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Medicine

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Abstract

Das Immunsystem arbeitet durch ein enge Verhältnis zwischen koordinierenden Antworten gegen fremde Antigene und Pflege einen nicht interaktiver Status gegen selbstantigenen sowie Antigene von Kommensalen Organismen abgeleitet. Die Störung dieser immun Homöostase kann zu chronischen Entzündungen und zur Entwicklung von Autoimmunität führen. Dendritische Zellen (DCs) sind die professionellen Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems beteiligt bei der Aktivierung von naiven T-Zellen um Immunantworten gegen fremde Antigene zu initiieren. DCs können jedoch auch in TolDCs unterschieden werden, die dienen zur Wahrung und Förderung der T-Zell Toleranz und Effektorzellen zur Entwicklung entweder Autoimmun- oder chronischen Entzündungen Bedingungen zu unterdrücken. Die jüngste Weiterentwicklung in unserem Verständnis des TolDCs legt nahe, dass DC Toleranz durch modulieren ihre Differenzierung Bedingungen erreicht werden kann. Dieses Phänomen führte zu enormen Wachstum in den Entwicklungsländern TolDC Therapien für zahlreiche Erkrankungen des Immunsystems verursacht durch Immuntoleranz zu brechen. Erfolgreiches Studium in präklinischen Autoimmunität murinen Modellen haben weiter die Immuntherapie Nützlichkeit des TolDCs bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen bestätigt. Heute haben TolDCs ein viel versprechendes Instrument der Immuntherapie in der Klinik für Wiederherstellung der Immuntoleranz in verschiedenen Erkrankungen des Immunsystems durch gezielte pathogene autoimmune Reaktionen, wobei schützende Immunität intakt bleiben. Obwohl eine Reihe von Strategien von mehreren Labs induzieren TolDCs vorgeschlagen wurde, gibt es keine Einheitlichkeit bei der Charakterisierung des zellulären und funktionale Phänotyps dieser Zellen. Dieses Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung für die Entwicklung von Knochenmark stammenden DCs in großer Zahl, eine einzigartige Methode zur Unterscheidung in TolDCs mit einem synthetischen Triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic Säure-Difluoro-Propyl-Amid (CDDO-DFPA), und die Techniken verwendet, um deren Phänotyp, einschließlich Analyse der wesentlichen Molekulare Signaturen des TolDCs bestätigen. Zu guter Letzt zeigen wir eine Methode, um TolDC Funktion zu beurteilen, indem Sie testen ihre immunsuppressive Antwort in Vitro und in Vivo in einem präklinischen Modell der multiplen Sklerose.

Introduction

Dendritische Zellen (DCs) waren sind fester Bestandteil des angeborenen Immunsystems zuerst entdeckt und gekennzeichnet durch Ralph Steinman und Zanvil Cohn 1973 als primäre professionelle Antigen präsentierenden1 Zellen. DCs haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in Immunaktivierung spielen, verarbeitete Antigene an T-Zellen und B-Zellen über große Histocompatibility komplexe (MHC) in sekundären lymphatischen Organe verbinden die angeborenen und der adaptiven Immunsystem2präsentiert. In den Säugetieren Immunsystem gibt es mindestens zwei Kategorien von DCs die myeloische DCs und DCs (pDCs)3plasmazytoide beschrieben sind. Myeloische DCs, auch bekannt als konventionelle DCs (cDCs), zeichnen sich durch die Expression von CD11c und kann als unreif DCs (iDCs) in Vitro aus Vorläuferzellen des Knochenmarks oder peripherem Blut Monozyten mit unterschieden werden Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) und IL-4 in murinen oder menschlichen Arten, bzw.4.

Aktivierung von “Gefahr” signalisiert, wie Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (feucht), fahren iDCs Reifung in Richtung immunogen DCs als Reife DCs (mDCs) über verschiedene Muster Anerkennung Rezeptoren für verbindlich die DC Oberfläche5. Immunogen DCs weitere erstklassige naive T-Zell-Proliferation und Differenzierung durch Hochregulation der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG2, costimulatory Liganden (CD40, CD80 und CD86)6, Zytokine und andere lösliche Mittler-7. Eine Kaskade von Pro-inflammatorischen Mediator Produktion von immunogen DCs ist essentiell für Zytokin-vermittelte T-Zell-Differenzierung. IFN-γ und IL-12 sind notwendig für Th1 Differenzierung8 und IL-1, sind beispielsweise IL-6 und IL-23 für naive T-Zelle Polarisation Richtung Th17 Zellen9von entscheidender Bedeutung. Obwohl Reife DCs auf fremde Antigene reagieren, unkontrollierte DC-Aktivierung von selbstantigenen Toleranz Ablation verursachen und fördern die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen durch die Generierung von autoreaktiven T-Zellen, deren Aktivierung zur Zerstörung des Gewebes10 führt .

Die jüngsten Berichte lieferten eindeutige Beweise für DC Plastizität, veranschaulicht durch ihre Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Queues innerhalb ihrer Mikroumgebung Gewebe und in verschiedenen Effektor/Suppressor DC Teilmengen zu unterscheiden. Die Anti-inflammatorische Mediatoren wie IL-10-11, TGF-β12und HO-113 haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei Immunsuppression durch Induktion tolerogene DCs (TolDCs) zu spielen. Diese TolDCs regulatorische Funktionen erwerben und T-Zell-Proliferation-14zu unterdrücken. Darüber hinaus das Fehlen der Ko-Stimulation von DCs und die Produktion von Anti-inflammatorische Mediatoren aus TolDCs sowohl zur Induktion von regulatorischen T-Zellen (Tregs) beitragen und auch effektiv hemmen Th1 und Th17 Differenzierung und Erweiterung15. In vergangenen zwei Jahrzehnten wurde durch mehrere Untersucher das therapeutische Potenzial von TolDCs berichtet. In diesen Studien die Verwaltung der Ex-Vivo erzeugt nicht nur gelindert TolDCs pathologische Symptome in präklinischen Modellen von Autoimmunerkrankungen16 aber führte auch zur Entwicklung der Immuntoleranz bei Patienten17 ,18. Interessant ist, heute die TolDCs Therapie galt als alternative oder Zusatztherapie Ansatz für Autoimmunerkrankungen in mehreren klinischen Studien, einschließlich 1 Diabetes Mellitus19, rheumatoider Arthritis20, Typ 21, Multiple Sklerose (MS)22,23,24und Crohns Krankheit25.

