo fornece uma estrutura para a avaliação de quaisquer novos agentes pensado para ter a capacidade de induzir TolDCs e ainda mais, acelerar o processo de desenvolvimento terapêutico para TolDCs do banco, a clínica.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
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