Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla och karakterisera tolerogena dendritiska celler (TolDCs) och utvärdera deras immunoterapeutisk nytta.
Abstract
Immunförsvaret fungerar genom att upprätthålla en stram balans mellan samordnande svaren mot främmande antigener och att upprätthålla ett tillstånd som inte svarar mot själv-antigener samt antigener som härrör från kommensaler organismer. Störningar av denna immun homeostas kan leda till kronisk inflammation och utveckling av autoimmunitet. Dendritiska celler (DCs) är de professionella antigen-presenterande cellerna av det medfödda immunförsvaret som är inblandade i Aktivera naiva T-celler för att initiera immunsvar mot främmande antigener. DCs kan dock också differentieras till TolDCs att agera att upprätthålla och främja T cells tolerans och att undertrycka effektor celler bidrar till utvecklingen av antingen autoimmuna eller kronisk inflammation villkorar. Senaste befordran i vår förståelse av TolDCs tyder på att DC tolerans kan uppnås genom att modulera deras differentiering villkor. Detta fenomen har lett till enorma tillväxten i utveckla TolDC terapier för talrika immunsjukdomar som orsakat på grund av att bryta i immuntolerans. Framgångsrika studier i prekliniska autoimmunitet murina modeller har ytterligare validerade verktyget immunoterapeutisk av TolDCs för behandling av autoimmuna sjukdomar. TolDCs har idag blivit ett lovande immunoterapeutisk verktyg i kliniken för att återinföra immuntolerans i olika immunsjukdomar genom att rikta patogena autoimmuna svar medan skyddande immunitet intakt. Även om en rad strategier har föreslagits av flera labs att framkalla TolDCs, finns det ingen konsekvens i karaktärisera den cellulära och funktionella fenotypen av dessa celler. Detta protokoll ger en steg för steg-guide för utveckling av benmärgen-derived DCs i stora skaror, en unik metod som används för att skilja dem i TolDCs med en syntetisk triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic syra-difluor-propyl-Amid (CDDO-DFPA), och de tekniker som används för att bekräfta sin fenotyp, inbegripet analyser av väsentliga molekylära signaturer av TolDCs. Slutligen visar vi en metod för att bedöma TolDC funktion genom att testa deras immunosuppressiva svar in vitro- och in-vivo i en preklinisk modell av multipel skleros.
Introduction
Dendritiska celler (DCs) är en integrerad del av det medfödda immunsystemet och först upptäcktes och kännetecknas av Ralph Steinman och Zanvil Cohn 1973 som primära professionella antigen presenterande celler1. DCs har visat sig spela en viktig roll i immunsystemets aktivering genom att presentera bearbetade antigener att T-celler och B-celler via stora histocompatibility komplex (MHC) i sekundära lymfoida organ att länka den medfödda och adaptiv immunsystem2. I däggdjur immunsystemet finns det minst två kategorier av DCs som har beskrivits som myeloisk DCs och dess DCs (PDC)3. Myeloisk DCs, även känd som konventionella DCs (cDCs), kännetecknas av uttrycket av CD11c och kan skiljas som omogna DCs (iDCs) in vitro från stamceller i benmärg eller perifert blod monocyter med hjälp granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) och IL-4 i murina eller mänskliga arter, respektive4.
Aktivera 'fara' signaler, såsom patogen-associerade molekylära mönster (PAMP) eller skada-associerade molekylära mönster (DAMP), kommer att driva iDCs mognad mot immunogent DCs som mogen DCs (mDCs) via bindande olika mönster erkännande receptorer den DC yta5. Immunogent DCs ytterligare prime naiva T-cellproliferation och differentiering genom uppreglering av MHCII2, costimulatory ligander (CD80 CD86 och CD40)6, cytokiner och andra lösliga medlare7. En kaskad av pro-inflammatoriska medlare produktion från immunogent DCs är viktigt för cytokin-medierad T celldifferentiering. Exempelvis både IFN-γ och IL-12 är nödvändiga för Th1 differentiering8 och IL-1, IL-6 och IL-23 är kritiska för naiva T-cell polarisering mot Th17 celler9. Även om mogen DCs reagerar på främmande antigener, kan okontrollerad DC aktivering av self-antigener orsaka tolerans ablation och främja utvecklingen av autoimmuna sjukdomar genom att generera autoreaktiva T celler vars aktivering leder till vävnad förstörs10 .
