여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.
면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.
모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포1로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템22 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)3설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각4일 4.
‘위험’을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해 성숙한 Dc (mDCs)으로 면역성 Dc 향해 iDCs 성숙 드라이브 것 이다와 같은 DC 표면5. 면역성 Dc 더 프라임 naïve T 세포 확산 및 MHCII2, costimulatory ligands (CD80, CD86, CD40)6, cytokines, 및 다른 수용 성 중재자7의 upregulation 통해 감 별 법. 면역성 Dc에서 프로-염증 성 중재자 생산의 T 세포 중재 하는 cytokine 분화에 대 한 필수적입니다. 예를 들어 IFN-γ와 IL-12은 Th1 차별화8 및 일리노이-1, 필요 일리노이-6, 및 IL-23가 순진한 Th17 세포9으로 T 세포 양극 화 합니다. 성숙한 Dc 외국 항 원에 반응, 비록 자기 항 원에 의해 통제 DC 활성화 수 있습니다 허용 오차 제거 원인과 그 활성화 조직 파괴10 리드 autoreactive T 세포를 생성 하 여 자가 면역 질환의 개발 육성 .
최근 보고서 그들의 능력과 그들의 조직 microenvironment 내에서 다른 큐와 상호 작용 하는 다른 이펙터/억압 DC 하위 집합으로 구분 하 여 exemplified 하는 DC가 소성의 분명 한 증거 제공. 안티-염증 성 중재자, IL-1011, TGF-β12,13 호-1 등 tolerogenic Dc (TolDCs)를 유도 하 여 면역 억제에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 이 TolDCs는 규정 하는 기능을 취득 하 고 T 세포 확산14억제. 또한, DCs에 의해 공동 자극의 부족 TolDCs에서 안티-염증 성 중재자의 생산 모두 규제 T 세포 (Tregs)의 감 응 작용을 하 고도 효과적으로 억제 하는 Th1과 Th17 차별화 및 확장15. 과거 2 년간, TolDCs의 치료 잠재력 보고 되었습니다 여러 수 사관. 이러한 연구에서 전 비보 의 자가 면역 질환16 의 다른 전 임상 모델에서 TolDCs 뿐만 아니라 ameliorated 병 적인 증상을 생성 하지만 환자17 면역 관용의 개발을 ,18. 흥미롭게도, 오늘 TolDCs 치료는 되었습니다 간주 대체 또는 대체 접근 방식으로 자가 면역 질환 등 여러 가지 임상 실험에 타입 1 당뇨병 mellitus19, 류 마티스 관절염20, 21, 다 발성 경화 증 (MS)22,,2324, 그리고 Crohn의 질병25.
다양 한 프로토콜을 TolDCs를 개발 하기 위해 고용 되어 있으며 여러 실험실 생성 및 TolDCs의 phenotypic 특성에 대 한 방법을 보고 있다. Reproducibly 조 혈 창시자에서 생체 외에서 TolDCs 생성 하 고 안정적으로는 tolerogenic 상태 vivo에서26,,2728,29에서 그들을 유지 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. iDCs 다양 한 immunomodulatory 약리학 대리인 또는 항 염증 성 cytokines에 노출에 의해 TolDCs로 변환할 수 있습니다. 예를 들어 비타민 d 3는 IL-10 생산을 증강 하 고 Dc에서 IL-12 분 비를 억제 하 고 그로 인하여 그들의 면역 기능30높일 수 알려져 유명한 약리 에이전트. 또한, Dc lipopolysaccharides (LPS) 등 강력한 염증 성 자극에 노출 되 면 dexamethasone31, rapamycin32, 코르 티 코 스테로이드33 등 여러 가지 약리 에이전트 표시 되었습니다 유도 하는 CD40, CD80 그리고 CD86, MHCII34의 DC 표면 식 줄여 TolDC 표현 형. IL-10과 TGF-β는 DC 내성35 와 이러한 cytokines의 둘 다에 수 반하는 노출 유도를 대부분 공부 항 염증 성 cytokines Dc36에서 tolerogenic 표현 형을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.
DC phenotypic 표식으로 있다 보다는 기능적 특성에 의해 정의 됩니다 tolerogenic 이후 큰 TolDCs의 세포 및 기능 특성에 대 한 일관 된 방법을 개발 해야 합니다. 또한, 엄격 하 고 일관 된 프로토콜을 설정 해야 합니다 일관 된 평가 및 tolerogenic DC 형의 특성에 대 한 만약 우리가 효과적으로 그리고 reproducibly에서 TolDC 표현 형을 유도 하기 위해 새로운 에이전트의 능력을 비교 하는 실험실입니다. 여기 우리가 제공 상세한 프로토콜 단계별 방법 iDCs 마우스의 조 혈 창시자에서 분리 하 고 이후 TolDCs로 iDCs를 변환 하는 그들의 능력에 대 한 평가에서 새로운 에이전트의 효능을 분석 하는 강력한를 제공 하 TolDCs의 기능 그리고 phenotypic 특성 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 설명에는 그들의 표면 ligands, cytokine 단면도, 및 면역 기능에 생체 외에서TolDCs 하는 정교한 메서드가 포함 됩니다. 우리는 또한 MS, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)의 전 임상 모델에서 이러한 TolDCs의 잠재적인 치료 응용 프로그램을 탐색 하는 방법의 예를 제공 합니다. 이 설립된 프로토콜 조사 TolDCs의 유도 홍보 하기 위해 새로운 에이전트의 용량을 평가 하는 데 도움이 됩니다 그리고 TolDC 치료 개발의 범위를 확대 하기 위해 노력을 촉진 한다.
이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 …
The authors have nothing to disclose.
우리가 제공 하는 CDDO-DFPA Reata 제약 감사. 우리는 또한 제인이 Seidman의 자 소아 암 혁신 (John Letterio)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 국방부의 [W81XWH-12-1-0452];에 의해 지원 되었다 앤 지 파울러 사춘기와 젊은 성인 암 연구 이니셔티브 경우 종합 암 센터; 그리고 F.J. 칼라 재단에서 Hsi 주 웨이 대 한 칼라 대학원 학술 상.
CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |