Summary
Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.
Abstract
Immunotherapy 또는 예방 접종에 대 한 새로운 치료 대리인의 평가, 대 한 림프 조직에서 면역 세포 활성화의 분석은 필수적입니다. 여기, 우리는 마우스에서 다른 관리 경로에서 나노 입자 형태로 소설 지질-DNA immunostimulant의 면역 효과 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥. 이러한 주사 직접 영향을 미치는 면역 반응, 그리고 수확 하는 림프 조직 하 고 조직에 수지상 세포 (DC) 활성화의 분석은 이러한 평가의 중요 한 부분. Mediastinal 림프 노드 (mLNs)의 추출은 크기와이 오르간의 위치 때문에 중요 하 그러나 매우 복잡 한. 사 타 구니 림프절 (iLN)만 대, 그리고 비장을 수확 cytometry에 의해 DC 활성화를 분석 하기 위한 단계적 절차를 설명 합니다.
Introduction
면역학 및 나노 의학, 약물 전달 및 immunostimulation를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 새로운 치료 전략의 지도 있다. 관리 경로 최적화 immunostimulatory 요원의 효능에 영향을 미치는 중요 한 측면 이다. (INP)로 구성 된 DNA immunostimulatory 나노 자기 조립 microphase 별거에 의해 지질-DNA1amphiphilic 구조 때문에 새로 개발된 된 나노 면역 보조 제 이다. 따라서, INP는 소재1 vivo에서 다른 경로 통해와 같은 사 타 구니 림프절 (iLN), mediastinal LN (mLN), 그리고 비장, 적절 한 조직의 수확에 대 한 세 가지 절차의 관리와 관련 된 프로토콜 설명. 마지막으로,이 조직 면역 시스템에 가장 강력한 항 원 제시 세포 수지상 세포 (DC) 활성화를 위해 분석 되었다. 이 프로토콜은 또한 항 원, 항 체, 또는 다른 면역 adjuvants2평가 하는 데 적용할 수 있습니다.
그것은 위대한 약속 표시는 에이전트 때문에 INP 공식 테스트. INP는 수용 체 통행세 같이 9 (TLR9) immunostimulation의 어떤 평가 대 한 효능은 다른 주입 방법3을 테스트 하는 데 필요한 핵 산을 포함 하는 보조 자료. 이러한 맥락에서 Dc의 자극은 비보에 평가 대 한 강력한 끝점입니다. 항 원 또는 immunostimulatory 분자는 주변 조직이 나 혈액에 DCs에 의해 phagocytosed, 후이 세포 림프 기관 장과 LNs4,5등을 마이그레이션합니다. 따라서, DC 활성화 비장, iLN, 및 주입 된 동물의 mLN에서 분석 했다. 제대로 수확이 조직의입니다 그러므로 또한 새로운 보조 또는 병원 체5에 면역 반응을 평가 하기 위한 중요 한. 이러한 조직 수확도 암 치료로 서 소설 면역학 방법론을 개발 하기 위해 중요 하다. 또한,이 프로토콜 안티 인간 면역 결핍 바이러스 치료제6같은 다른 약물의 효율성을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
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Protocol
동물 처리, 희생, 및 기관 격리를 포함 하 여 모든 실험 절차는 국제 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 보건 임상 센터와 서울 아산 병원의 규칙에 따라 수행 했다. 연구 프로토콜 상하이 보건 임상 센터에서 동물 실험의 윤리에 해당 위원회에 의해 승인 되었다 (마우스 프로토콜 번호: SYXK-2010-0098) 아산 의료 센터 (2016-02-168).
1입니다. 자료의 준비
참고: 나노 보조, INP, 자기 조립된 지질-DNA 캐리어, 즉 U4T의 구성 및 CpG 모티브 포함 oligonucleotide, eCpG, 마우스2에서에서 immunotherapy, 예방접종에 대 한 적절 한 주입 경로 테스트를 현재 연구에서 고용 했다 . 중요 한 것은, 항 원, 항 체, 및 보조 에이전트와 같은 다른 잠재적인 치료 분자 INP 대체 하실 수 있습니다 하 고 아래 설명 된 동일한 방법론을 사용 하 여 테스트.