De senaste rapporterna har gett tydliga bevis på DC plasticitet, exemplifieras genom sin förmåga att interagera med olika ledtrådar inom deras vävnad närmiljön och differentieras till distinkta effektor/suppressor DC delmängder. Den anti-inflammatoriska mediatorer, som IL-1011, TGF-β12och HO-113 har visat sig spela en viktig roll i immunsystemet genom att inducera tolerogena DCs (TolDCs). Dessa TolDCs förvärva tillsynsuppdrag och undertrycka T cell spridning14. Dessutom avsaknaden av samtidig stimulering av DCs och produktionen av antiinflammatoriska mediatorer från TolDCs både bidra till induktion av regulatoriska T-celler (Tregs) och även effektivt hämmar både Th1 och Th17 differentiering och expansion15. I senaste två årtiondena, har den terapeutiska potentialen av TolDCs rapporterats av flera utredare. I dessa studier var administrering av ex-vivo genereras TolDCs inte bara förbättras sjukliga symtom i olika prekliniska modeller för autoimmuna sjukdomar16 men också lett till utveckling av immuntolerans hos patienter17 ,18. Intressant, idag TolDCs terapin har ansetts som alternativa eller kompletterande tillvägagångssätt för autoimmuna sjukdomar i flera kliniska prövningar, inklusive typ 1 diabetes mellitus19, reumatoid artrit20, 21, multipel skleros (MS)22,23,24, och Crohns sjukdom25.
Det finns en mängd olika protokoll som har anställts för att utveckla TolDCs och flera laboratorier har rapporterat metoder för generering och fenotypisk karakterisering av TolDCs. Dessa metoder kan användas för att generera reproducibly TolDCs in vitro- från hematopoetiska progenitorceller och stabilt upprätthålla dem i en tolerogena staten i vivo26,27,28,29. IDCs kan omvandlas till TolDCs av exponering för olika immunmodulerande farmakologiska agenter eller antiinflammatoriska cytokiner. Vitamin D3 är exempelvis en välkänd farmakologiska agent kända att öka IL-10 produktion och undertrycka IL-12 sekretion från DCs och att därmed öka deras immunosuppressiva funktion30. Dessutom när DCs utsätts för potenta inflammatoriska stimuli, såsom lipopolysackarider (LPS), flera farmakologiska medel såsom dexametason31, rapamycin32och kortikosteroider33 har visats inducera den TolDC fenotyp genom att minska DC ytan uttryck för CD40, CD80 och CD86, MHCII34. IL-10 och TGF-β är de mest studerade antiinflammatoriska cytokiner inducera DC tolerans35 och samtidig exponering för båda av dessa cytokiner har visats inducera en tolerogena fenotyp i DCs36.
Sedan den tolerogena DC definieras av funktionella egenskaper snarare än av fenotypiska markörer, det finns behöver en stor utveckla en konsekvent metod för cellulära och funktionell karakterisering av TolDCs. Dessutom ett strikt och konsekvent protokoll måste fastställas för konsekvent utvärdering och karakterisering av tolerogena DC fenotypen om vi effektivt och reproducibly jämföra nya agenter förmåga att inducera TolDC fenotypen i den laboratorium. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll med steg för steg metoder att isolera iDCs från hematopoetiska progenitorceller möss och därefter analysera effekten av nya agenter under utvärdering för deras förmåga att omvandla iDCs till TolDCs, som ger en robust funktionella och fenotypisk karakterisering av TolDCs både in vitro- och in vivo. Beskrivningen omfattar en utarbetad metod för att karakterisera TolDCs av deras yta ligander, cytokin profil och immundämpande funktioner i vitro. Vi ger också ett exempel på en metod att utforska potentiella terapeutiska tillämpningen av dessa TolDCs i en preklinisk modell av MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Detta etablerat protokoll kommer att hjälpa utredare att utvärdera nya agenter förmåga att främja induktion av TolDCs och kommer att underlätta arbetet med att bredda TolDC terapeutisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier har utförts i enlighet med förfaranden som godkänts av de fall Western Reserve University School of Medicines institutionella djur vård och användning kommittén.
1. Förbered benmärg-derived dendritiska celler (BMDCs)
- Sterilisera alla kirurgiska instrument via autoklavering och utför experimentet i klass II biologiska säkerhetsskåp med tillgripits säkerhetsrutiner.
- Euthanize C57BL/6 möss 8-10 veckors ålder med hjälp av CO2 kammare. Placera musen på en dissekera styrelse och skölj med 70% etanol. Punktskatt tibia-fibula och lårbenet ben med hjälp av en kirurgisk sax och placera dem med 70% etanol i en 10 cm kultur maträtt.
- Använda kirurgiska knivar och pincett för att dissekera vävnad bort så mycket som möjligt på locket till de 10 cm kultur maträtt och isolera skenbenet och lårbenet att placera dem med 70% etanol i en 6 cm kultur maträtt.
- Använd kirurgisk blad för att trimma båda ändarna av skenbenet och lårbenet. Använda 3 mL PBS i 3 ml spruta med en 23-G nål för att tömma innehållet i benmärg från ena änden av ben till ett koniskt rör som innehåller 12 ml PBS. Upprepa detta steg 3 x för varje ände av ben.
- Centrifugera cellsuspension vid 300 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 1 ml ACK lyseringslösning buffert för 5 minuter att ta bort röda blodkroppar.
- Lägga till 9 ml PBS att späda ut ACK lyseringslösning buffert och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera med 10 ml odlingsmedium (RPMI-1640 plus L-glutamin, 10% FBS, 1% icke-essentiell aminosyra (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-merkaptoetanol och 5% penicillin/streptomycin).