Es gibt eine Vielzahl von Protokollen, die beschäftigt sind, TolDCs zu entwickeln und mehrere Labore haben Methoden zur Generierung und phänotypischen Charakterisierung des TolDCs berichtet. Diese Methoden können reproduzierbar TolDCs in Vitro aus hämatopoetischen Vorläuferzellen zu generieren und, sie in einem tolerogene Zustand in Vivo26,27,28,29stabil zu halten. Die iDCs kann durch die Einwirkung von verschiedenen immunmodulatorischen pharmakologische Wirkstoffe oder Anti-inflammatorische Zytokine TolDCs umgewandelt. Vitamin D3 ist beispielsweise eine bekannte pharmakologische Agenten bekannt erweitern Produktion von IL-10 und IL-12 Sekretion von DCs zu unterdrücken und damit ihre immunsuppressive Funktion30steigern. Darüber hinaus Wenn DCs starke entzündliche Reize wie Lipopolysacchariden (LPS), ausgesetzt sind mehrere pharmakologische Wirkstoffe wie Dexamethason31, Rapamycin32und Kortikosteroide33 haben gezeigt, dass induzieren die TolDC Phänotyp durch Verringerung der DC oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG34. IL-10 und TGF-β sind die meisten studiert Anti-inflammatorische Zytokine, DC Toleranz35 und die gleichzeitige Exposition gegenüber beide dieser Zytokine induzieren nachweislich zu tolerogene Phänotyp in DCs36zu induzieren.

Seit der tolerogene DC von funktionellen Eigenschaften definiert ist, anstatt durch phenotypische Marker gibt es muss eine große eine einheitliche Methode zur zellulären und funktionelle Charakterisierung des TolDCs zu entwickeln. Darüber hinaus eine strenge und konsequente Protokoll muss für die einheitliche Bewertung und Charakterisierung von tolerogene DC-Phänotyp festgestellt werden, wenn wir effektiv und reproduzierbar die Möglichkeit neuer Wirkstoffe induzieren TolDC Phänotyp in vergleichen sollen die Labor. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll mit schrittweisen Methoden iDCs von hämatopoetischen Vorläuferzellen von Mäusen isolieren und anschließend die Wirksamkeit neuer Wirkstoffe in der Bewertungsphase für ihre Fähigkeit zur TolDCs, iDCs umzuwandeln analysieren bietet eine robuste phänotypische und funktionelle Charakterisierung des TolDCs in Vitro und in Vivo. Diese Beschreibung umfasst eine aufwändige Methode zur Charakterisierung des TolDCs durch ihre Oberfläche Liganden, Cytokine Profil und immunsuppressive Funktionen in Vitro. Wir bieten auch ein Beispiel für eine Methode, um die mögliche therapeutische Anwendung dieser TolDCs in einem präklinischen Modell der MS, Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu erkunden. Dieses etablierte Protokoll hilft Ermittlern auszuwertende die Kapazität der neuen Agenten, die Induktion von TolDCs zu fördern und die Bemühungen um die Ausweitung der therapeutischen Entwicklung TolDC erleichtern.

Protocol

Alle Studien wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Verfahren, die von der Case Western Reserve University School of Medicine der institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Vorbereiten des Knochenmarks-abgeleitete dendritischer Zellen (BMDCs) Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen. Einschläfern S…

Representative Results

Die Differenzierung und die Auswahl von BMDCs: Vorläuferzellen des Knochenmarks wurden komplette RPMI Medium im Beisein von GM-CSF und IL-4 in iDCs für 7 Tage (Abbildung 1A) differenzieren kultiviert. Am 1. Tag Zellen waren klein und zeigte sphärische Morphologie. Waschen mit PBS, bevor die Ersetzung der frisches Medium am Tag3 Zellen zur Form Cluster beigetragen und auch die Ein…

Discussion

Dieses Paper beschreibt ein effizientes Protokoll, das die reproduzierbar iDCs generieren und anschließend Unterscheidung in TolDCs verwendet werden kann, und wir schlagen vor, dies angewendet werden, kann um die Kapazität der neuen molekularen Ziel Agenten induzieren die TolDC bewerten Phänotyp. Wie in diesem Bericht beschrieben, folgten wir eine Sequenz, in der ersten TolDC Ausdruck der Oberfläche Liganden durch Durchflusszytometrie, gefolgt von einer Bewertung der DC Cytokine Profil qRT-PCR und ELISA gemessen anal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die Bereitstellung von CDDO DFPA Reata Pharma. Wir anerkennen auch die Unterstützung von Jane und Lee Seidman Lehrstuhl für Pädiatrie Krebs Innovation (John Letterio). Diese Arbeit wurde unterstützt vom Verteidigungsministerium [W81XWH-12-1-0452]; die Angie Fowler Jugendlichen und jungen Erwachsenen Krebs Forschungsinitiative an dem Fall Comprehensive Cancer Center; und dem Callahan Absolvent Scholar Award for Hsi-Ju Wei von f.j. Callahan-Stiftung.

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
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References

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Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
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