- INP 정립2,,47
- Anneal U4T (160 µ M, 캐리어) eCpG (80 µ M, TLR9 주 작동 근 시퀀스가 포함 된)와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4)와 MgCl2 (2 mM) x 1의 존재. 어 닐 링에 대 한 표준 볼륨 PCR 튜브에서 50와 110 µ L 사이입니다. 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 천천히 thermocycler는을 사용 하 여 25 ° C를 (1 ° C/16 분)을 냉각. 어 닐 링 프로토콜 약 2 시간을 요구 한다.
주의: U4T 포함 된 액체 매우 거품 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다. - INP 준비; 50 µ L aliquots를 확인 각 주입에 대 한 자료의 50 µ L을 사용 합니다.
참고: 경우 주입 당 100 µ L, 재료의 적절 한 계산 단계 1.1 반복 합니다.
- Anneal U4T (160 µ M, 캐리어) eCpG (80 µ M, TLR9 주 작동 근 시퀀스가 포함 된)와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4)와 MgCl2 (2 mM) x 1의 존재. 어 닐 링에 대 한 표준 볼륨 PCR 튜브에서 50와 110 µ L 사이입니다. 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 천천히 thermocycler는을 사용 하 여 25 ° C를 (1 ° C/16 분)을 냉각. 어 닐 링 프로토콜 약 2 시간을 요구 한다.
2. 일반 동물 절차
참고: 쥐를 처리 하기 위한 대체 방법은 실험실 요구 사항 및 승인 된 동물 프로토콜8에 따라 사용할 수 있습니다. 사용 하는 마우스의 유형은 이다 6 주 된 C57BL/6과 여성 쥐.
- 재료의 목록
- 액체 마 취 제 (isoflurane), 마 취 기계, 이산화탄소 (CO2) 흡입 챔버, 멸 균된 거 즈, 집게, 마우스 restrainer, 장갑, 갈고리 집게, 1 인치 해가 위, 2-인치 해가 위, 알코올에 대 한 준비 살 균, 그리고 인슐린 주사기입니다.
- 흡입 마 취
참고: 마 취는 intranasal, 피하, 노상 강도, 그리고 쥐9정 맥 주사에 대 한 필수. 기화 기 기계와 산소 탱크 연결 유도 챔버를이 절차에 사용 됩니다.- 유도 챔버에서 동물을 놓고 단단히 뚜껑을 닫아야 합니다.
- 1 L/min에 산소 흐름을 isoflurane에 대 한 4%의 유도 단계로 기화 설정을 설정 합니다.
- 동물 동물 무게;에 따라 챔버에의 노출 시간을 다 그러나, 이상의 10의 노출 및 5 분 마다 모니터링은 마 취10필요.
참고: 없음 페달 반사 성공적인 마 취를 나타냅니다. - Isoflurane 인덕터를 끄고 직원 노출 isoflurane 가스를 방지 하기 위해 산소 1 L/min 흐름.
- 희생
- CO2 흡입 희생 "지침에 대 한 안락사의 설치류를 사용 하 여 이산화탄소" NIH에 따라 챔버 준비11.
- 동물 희생 완전히 확인 테스트 개 그 응답.
- 마우스의 발 끝을 곤란 하 고 개 그 응답을 확인 하 여 희생 제대로 확인 하십시오. 응답 경우 2.2 단계를 반복 합니다.
- 소독
- 주사 또는 알코올 스프레이와 멸 균된 거 즈 해 사용 하는 모든 표면 영역을 치료.
- 장기 저장
- 집게를 사용 하 여 모든 지방 및 수확된 장기 주변 혈액 제거 하. 3 mL의 PBS로 가득 페 트리 접시에이 수확된 조직을 개별적으로 저장 합니다. 컨테이너와 미디어는 후속 절차 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 사출 노선
- 6 주입 방법을 사용 하 여 주입-종속 면역 반응 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥8,,1213.
4입니다. 절연의 림프절과 비장
참고: 사용 하 여 젊고 건강 한 마른 쥐 (6 주 이전)이 일반적으로 더 오래 된 쥐에 있는 림프절 주위를 구축 지방 하기 어렵기 때문에 제거 하 고 장기의 적절 한 시각화를 방지할 수 있습니다.
- 미리 수확 단계
참고:이 섹션 iLN, 장과 면역 자극을 분석 하기 위한 마우스에서 mLN의 수확 후 주입 설명 합니다. 2.3-2.5 희생에 대 한 단계를 참조 하십시오, 응답, 및 소독 방법 개 그.- 수술 폼 보드를 마우스의 사지를 고정 하 고 70% 에탄올과 마우스의 복 부 측을 소독.