Obs: Endotoxin nivån måste vara mindre än 0,1 EU/ml i FBS. - Passera en 40 μm cell SIL cellsuspensionen och ta 20 µl cellsuspension och blanda med 80 µl av trypan blå att räkna antalet levande celler med hjälp av cytometer.
- Justera antalet cellen till 1 x 106 celler/ml med 15 ng/ml GM-CSF och 10 ng/ml IL-4.
- Tavla 3 ml 1 x 106 celler/ml i varje brunn 6-väl plåt och inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet i CO2 inkubatorn.
Obs: Benmärgsceller från en mus är runt 3-5 x 107 celler, vilket indikerar att den kan placeras från 2 till 3 6 brunnar. - Dag 3, ta bort alla 3 ml odlingsmedium från varje brunn, tillsätt 2 ml färsk PBS i varje brunn, och sedan snurra försiktigt på plattan för att säkerställa att ta bort alla icke-anhängare celler.
- Ersätt 3 ml färsk odlingsmedium med 15 ng/ml GM-CSF och 10 ng/ml IL-4 i varje brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet i CO2 inkubatorn.
- Dag 5, för att direkt lägga till en annan 3 ml färsk odlingsmedium med 15 ng/ml GM-CSF och 10 ng/ml IL-4 och i varje brunn. Inkubera cellerna vid 37° C, 5% CO2, och 95% luftfuktighet i CO2 inkubatorn.
Obs: Den totala volymen i varje brunn är nu 6 ml. - Dag 7, satte hela plattan på is för 10 minuter. Pipettera försiktigt odlingssubstratet i varje brunn för att rubba den löst-anhängare BMDCs som iDCs till suspension.
Obs: Den vidhäftande makrofager är fortfarande kopplade till plattan. Låg temperatur och försiktigt förfaranden är nyckeln till att undvika DC aktivering för att påverka ytterligare experiment. - Centrifugera cellsuspension vid 300 x g i 5 minuter och blandas med färskt odlingssubstrat för ytterligare experiment.
Obs: BMDCs kan identifieras med fluorescens-märkt CD11c antikropp av flödescytometri och vi visade vår Usenets strategi av BMDCs för ytterligare experiment i figur 1.
2. karakterisera TolDC gen och Protein profil
- Plattan 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per brunn i 6 väl-plattan med odlingsmedium i närvaro eller frånvaro av 100-400 nM CDDO-DFPA för ruvning 1 h vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet i CO2 inkubatorn.
Obs: CDDO-DFPA, en syntetisk triterpenoid, är en nukleär faktor (erytroid-derived 2) - som - 2 faktor (Nrf2) inducerare och nuclear factor-κB (NF-κB) hämmare. Tillämpa andra agenter för induktion av TolDCs från iDCs, såsom IL-10, vitamin D3, dexametason eller BAY 11-7085, och ändra detta steg till ett optimalt tillstånd för varje agent. - Lägga till 10 eller 100 ng/ml av LPS för ruvning 4-24 timmar för att inducera mDCs (inkubationstid är annorlunda på grund av mRNA eller protein mätning).
- Försiktigt Pipettera odlingssubstratet i varje brunn och skörda cellsuspension med hjälp av 1 ml pipett. Centrifugera vid 300 x g 5 min att samla celler och supernatanten, respektive.
- Analysera de ytan liganderna från cell pellets av flödescytometri, såsom stimulerande ligander: CD40, CD80 och CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL eller hämmande ligander: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
- Isolera RNA från cell pellets och analysera de RNA och supernatanten prover för cytokin profil och genen och protein nivåer av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) och ELISA, respektive.
Obs: om exempelvis inflammatoriska cytokiner: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 och IL-23 eller antiinflammatoriska cytokiner: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 och HO-1.
3. utvärdera funktionen av TolDCs In Vitro och In Vivo
-
T-cell syngena Proliferation Assay
- Sterilisera alla kirurgiska instrument via autoklavering och utför experimentet i klass II biologiska säkerhetsskåp med tillgripits säkerhetsrutiner.
- Förbereda Mac-buffert med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA i 500 ml PBS. Sterilisera bufferten genom filtrering genom ett 0,2 µm filter.
Obs: Håll bufferten på isen under den följande experimentet. - Att erhålla CD4+ T celler, eutanasi OT-II T-cell receptor (TCR) transgena möss 8-10 veckors ålder med hjälp av CO2 kammare. Placera musen på en dissekera styrelse och skölj med 70% etanol. Isolera mjälte från vänster sida av buken med hjälp av kirurgisk sax och pincett.
- Sätt mjälte med 2 ml PBS i en 6 cm kultur skål och Använd baksidan av push-stick av 3 ml spruta skräda mjälte genom att passera en 40 μm cell SIL.
- Samla cellsuspension och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i 400 μl av Mac-buffert.
