JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Udvikling og funktionel karakterisering af Murine Tolerogenic dendritiske celler

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udvikle og karakterisere tolerogenic dendritiske celler (TolDCs) og evaluere deres immunterapeutisk nytte.

Abstract

Immunforsvaret fungerer ved at fastholde en stram balance mellem koordinerende svar mod udenlandske antigener og opretholde en tilstand af selv-antigener samt antigener stammer fra commensal organismer. Afbrydelse af denne immun homøostase kan føre til kronisk betændelse og udviklingen af autoimmunitet. Dendritiske celler (DCs) er de professionelle antigen-præsenterer celler af den medfødte immunsystem involveret i aktivering naive T-celler til at indlede en immunrespons mod fremmede antigener. DCs kan imidlertid også opdeles i TolDCs, der fungerer til at opretholde og fremme T-celle tolerance og til at undertrykke effektor celler bidrager til udviklingen af enten autoimmun eller kronisk inflammation betingelser. Den seneste avancement i forståelsen af TolDCs antyder, at DC tolerance kan opnås ved at modulere deres differentiering betingelser. Dette fænomen har ført til enorme vækst i udviklingen af TolDC terapier for talrige immune lidelser forårsaget grund til at bryde i immuntolerance. Vellykket undersøgelser i prækliniske autoimmunitet murine modeller har yderligere valideres den immunterapeutisk nytte af TolDCs i behandlingen af autoimmune sygdomme. I dag er blevet TolDCs en lovende immunterapeutisk værktøj i klinik for genindsætte immuntolerance i forskellige immune lidelser ved at målrette patogene autoimmune reaktioner mens beskyttende immunitet intakte. Selv om en bred vifte af strategier er blevet foreslået af flere laboratorier til at fremkalde TolDCs, er der ingen konsistens i kendetegner den cellulære og funktionelle Fænotypen af disse celler. Denne protokol indeholder en trinvis vejledning til udvikling af knoglemarv-afledte DCs i stort tal, en unik metode til at differentiere dem i TolDCs med et syntetisk triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic syre-difluoro-propyl-AMID (CDDO-DFPA), og de teknikker, der anvendes til at bekræfte deres fænotype, herunder analyser af væsentlige molekylære signaturer af TolDCs. Endelig viser vi en metode til at vurdere TolDC funktion ved at teste deres immunosuppressive svar i vitro og vivo i prækliniske model af multipel sklerose.

Introduction

Dendritiske celler (DCs) blev er en integreret del af det medfødte immunforsvar og først opdaget og præget af Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som primære professionelle antigen præsentere celler1. DCs har vist sig at spille en vigtig rolle i immun aktivering ved at præsentere forarbejdede antigener til T-celler og B-celler via store histocompatibility komplekser (MHC) i den sekundære lymfoide organer til at sammenkæde de medfødte og adaptive immunforsvar2. I pattedyr immunsystemet findes der mindst to kategorier af DCs, som er blevet beskrevet som myeloid DCs og plasmacytoid DCs (fremdaterede)3. Myeloid DCs, også kendt som konventionel DCs (cDCs), er karakteriseret ved udtryk for CD11c og kan differentieres som umodne DCs (iDCs) in vitro fra knoglemarv stamceller eller perifert blod monocytter ved hjælp af granulocyt-makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og IL-4 i murine eller menneskelige arter, henholdsvis4.

Aktivering ‘fare’ signaler, såsom patogen-associeret molekylære mønstre (PAMP) eller skade-associeret molekylære mønstre (FUGTIG), vil drive iDCs modning mod immunogen DCs som modne DCs (mDCs) via bindende forskellige mønster anerkendelse receptorer DC overflade5. Immunogen DCs yderligere prime naive T-celle spredning og differentiering gennem opregulering af MHCII2, costimulatory ligander (CD80, CD86 og CD40)6, cytokiner og andre opløselige mæglere7. En kaskade af pro-inflammatoriske mediator produktion fra immunogen DCs er afgørende for cytokin-medieret T-Celledifferentiering. For eksempel, både IFN-γ og IL-12 er nødvendige for Th1 differentiering8 og IL-1, IL-6 og IL-23 er kritisk for naive T-celle polarisering mod Th17 celler9. Selv om modne DCs reagere på udenlandske antigener, kan ukontrolleret DC aktivering af selv-antigener forårsage tolerance ablation og fremme udviklingen af autoimmune sygdomme ved at generere autoreactive T celler hvis aktivering fører til væv destruktion10 .

Nylige rapporter har fastsat klare beviser for DC plasticitet, eksemplificeret af deres evne til at interagere med forskellige signaler i deres væv mikromiljø og differentiere i særskilte effektor/suppressor DC undersæt. De anti-inflammatoriske mediatorer, IL-1011, TGF-β12og HO-113 har vist sig at spille en vigtig rolle i immunsuppression ved at inducere tolerogenic DCs (TolDCs). Disse TolDCs erhverve myndighedsopgaver og undertrykke T-celle spredning14. Desuden, manglen fælles stimulation af DCs og produktion af anti-inflammatoriske mediatorer fra TolDCs både bidrage til induktion af regulerende T-celler (Tregs) og også effektivt hæmmer både Th1 og Th17 differentiering og ekspansion15. I sidste to årtier, er den terapeutiske potentiale af TolDCs blevet rapporteret af flere efterforskere. I disse undersøgelser, administration af ex-vivo genereret TolDCs ikke kun forbedret patologiske symptomer i forskellige prækliniske modeller af autoimmune sygdomme16 men også ført til udviklingen af immuntolerance i patienter17 ,18. Interessant, i dag TolDCs terapi har været betragtet som et alternativ eller tillægsbehandling tilgang til autoimmune sygdomme i adskillige kliniske forsøg, herunder type 1 diabetes mellitus19, reumatoid arthritis20, 21, multipel sklerose (MS)22,23,24, og Crohns sygdom25.