- 생식 기 지역 및 텐트 처럼 외부 피부 커버를 사용 하 여 연결 집게 위에 2 cm 위치를 선택 하십시오. 이 위치에는 대략 1 cm 컷을 확인 하 고가 위 (2 인치)는 피부를 더 절 개 상처 아래 슬라이드.
- 외피, 잘라 세로로 위 (2 인치)의 두 팔을 가진 외부 피부를 통해. 복 막으로 덮여 내부 장기를 노출 합니다.
- 피부의 바깥 레이어를 고정 합니다.
-
사 타 구니 림프절 (iLN)의 절연
- 기울어진된 문자 'Y'으로 표시 되는 왼쪽된 다리를 내리고 혈관의 함께 다음 다리의 왼쪽에는 iLN을 찾습니다.
참고: 피하 주입 된 쥐에 대 한 주입 위치의 같은 쪽에 iLN 선택 합니다. - 덮여 지질 층을 벗 겨 엷은 노란색 iLN (콩 모양, 2 mm)를 수확 하 두 집게와 레이어를 발견. 후속 처리 및 조직의 저장 단계 2.6 참조.
- 기울어진된 문자 'Y'으로 표시 되는 왼쪽된 다리를 내리고 혈관의 함께 다음 다리의 왼쪽에는 iLN을 찾습니다.
-
비장의 절연 14
- 텐트 사용 하 여 복 막의 중심에서 한 손에 집게를 연결 및 사용 하 여 작은 얇은 복을 다른 손에 (1 인치)가 위.
- 파악 하는 창 고 마우스 복 부의 왼쪽된 상단에 부착 된 빨간 콩 같이 비장 (약 14 m m의 길이)를 찾으려고 그것을 뒤집어 왼손에 놓은 사용 집게.
- 부드럽게 구부려 진된 집게와 다른 장기를 분리 하는 동안 오른손에 집게의 또 다른 세트와 함께 비장에 밖으로 당겨. 따라 단계 2.6 비장 저장 하.
참고: 관리는 필요한 때 수확 하는 비장, 그것 쉽게 손상 된 부드러운 기관으로.
-
Mediastinal 림프 노드 (mLN)의 절연
참고:는 mLN는 갈비뼈 아래 약 1cm 있으며 심장과 폐 등 다른 장기에 의해 덮여 있다. 위치와 작은 크기 때문에 그것은 신중 하 게 집게와가 위 (1 인치)를 사용 하 여 주변 영역을 노출 하는 것이 중요.- 막 고 갈비뼈에서 분리. 집게와 갈비뼈의 시체를 누른 다음 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈의가 (1 인치) 위로 잘라. 심 혼 및 폐를 노출 오른쪽에 마우스의 어깨 너머로 컷오프 갈비뼈를 고정 합니다.
참고: 주의 하지 잘라 심장과 폐, 주위 혈관의 혈액 유출 어려운 매우 작은 반투명 mLN를 찾을 수로. 어떤 혈관 잘립니다 경우 부드럽게 거 즈와 지역에서 혈액을 흡수. - 오른손에 갈고리 집게를 사용 하 여, 심 혼 및 폐는 오른쪽으로 부드럽게 백본 노출 될 때까지 플립. 왼손에 일반 집게의 쌍을 사용 하 여이 수확을 지원 하기 위해 오른손에 갈고리 집게와는 iLN을 제거.
- 폐를 백본 널리 노출 될 때까지 그들을 플립. MLN (반투명 콩 모양의 구조 크기에 약 2 m m)는 폐와 척추 사이 있습니다.
- 갈고리 집게는 mLN 주변 영역을 노출 하 고 조직을 추출 하는 다른 집게를 이용 한다.
참고:는 mLN 수확을 하기 전에 집게로 조심 스럽게 제거 해야 합니다 수많은 다른 조직에 의해 둘러싸여 있습니다. - 수확된 mLN 저장에 2.7 지침에 대 한 단계를 참조 하십시오.
- 막 고 갈비뼈에서 분리. 집게와 갈비뼈의 시체를 누른 다음 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈의가 (1 인치) 위로 잘라. 심 혼 및 폐를 노출 오른쪽에 마우스의 어깨 너머로 컷오프 갈비뼈를 고정 합니다.