- Tillsätt 100 μl av CD4+ T Cell Biotin-antikroppar Cocktail vid 4° C i 5 minuter.
Obs: Cocktail antikroppen binder på andra celltyper utom CD4+ T celler, såsom CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klass II, Ter-119 och TCRγ/δ. - Lägga till 300 μl av MACS buffert och 200 μl av anti Biotin pärlor (Tabell för material) vid 4° C i 10 minuter.
- Plats kolumnen består av ferromagnetiska sfärer (Tabell av material) och före Separation Filter tillsammans i det magnetiska fältet och skölj den med 3 ml MACS buffert.
- Lägga till 9 ml av MACS buffert i cellerna och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i 3 ml MACS buffert och applicera på kolumnen. Samla genomflöde innehållande CD4+ T celler.
- Tvätta kolonnen med en annan 3 ml MACS buffert och även samla in genomflöde.
- För att erhålla mjälten pan DCs, eutanasi C57BL/6 möss 8-10 veckors ålder med hjälp av CO2 kammare. Placera musen på en dissekera styrelse och skölj med 70% etanol. Isolera mjälte från vänster sida av buken med hjälp av kirurgisk sax och pincett. Sätt mjälte i en 6cm kultur skål innehållande 2 ml kollagenas D lösning (2 mg/ml kollagenas D upplöst i HBSS innehållande kalcium, magnesium).
- Injicera 1 ml kollagenas D lösning att mjälten två gånger med en 1 ml spruta och en 25G nål. Skär mjälte i små bitar med liten sax.
- Skaka och odla i rumstemperatur i 25 minuter.
- Tillsätt 500 μl av 0,5 M EDTA vid rumstemperatur i 5 minuter.
Obs: Stegen från 3.1.13-3.1.14 är kritisk för att öka avkastningen av DCs. - Nu använda baksidan av push-stick av 3 ml spruta finhacka mjälte suspensionen genom att passera en 40 μm cell sil och samla in cellsuspensionen genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i 350 μl av MACS buffert, 50 µl FcR blockerar reagens och 100 μl av Pan dendritiska cellen Biotin-antikroppar Cocktail vid 4° C i 10 minuter.
Obs: Antikroppen cocktail mot antigener som inte uttrycks av DCs. - Tvätta cellerna genom att lägga till 9 ml av MACS buffert och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i 800 μl av MACS buffert och tillsätt 200 µl anti Biotin pärlor vid 4 ° C i 10 minuter.
- Upprepa stegen från 3.1.9-3.1.11 att samla DCs.
- Tvätta kolonnen med en annan 3 ml MACS buffert två gånger och även samla in genomflöde.
- Behandla den 2 x 105 DCs/ml i närvaro eller frånvaro av 100-400 nM CDDO-DFPA vid 37 ° C i 1 hr. separat, etikett CD4+ T-celler (1 x 107/ml) med 1 μM CFSE vid 37 ° C i 15 minuter, tvätta med PBS , och justera volymen för att få slutlig koncentration på 2 x 106 T celler/ml.
- Nästa, i en plattan med 96 brunnar, Co kultur 100 μl av behandlade dendritiska celler med samma volym av CFSE-märkta CD4+ T celler, både som samlats in från ovanstående steg för att få 1:10 baserat. Nu lägga till 100 ng/mL äggalbumin (OVA) peptid 323-329 per brunn och mäta CFSE intensiteten av T-cellerna av flödescytometri efter 2-3 dagars inkubation.
Obs: Cell nummer och baserat på DCs och T celler har optimerats från våra tidigare arbete37.
-
Framkalla passiv EAE genom att injicera BMDCs pulsade med Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG) (35-55)
- Tavla 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per brunn i 6 väl-plattan med odlingsmedium i närvaro eller frånvaro av 100-400 nM CDDO-DFPA för ruvning 1 hr.
- Tillsätt 10 ng/ml LPS för ruvande 24 timmar.
- Tillsätt 100 μg/ml MOG (35-55) för ruvande 4 timmar.
- Skörda den cellsuspension och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten med PBS och räkna cellerna.
- Subkutant injicera 200 μl av 2 x 106 celler till 8-10 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss (100 μl till varje bakben).
- På dagen för BMDC injektion och 48 timmar. senare, injicerar 200 ng av kikhosta toxin (PTX) i varje mus.
- Upprepa steg 3.2.6-3.2.7 en gång i veckan i 4 veckor.