Der er en række protokoller, der har været ansat til at udvikle TolDCs og flere laboratorier har rapporteret metoder til generation og fænotypiske karakterisering af TolDCs. Disse metoder kan anvendes, reproducerbar generere TolDCs i vitro fra hæmatopoietisk ophav og stabilt fastholde dem i en tolerogenic tilstand i vivo26,27,28,29. IDCs kan omregnes til TolDCs ved udsættelse for forskellige immunmodulerende farmakologiske midler eller anti-inflammatoriske cytokiner. For eksempel, er D3-Vitamin en velkendt farmakologiske agent kendt at forøge IL-10 produktion og undertrykke IL-12 sekretion fra DCs og dermed styrke deres immunosuppressive funktion30. Desuden, når DCs udsættes for potent inflammatoriske stimuli, såsom lipopolysaccharides (LPS), flere farmakologiske stoffer såsom dexamethason31, rapamycin32og kortikosteroider33 har vist sig at fremkalde den TolDC fænotype ved at nedsætte DC overflade udtryk for CD40, CD80, CD86 og MHCII34. IL-10 og TGF-β er de mest studerede anti-inflammatoriske cytokiner fremkalde DC tolerance35 og samtidig eksponering for begge disse cytokiner har vist sig at fremkalde en tolerogenic fænotype i DCs36.

Siden tolerogenic DC er defineret af funktionelle kendetegn, snarere end af fænotypiske markører, der er et stort behov at udvikle en konsekvent metode for cellulære og funktionel karakterisering af TolDCs. Desuden en streng og konsekvent protokol skal fastsættes for ensartet vurdering og karakterisering af tolerogenic DC fænotype, hvis vi skal effektivt og reproducerbar sammenligne nye agenser evne til at fremkalde TolDC fænotype i den laboratorium. Her give vi en detaljeret protokol med trinvise metoder til at isolere iDCs fra hæmatopoietisk stamfaderen til mus og efterfølgende analysere effekten af nye agenter under evaluering for deres evne til at konvertere iDCs i TolDCs, giver en robust funktionel og fænotypiske karakterisering af TolDCs både in vitro- og in vivo. Denne beskrivelse indeholder en omfattende metode til at karakterisere TolDCs af deres overflade ligander, cytokin-profil og immunosuppressive funktioner i vitro. Vi tilbyder også et eksempel på en metode til at udforske den potentielle terapeutiske anvendelse af disse TolDCs i en præ-klinisk model af MS, eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE). Denne etableret protokol vil hjælpe efterforskere at evaluere nye agenser evne til at fremme induktion af TolDCs og vil lette indsatsen for at udvide anvendelsesområdet for TolDC terapeutiske udvikling.

Protocol

Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af den Case Western Reserve University School of Medicines institutionelle Animal Care og brug udvalget. 1. Forbered knoglemarv-afledte dendritiske celler (BMDCs) Sterilisere alle kirurgiske instrumenter via autoklavering og udføre eksperimentet i klasse II biologiske sikkerhed kabinet med bevilgede sikkerhedsprocedurer. Aflive C57BL/6 mus 8-10 uger gammel ved hjælp af CO2 kamme…

Representative Results

Den differentiering og udvælgelse af BMDCs: Knoglemarv stamceller var kulturperler i komplet RPMI medium tilstedeværelse af GM-CSF og IL-4 til at differentiere i iDCs i 7 dage (figur 1A). På dag 1, celler var små i størrelse og viste sfæriske morfologi. Vask med PBS, før udskiftning af frisk medium på dag 3 hjalp celler til form klynger og også øget befolkningen i CD11c<su…

Discussion

Dette papir beskriver en effektiv protokol, der kan bruges til reproducerbar til at generere iDCs og senere differentiere dem i TolDCs, og vi foreslår, at dette kan anvendes til at vurdere nye molekylære mål agenter evne til at fremkalde TolDC fænotype. Som beskrevet i denne rapport, vi har fulgt en sekvens, hvor vi først analyseres TolDC udtryk af overflade ligander ved flowcytometri, efterfulgt af en vurdering af DC cytokin profilen som målt ved qRT-PCR og ELISA. Endelig blev funktionen immunregulerende af TolDCs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Reata Pharmaceuticals for at give CDDO-DFPA. Vi anerkender også støtten fra Jane og Lee Seidman stol i Pediatric Cancer Innovation (John Letterio). Dette arbejde blev støttet af Department of Defense [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler teenager og ung voksen kræft forskningsinitiativ på sag Comprehensive Cancer Center; og Callahan Graduate Scholar Award for Hsi-Ju Wei fra F.J. Callahan Foundation.

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction–a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A “Negative” Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i. Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn’s Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity?. Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O’Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

MurineTolerogenicDendritic CellsAutoimmune DisordersMultiple SclerosisImmunotherapyCell DevelopmentFunctional CharacterizationC57BL/6 MiceBone MarrowGM-CSFIL-4Cell CultureCell HarvestingCell LysisCell FilteringCell PlatingCell FeedingCell Incubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image