5입니다. cytometry에 대 한 샘플의 준비
참고: 수확된 iLN 장과 mLN에서 Dc의 활성화, 시험을이 조직의 단일 셀 정지는 스테인드 DC 특정 마커, co-stimulatory 분자, 및 중요 한 조직 적합성 항 체 형광 활용 된 복잡 한 분자 cytometry 분석.
-
단일 셀 정지의 준비: 비장
- 6 m m 문화 요리에 신선한 문화 매체 (CM)의 5 mL을 추가 하 고 얼음에 샘플을 놓습니다.
- 주변 혈액과 지방 조직을 제거 하 고 조직 문화 접시의 뚜껑에 배치.
- 조직의 작은 조각으로 잘라 (< 1 m m) 곡선가 위. 뒤에 회전 하는 PBS에 파편을 일시 중단 아래로 5 분 646 × g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 및 제거는 상쾌한 조직.
- CM의 3 mL에 샘플을 다시 중단 하 고 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 콜라 4 20 분에 대 한 보충의 솔루션의 200 µ L 여 조각 소화.
- 부드럽게 흔들 및 1 h. 필터링 나일론 메쉬를 통해 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 (100 nm) 아래로 회전. PBS의 5 mL에 단일 셀을 세척 하 고는 상쾌한 원심 분리 하 여 제거.
- 다시 솔루션을 분리 하는 세포의 5 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 수성 층으로 레이어 스택 형태로 명확한 세포 격리 솔루션의 5 mL의 또 다른 레이어를 다시 로드.
- 10 분 구하는 가벼운 밀도 분수 상쾌한 2012 × g 에서 셀 준비 원심 (< 1.077 g/cm3), 이후의 흐름 cytometry 분석을 위해.
- hemocytometer 셀의 개수를 계산 합니다.
-
단일 셀 정지의 준비: 림프 노드
- 5.1.1-5.1.2를 단계를 따릅니다.
- 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 3-4 회를 pipetting으로 세포를 일시 중단 하는 CM의 5 mL를 추가 합니다. 철저 하 게 중단 후 셀을 사용 하 여 살 균 나일론 메쉬 15 mL 원뿔 튜브에 컬렉션에 대 한 셀을 필터링.
- 4 ° C에서 7 분 646 ×g 에서 아래로 셀 회전 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 10 mL 피펫으로 더 pipetting으로 세포를 일시에 CM의 추가 5 mL를 추가 합니다.
- PBS로 세척 하 고 셀의 수를 계산 합니다.
-
교류 cytometry 분석
- Aliquot 0.5-1 × 106 셀 정렬 (FACS) 튜브 각 형광 활성화 된 세포로.
- 5 분 동안 4 ° C에서 646 × g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
- 다시 셀 펠 릿과 소용돌이 일시 중단 하려면 셀에 5 µ L 희석 각각의 형광 활용 된 항 체 준비를 추가 합니다.
참고: 그것은 때문에 붙일 레이블된 항 체는 빛에 민감한 빛 노출 가능한 셀 펠 릿을 보호 하는 것이 중요. 항 체 마스터 믹스를 생성 하 고 항상 Fc 블록을 추가 합니다. - FACS 버퍼 PBS, 열 비활성화 일반 FBS, 및 0.1% 나트륨 아 지 드의 1%의 100 µ L를 사용 하 여 준비 합니다.
- 30 분 린스 FACS의 2-4 mL와 함께 셀 버퍼링 및 4 ° c.에 7 분 동안 1700 rpm에서 샘플 원심 4 ° C에서 튜브에 샘플을 배치
- 다시 어둠에 FACS 버퍼의 500 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다. Cytometry 셀 분석.
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Representative Results
INP 림프 조직 DC 활성화에 대 한 적절 한 주입 경로 평가 하려면 혈통으로 DC 인구는 -로 정의 된 CD11c+ , iLN, 장과 mLN에서 세포 및 co-stimulatory 분자의 식 수준 분석. INP 피하 (사우스 캐롤라이나) 및 정 맥 (i.v.) 주입의 치료 (그림 2B 와 2c) 장과 iLN Dc에 CD40, CD80 그리고 CD86 식에 상당한 증가 승진. 노상 강도 그리고 INP 또한 상당히 업 규제 CD40, CD80, 그리고 CD86 장과 iLN Dc에서의 식 수준 PBS 처리 제어 (그림 2B와 2c)에 비해의 복 (i.p.) 주입. 자극된 mLN Dc, intranasal (i.n.) 주입 INP의 PBS 처리 제어 (그림 2D)에 그에 비해 co-stimulatory 분자의 높은 최대 규칙 승진. INP의 i.p. 및 i.v. 주입 또한 mLN 구두, 사우스 캐롤라이나, 동안에 co-stimulatory 분자 식에 표시 된 증가 유도 하 고 노상 강도 주입 INP의 mLN Dc (그림 2D)의 활성화를 유도 하지 않았다.