- Utvärdera de kliniska symtom av EAE dagligen med hjälp av standardkriterier37 (0,5-halta bakpartiet, 1-halta svans, 2 måttlig bakbenen svaghet, 3-svår bakbenen svaghet, 4-komplett bakbenen förlamning, 5-tetraplegi eller döende tillstånd, 6-döden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den differentiering och urval av BMDCs:
Benmärg stamceller odlades i komplett RPMI medium i närvaro av GM-CSF och IL-4 differentieras till iDCs i 7 dagar (figur 1A). Dag 1, celler var små i storlek och visade sfäriska morfologi. Tvättning med PBS innan byte av färskt medium på dag 3 hjälpte celler till att bilda kluster och också ökade befolkningen i CD11c+ celler. På dag 4, BMDCs förstorades i storlek och initierade bildandet av kluster. Klibbade makrofager konverterades också och observerade på botten av plattan med en avlång form. Dag 5 bildas stora stora kluster av BMDCs. På dag 6 observerades också ett stort antal semi vidhäftande och flytande BMDCs. BMDCs var skördas på dag 7 och analyseras med flödescytometri för CD11c uttryck som en specifik markör för murina DCs. I en representativ flöde flödescytometri tomt i figur 1Bvisas runt 83,6% av BMDCs uttrycker CD11c erhölls genom denna metod.
Induktion och genetisk karakterisering av TolDCs:
Några av de ombud som är kända för att inducera TolDCs, såsom vitamin D338 och dexametason39, är kända att ned-reglera uttrycket av DC ytan ligander, inklusive MHC II och costimulatory molekyler, CD40, CD80 och CD86. Däremot, i samband med antingen LPS eller CD40L-inducerad mognaden av DCs visade kalcineurinhämmare cyklosporin A och FK506 ingen effekt på uttrycket av CD83, CD80 och CD86, MHC II33. Som framgår av analysen av handelsflödet flödescytometri, hade induktion av TolDC av CDDO-DFPA ingen signifikant effekt på LPS-inducerad ytan ligand uttrycket av DCs, inklusive CD80, CD86, MHC II, PD-L1 och CD40. (Figur 2).
Dessutom den jämförande transkriptom och cytokin analysen av BMDCs behandlas med eller utan CDDO-DFPA i närvaro eller frånvaro av LPS skildras modulerade inflammatoriska gen profil. CDDO-DFPA behandling signifikant LPS inducerad pro-inflammatorisk cytokingener som IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 och IL-23 (figur 3A-3F). Dessa kallas cytokiner för Th1 (IFN-γ och IL-12) och Th17 (IL-6 och IL-23) cell differentiering. Dessutom behandlas CDDO-DFPA BMDCs visade förbättrad uttryck av cytokingener som antiinflammatoriska såsom IL-4, IL-10, TGF-β och HO-1 (figur 4A-4D). Dessa anti-inflammatoriska gener kallas autoimmunitet modulator genom att främja Th2 (IL-4 och andra) och celldifferentiering Treg (IL-10 och TGF-β). 40 här är det viktigt att notera att de distinkta IL-12−; IL-10+ cytokin produktion36, induktion av HO-1 uttryck13och hämning av EDN-141 inducerad av CDDO-DFPA behandling, är alla kända för att autentisera DCs tolerogena funktion.
Cellulär och funktionell karakterisering av TolDCs in vitro
DC-medierad T cell spridning är känt att utlösas av engagemang av costimulatory yta ligand samt utsöndring av cytokiner och lösliga medlare7. Dock TolDCs hämmar T-cell svar genom flera mekanismer: genom att inducera T cell anergi, genom att aktivt främja borttagandet av autoreaktiva celler och främja polariseringen av naiva T-celler till Tregs42. Vi har redan rapporterat funktionell karakterisering av CDDO-DFPA inducerad TolDCs37. T-cell anergi och radering av autoreaktiva T celler kan analyseras självständigt genom att kontrollera yta markörer eller Annexin V/7-AAD färgning. Vi bekräftade dock indirekt denna fenotyp genom att mäta T cell spridning index. För detta, vi utnyttjade C57BL/6 OTII transgena möss T-celler och utsatt dem för syngena DCs utvinns ur C57BL/6 möss och behandlas med eller utan CDDO-DFPA. Dessa DCs var tvättas och samtidig odlade med CFSE färgade T-celler med OVA peptid. Vi observerat en betydande minskning T cell spridning genom CDDO-DFPA förbehandlade DCs, vilket tyder på deras tolerogena fenotyp (figur 5).
In vivo funktionell karakterisering av TolDCs i en preklinisk modell av autoimmunitet
Slutligen kan funktionaliteten i DFPA-inducerad TolDCs testas i någon av ett antal prekliniska i vivo modeller kännetecknas autoimmuna eller inflammatoriska egenskaper. Eftersom ek är en allmänt accepterad prekliniska murina modell sjukdomens kliniska immunmedierade centrala nervsystemet MS43, utnyttjade vi detta i vår nuvarande studie. För att ytterligare undersöka de i vivo funktionaliteten i CDDO-DFPA inducerad TolDCs, vi utmanade dem i en preklinisk murina modell av passiv EAE. För detta odlades BMDCs med eller utan CDDO-DFPA i närvaro av LPS och MOG (35-55). Dessa celler injicerades då upprepade gånger som schemalagda protokoll avbildas i figur 6A och möss observerades rutinmässigt för manifestationen av kliniska tecken. Som förväntat, pulsade LP-skivor och MOG (35-55) BMDCs visade kliniska symtom av EAE, dock; CDDO-DFPA primas BMDCs behandlade gruppen visade fördröjd debut av sjukdomen med betydligt minskade kliniska symtom (figur 6B). Dessa resultat validera immunsuppressiva fenotypen av TolDCs inducerad av CDDO-DFPA behandling.
Figur 1: utveckling och fenotypisk karakterisering av BMDCs: (A) benmärgsceller var spolas ut från skenbenet och lårbenet ben i C57BL/6 möss och ytterligare åtskild till BMDCs. En cell lämplig kluster bildandet var spåras av ljusmikroskop under hela perioden av differentiering (skala barer, 100µm). (B) BMDCs differentiering bekräftades av CD11c ytan uttrycket, som analyseras av FACS. Grafer visar procentandelen av den utökade CD11c+ cell befolkningen. (C) Gating strategi BMDCs. celler var först gated för att utesluta skräp (FSC vs. SSC). En doublet utslagning grind utnyttjades för att gate på undertröjor celler (FL2-W vs FL2-A). I singlet cellerna, var levande celler gated på 7-AAD tomt (7-AAD vs. FSC). Cellerna var sedan ytterligare analyseras och gated CD11c uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DC cell surface ligand uttryck är oförändrad vid CDDO-DFPA. Cellerna var förbehandlade i närvaro eller frånvaro av CDDO-DFPA (200 nM) för 1 timme före stimulering med LPS (100 ng/ml) för 24 timmar. Cell surface uttryck för CD80, CD86, MHC II, PD-L1 och CD40 analyserades av flödescytometri. Denna siffra har ändrats från Vetenskapliga rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduceras och publiceras med upphovsrättsliga tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CDDO-DFPA ändras den genetiska och protein fenotypen av immunogent DCs. BMDCs behandlades före i närvaro eller frånvaro av CDDO-DFPA (50-400 nM) för 1 timme före tillsats av LPS (100 ng/ml), och antingen skördas för RNA-extraktion (4 Tim.) eller tillåtet att villkora odlingsmedium för 24 timmar. före samlingen för cytokin analyser. Nivåerna av IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) och IL-23 (F) mättes av qRT-PCR och ELISA. Medan nivån av IFN-γ (A) mättes av qRT-PCR och EDN-1 (C) av ELISA ensam. Resultaten uttrycks som medelvärde ± S.D. tre experiment. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 jämfört med LPS-behandlade grupperna. Oparade student t-test. Denna siffra har ändrats från Vetenskapliga rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduceras och publiceras med upphovsrättsliga tillstånd ”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CDDO-DFPA inducerad TolDCs fenotyp bekräftas av genen och protein uttryck. BMDCs var förbehandlade i närvaron eller frånvaron av CDDO-DFPA (10-400 nM) för 1 timme före tillsats av LPS (100 ng/ml), och celler skördats för RNA-extraktion efter 24 timmar. Nivåerna av IL-4 (A), IL-10 (B) och TGF-β (C) mättes med qRT-PCR. (D) cell protein lysates samlades på 12 timmar. för analyser och nivåerna av HO-1 och β-aktin bestämdes uttryck av Western blotting. Resultaten uttrycks som medelvärde ± S.D. tre experiment. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 jämfört med LPS-behandlade grupperna. Oparade student t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: CDDO-DFPA utsatt DCs undertrycka T cellproliferation. DCs var förbehandlade med CDDO-DFPA (100-400 nM) i 1 timme bara, då tvättade och samtidig odlade med CFSE färgade T-celler på en 1:10 baserat. (A) mjälten T-celler och DCs var isolerad från C57BL/6 OTII transgena möss och C57BL/6 möss, respektive. CDDO-DFPA förbehandlade DCs odlades Co med CFSE färgade T-celler med (w /) eller utan (w/o) OVA tillägg under inkubation. T cell spridning bestämdes av flödescytometri på dag 2. Diagram skildrar andelen delande T celler i förhållande till nummer T celldelning. Data är en representation av 3 oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från Vetenskapliga rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduceras och publiceras med upphovsrättsliga tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: MOG primas DC-inducerad passiv EAE upphävs av TolDCs. (A) EAE induktion av MOG (35-55)-pulsade BMDCs. mogna BMDCs behandlades i närvaron eller frånvaron av CDDO-DFPA (400 nM) och därefter pulsade med MOG (35-55) för 4 timmar. Sammanlagt 200 μl av 2 × 106 celler administrerades subkutant till regionen flanken av C57BL/6 möss en gång varje vecka för totalt fyra injektioner. Varje gång, administrerades PTX av i.p.-injektion omedelbart och igen två dagar senare (dag 0 på 4: e cykel). (B) klinisk score var inspelade efter alla fyra injektioner, med standardkriterier. Alla data presenterades som det medelvärde ± S.E.M. * P < 0,05. Flera t-tester med Holm-Sidak analys (n = 7 möss i varje grupp). Denna siffra har ändrats från Vetenskapliga rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduceras och publiceras med upphovsrättsliga tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver en effektiv protokoll som kan användas till reproducibly att generera iDCs och därefter skilja dem in i TolDCs, och vi föreslår att detta kan tillämpas för att utvärdera nya molekylära målet agenter förmåga att inducera TolDC fenotyp. Som beskrivs i detta betänkande, följde vi en sekvens där vi först analyserade TolDC uttryck för surface ligander av flödescytometri, följt av en bedömning av DC cytokin profil mätt med qRT-PCR och ELISA. Slutligen bekräftades immunoregulatoriska funktion TolDCs genom att visa sin kapacitet att minska T cell spridning in vitro- och deras effekt att undertrycka autoimmunitet in vivo med prekliniska murina EAE modell av MS.