그림 1 : 복 주입 지점 위치 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 정 맥 주입의 정확한 위치 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Cytometry에 의해 분석 하는 림프 기관에 DC 활성화. C57BL/6 마우스 했다 주입 INP와 6 다른 주입 경로 24 시간 후에 주입, 비장, iLN 및 mLN 수확 했다. (림프 조직 세포에서 A)는 DC 인구 계보 -CD11c로 정의 했다+ 라이브 백혈구 세포. (B-D) CD40, CD80 그리고 CD86 식 수준의 cytometry mLN (D)와 iLN (C), 비장 (B)에 의해 분석 되었다. 데이터는 6 개의 독립적인 샘플의 분석에서 평균입니다. 결과 의미 ± 표준 오차 (SEM) 의미의로 표현 됩니다. 실험 그룹 간의 차이의 통계적 의미 짝이 없는 학생의 t와 분산 분석을 사용 하 여 계산 했다-테스트. p-값 < 0.05 중요 하 게 고려 했다. * < 0.05, * * < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
나노기술과 면역학에서 많은 진보 약물 전달 및 immunostimulation의 치료 연구를 통해 달성 되었습니다. 주입 방법의 주의 깊은 선택이 현재 연구의 초점 이었다 immunostimulation에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다.
다른 주입 경로 자연스럽 게 비-독성 및 생 분해성 DNA 기반 소재에 대 한, INP (immunostimulatory 나노), 최고의 결과 굴복 하는 어떤 경로 확인 평가 했다. 이 접근은 또한 항 체, 항 원, 또는 다른 adjuvants을 포함 하 여 다른 치료제를 제공 하기 위한 관련.
이러한 주사 면역 반응 분석, 림프 조직 (비장, iLN, 및 mLN)의 수확이 필요 합니다. 림프 조직의 고립이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 이며 자세히 하지 이전 설명 되어 있는 기술의 사용을 요구. 또한, 면역 세포를 더 분석을 위한 단일 세포 현 탁 액의 준비 잘 설명 되지 않았습니다. 이 연구는 림프 조직의 추출에 초점을 맞춘 iLN, mLN, 및 비장, DC 활성화의 분석을 위해 특히. 조직 활성화는 면역 반응의 면역 세포는 비장에 통해 주로 발생 했습니다. 또한, 특정 조직에서 면역 반응 근처 림프절에 의해 통제 되었다. 새로 개발된 된 면역 modulatory 분자의 평가 분자 조직에서 면역 자극을 일으킬 수 있는지 여부를 결정 하기 위해 실시 한다. 따라서, 림프 조직 격리 및 조직에 DC 활성화의 분석 방법은 새로 개발된 된 면역 물질로 분자에 대 한 사용할 수 있습니다.
INP의 면역 물질로 효과 평가 하려면 iLN, mLN, 그리고 비장 수확 했다 고 INP 림프 DC 활성화 촉진을 표시 했다. 이전 결정, INP는 효과적으로 쥐2Dc에서 TLR9 자극 대상. 대 식 세포는 또한 쥐에 있는 cytosolic TLR9 표현 한다. 따라서, INP 주입 DC 및 대 식 세포 활성화를 유도 수 있습니다. 그러나, 대 식 세포 조직에 미생물의 식 균 작용에 기여 하는 주변 조직에 거주. 또한, 항 원-프레 젠 테이 션 능력 및 대 식 세포의 림프 조직에 철새 효과 comparably Dc에 비해 약한 있습니다. 따라서, 면역 물질로 효과 INPs의 주입 경로 평가 림프 조직에서 Dc를 검토를 위해 적당 했다.
따라서, 면역 보조 제 관리의 성공적인 immunotherapy, 부드러운 소재를 사용 하 여 예방접종을 달성 하기 위해 매우 신중 하 게 고려 되어야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 창작 자료 검색 프로그램 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신 및 미래 계획 (NRF-2017M3D1A1039421)와 해양 생명 공학 프로그램에 의해 자금을 자금에 의해 지원 되었다는 사역의 바다 수 산업, 한국 및 그랜트 (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
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