I våra protokoll, var iDCs genereras och åtskilt från murina benmärgen prekursorer med kombinationen av GM-CSF och IL-4. Andra protokoll har använt formulär-liknande tyrosin Kinas 3 ligander (Flt3L) i odlingsmediet för att generera iDCs44. Även användning av Flt3L ökar avkastningen av iDCs, ta dessa iDCs brukar 2 dagar (9 dagar) att skörda, jämfört med GM-CSF/IL-4 tillägg (7 dagar)44. Viktigare, iDC genereras från Flt3L ofta differentieras till båda cDCs (CD8– och CD8+) och PDC45 som var funktionellt och fenotypiskt motsvarigheter till steady state DCs invivo. Men GM-CSF/IL-4 invariably inducerar differentiering av iDC mot cDCs (CD8–) endast44 och under mognad, de visade liknande tecken i inflammatoriska DCs46. Det är anmärkningsvärt att veta att GM-CSF/IL-4 ofta används i kliniska prövningar och grundforskning på grund av fördelen med att differentiera DCs från monocyter eller CD34+ stamfäder44. Det har visats att iDCs genereras från dessa två metoder producera morfologiskt olika celler, som även besitter olika cell yta markörer och som uppvisar distinkta cytokin profiler vid deras aktivering. Dessutom varierar TolDCs som induceras av dessa metoder i deras förmåga att migrera svar på kemotaktiska faktorer och att inducera antigen-specifika T-cell svar44,45. Vi förstår att CD8+ DCs kan uppvisa mer potential i TolDC induktion på grund av deras unika kapacitet av Cross-tålamod47. Det behövs dock sedan ytterligare cell sortering från BMDCs härrör av Flt3L att undersöka den specifika CD8+ DC delmängd. Dessutom, eftersom GM-CSF/IL-4 inducerad BMDCs är överlägsna på T-cell stimulering och produktionen av inflammatoriska mediatorer efter LPS behandling44,45, Vi hittade denna strategi gav fler reproducerbara resultat i vår experiment.
BMDCs härrör från GM-CSF/IL-4 start att uttrycka CD11c runt dag 4 och berika uttrycket efter dag 648. Proceduren kultur kan upprätthållas tills dag 10-12 med lägre plätering täthet av benmärgsceller och en låg dos av GMC-SF dag 8-1049. I detta protokoll tillkom CDDO-DFPA (syntetiska triterpenoid) och LPS parallellt som agenter att inducera DC tolerans och mognad, respektive. Vi rapporterade nyligen att iDCs skördas från kulturer använder denna metod för BMDC generation uppvisar en funktionell TolDC fenotyp när förbehandlats med CDDO-DFPA37. Det är anmärkningsvärt att CDDO-DFPA, som lades endast till kulturer efter iDC skörd (dag 7)37, i motsats till agenter som vitamin D3 som måste läggas till kulturer flera gånger under iDC differentiering (dag 2, 4, 6)50. Dessutom kan denna induktion av TolDCs av vitamin D3 bero på olika mekanismer som måste initieras både under och efter iDC differentiering51. Våra data tyder på att lägga till CDDO-DFPA under iDC differentiering hade ingen påverkan på renheten av CD11c + DCs men gjorde dosberoende ligandinducerad sänka avkastningen av iDCs på dag 7 (inga data anges). Våra analyser tyder också på att den högsta koncentrationen av CDDO-DFPA används i dessa experiment kan vara giftigt för benmärg stamceller, även om iDC visade normal lönsamhet med denna koncentration av CDDO-DFPA37. Det förväntas att TolDC induktion kan optimeras genom noggranna analyser av effekterna av tidpunkten och längden på exponering för ämnen som CDDO-DFPA.
Det är viktigt att överväga alternativa metoder och mekanismer genom vilka iDCs kan förmås att mDCs av andra än LPS, såsom CD40L, TNF-α och IFN-γ52. DC mognad av LP genom Toll-liknande receptorer leder 4(TLR4) aktivering av flera transkriptionsfaktorer, inklusive nuclear factor-κB (NF-κB), p38 mitogen-aktiverat proteinkinas (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), och extracellulära signal-reglerade proteinkinas (ERK1/2). Mognaden av DCs av CD40L och TNF-α genom CD40 och TNF-receptorer inducerar respektive NF-κB smittvägen. Däremot IFN-γ stimulerar en annorlunda väg inklusive aktivering av Janus kinase (JAK), tyrosinkinas (tjock), och den signalen givaren och aktivator av transkription proteiner (statistik), och dessa nedströms effekter kompletteras också med aktivering av NF-κB väg52. Dessutom, medan gen uttryck profilen av CD40L/TNF-α-baserad DC mognad antyder att dessa DCs polarisera T-celler mot en Th2 cell svar53, är DC mognad av IFN-γ starkt partisk mot en Th1 cellen svar54. Därför är dessa andra inducerare av DC mognad som är kopplade till differentiering mot specifika T-cell grupper inte anställda i detta protokoll.
Flera rapporter har visat att ex vivo-differentierade DCs klarar av att förmå hela spektrumet av EAE kliniska symtom och patologi i möss55. Metoden för passiv EAE induktion av ex vivo aktiveras DCs har antagits med olika modifieringar av olika laboratorier. Kombinationen av aktiva och passiva EAE induktion genom administrering av MOG primas BMDCs, 7 dagar före immunisering med MOG och komplett Freund's adjuvans (CFA) resulterar i högre klinisk symtompoäng (peak kliniska Poäng: 3,5) jämfört med den passiva EAE induktion av MOG administration primas BMDCs ensam (peak kliniska Poäng: 2)56. Resultat med denna metod som kombinerar MOG primas BMDCs med MOG immunisering antyder att sjukdomsdebuten sker på dag 9 efter immunisering med MOG och CFA56. Men eftersom det är känt att CFA orsakar betydande inflammation på administration57, har vi utnyttjat passiva EAE induktion genom administrering av DCs ensam i vårt protokoll för att effektivt analysera effekten av TolDCs under EAE. För att ytterligare bekräfta funktionella fenotypen av TolDCs, bör man också testa dem i undertrycka kliniska symtom på aktiv EAE möss. Sträckan administration av DCs är också kritisk till induktion av EAE symtom58. Som rapporterats av våra lab och av andra, subkutan injektion av BMDCs i regionen flanken i C57BL/6 möss en gång i veckan för totalt 3-4 injektioner inducerar en peak kliniska poäng av EAE runt 2-2,5 med reproducerbara sjukdomsdebuten på dag 11-1237 ,58. Vi gav ett kort klipp för att demonstrera de olika kliniska symtom mellan aktiva och passiva EAE induktion (Video 1).
Våra protokoll erkända begränsningar inkluderar den tid som krävs av de metoder som används och beroendet av en icke-fysiologiskt relevanta närmiljön för BMDC differentiering. Men medan antikroppen berikad kolumn separationsmetoder samling för DCs och T-celler från murina mjälte kan vara mer tidseffektivt, lider det av en låg avkastning av önskad DC befolkningen. Fördelen med metoden i benmärgen-derived DC utveckling är således log skala högre avkastningen av DC befolkningar jämfört med antikropp kolumn separation från hela mjälten. Som nämnts ovan, DCs genereras kräver i vitro genom denna metod en hög koncentration av cytokin tillskott som är inte fysiologiskt relevanta till DCs i vivo mikromiljö59 och även garanterar inte långsiktigt hållbarhet av DC. GM-CSF används i vårt protokoll är inte heller en viktigt cytokin för normala DC differentiering i vivo60. Dock det föreslagna protokollet för generering av BMDC reproducibly ger en hög bråkdel av funktionellt TolDCs och bör ses som ett mycket tillförlitligt och reproducerbar metod för att skapa funktionella DCs med tolerogena egenskaper.
Sammanfattningsvis, kan den TolDCs som genereras från det protokoll som beskrivs här effektivt kännetecknas genom att bedöma deras genen och protein uttryck profiler, genom att bestämma deras förmåga att modulera T cell-beroende immun Svaren in vitro-och av bedömning av deras funktion som en adoptiv cellterapi att undertrycka EAE induktion i vivo. Våra protokoll ger en ram för utvärdering av eventuella nya agenter som tros ha kapacitet att inducera TolDCs och ytterligare påskynda terapeutiska utvecklingsprocessen för TolDCs från bänk till klinik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi tackar Reata läkemedel för att ge CDDO-DFPA. Vi erkänner också stöd av Jane och Lee Seidman stol i Pediatric Cancer Innovation (John Letterio). Detta arbete stöds av Department of Defense [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler ungdomar och unga vuxna cancerpatienter forskning initiativet på fall omfattande Cancer Center. och Callahan Graduate Scholar Award för Hsi-Ju Wei från F.J. Callahan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
- Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
- Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
- Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
- Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
- Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
- Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
- Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
- Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
- Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
- Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
- Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
- Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
- Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
- Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
- Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
- University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
- Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
- Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
- Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
- Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
- Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
- Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
- Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
- Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
- Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
- Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
- Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
- Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
- Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
- Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
- Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
- van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
- Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
- Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
- Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
- Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
- Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
- Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
- Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
- Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
- Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
- Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
- Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
- Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
- Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
- Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
- Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
- Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).
