Summary
リンパの樹状細胞の活性化をテストするリンパ組織のそれに続く抽出の実験の手順を免疫ナノマテリアルの治療後。
Abstract
免疫療法やワクチン接種の新しい治療薬の評価、リンパ組織で免疫細胞の活性化の解析が不可欠です。ここでは、マウスの異なる投与経路からナノ粒子の形態での新規脂質 DNA 免疫賦活剤の免疫学的影響について調べた: 口腔・鼻腔内・皮下・足蹠、腹腔内、および静脈内投与。免疫反応とリンパ組織の収穫、これらの注射は直接影響、組織における樹状細胞 (DC) 活性化の分析はこれらの評価の重要な部分です。縦隔のリンパ節 (mLNs) の抽出が重要な非常に複雑なサイズとこの器官の位置のためです。鼠径リンパ節 (iLN)、百万、および脾臓を収穫し、フローサイトメトリーによる DC の活性化を分析するための段階的な手順を説明します。
Introduction
免疫学およびナノ材料の進歩は、生物医学、薬剤投与や免疫刺激などでアプリケーションの潜在的な新しい治療戦略の豊かさにつながっています。投与経路の最適化は、免疫刺激剤の有効性に影響を与える重要な側面です。DNA から成る免疫活性化ナノ粒子 (INP) は脂質 DNA1の両親媒性構造のためミクロ相分離法による自己組織化、新たに開発したナノ免疫アジュバントです。したがって、材料1の体内の別ルート、および鼠径リンパ節 (iLN)、縦隔の LN (mLN) や脾臓など、適切な組織を収穫するための 3 つの手順による管理を含む INP のプロトコル説明します。最後に、これらの組織は、樹状細胞 (DC) の活性化、免疫システムの最も強力な抗原提示細胞を分析しました。このプロトコルは、抗原、抗体、免疫アジュバントの他の2の評価にも適用できます。
偉大な約束を示しているエージェントである INP の定式化をテストしました。INP は Toll 様受容体 9 (TLR9) 免疫刺激のどの評価の有効性が別の射出成形方法3をテストに必要な核酸を含む補助材料。このコンテキストでは、DCs の刺激は生体内の評価のため強力なエンドポイントです。抗原や免疫活性化の分子は、末梢組織や血液での Dc によって貪食されて後、これらの細胞は LNs4、5脾臓などのリンパ器官に移行します。したがって、脾臓、iLN、注入された動物の mLN の DC の活性化を行った。従って、正しくこれらのティッシュの収穫は5新規アジュバントまたは病原体に対する免疫応答の評価のために重要ではまたです。このような組織の採取も癌治療としての新しい免疫学的方法論を開発するため重要です。さらに、このプロトコルは、他の薬剤、抗ひと免疫不全ウイルス治療6の性能を検証する使用できます。
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Protocol
国際動物ケアおよび使用委員会上海公衆衛生臨床センターとソウル峨山病院のルールに従い、動物のハンドリング、犠牲、および器官の分離を含むすべての実験プロシージャを行った。それぞれ上海公衆衛生臨床センターで動物実験の倫理委員会で承認された研究プロトコル (マウス プロトコル番号: SYXK 2010-0098) とソウル峨山病院 (2016-02-168)。
1 材料の準備
注: ナノ アジュバント、INP から成る自己組織化脂質 DNA キャリア、すなわち U4T と CpG モチーフ含むオリゴヌクレオチド、eCpG、マウス2 における免疫療法と予防接種のための適切な注入ルートをテストするのには現在の研究で採用されました。.重要なは、抗原、抗体、および補助治療剤などその他の潜在的な治療上の分子は INP の代わりに使用することができます、以下の同じ方法を使用してテストします。
- INP 製剤2,4,7
- U4T をアニール (160 μ M、キャリア) eCpG (80 μ M、TLR9 アゴニスト シーケンスを含む) とリン酸緩衝食塩水 (PBS、pH 7.4) と MgCl2 (2 mM) x 1 の存在。アニーリングのための標準的なボリュームは、PCR チューブに 50 と 110 μ L の間です。95 ° C 10 分の混合物を加熱し、たちを使用して 25 の ° c (1 ° C/16 分) をゆっくりと冷却します。アニーリングのプロトコルには、約 2 時間が必要です。
注意: U4T 含む液体非常に泡沫は、慎重に処理する必要があります。 - INP 準備; 50 μ 因数を作る各注入のための材料の 50 μ L を使用します。
メモ: 注入量 100 μ の場合、食材の適切な計算のステップ 1.1 を繰り返します。
- U4T をアニール (160 μ M、キャリア) eCpG (80 μ M、TLR9 アゴニスト シーケンスを含む) とリン酸緩衝食塩水 (PBS、pH 7.4) と MgCl2 (2 mM) x 1 の存在。アニーリングのための標準的なボリュームは、PCR チューブに 50 と 110 μ L の間です。95 ° C 10 分の混合物を加熱し、たちを使用して 25 の ° c (1 ° C/16 分) をゆっくりと冷却します。アニーリングのプロトコルには、約 2 時間が必要です。
2. 一般的な動物の手順
注: マウスを処理するための代替メソッドは、研究室の要件と承認された動物のプロトコル8に応じて使用できます。マウス使用の型は、6 週齢の C57BL/6 と女性のマウスです。
- 材料のリスト
- 液体麻酔薬 (イソフルラン)、麻酔器、二酸化炭素 (CO2) 吸入室、滅菌ガーゼ、鉗子、マウス落、手袋、フック鉗子、解剖はさみを 1 インチ、2 インチ解剖はさみのためのアルコールを準備します。インスリン注射器の滅菌、.
- 吸入麻酔
注: 麻酔は鼻腔内・皮下・足蹠とマウス9の静脈内注射のため必須です。接続されている気化器マシン、酸素タンクと誘導の商工会議所は、この手順に使用されます。- 誘導室に動物を置き、しっかりふたをしめてください。
- 1 L/分で酸素を流し、気化器設定をイソフルランの 4% の誘導レベルに設定します。
- 動物動物の体重に応じて商工会議所での露光時間は異なるただし、以上 10 s の露出と 5 分ごとの監視は麻酔10に必要な。
注: ペダル反射に十分な麻酔がないです。 - イソフルラン インダクタの電源を切り、1 L/分イソフルラン ガス人事の露出を防ぐために酸素の流れ。
- 犠牲
- NIH のガイドラインの安楽死の齧歯動物を使って「二酸化炭素」に従い2吸入犠牲 CO のチャンバー準備11。
- 動物が完全に犠牲になることを確認するテストのギャグの応答。
- マウスがその足の先端をつまんで、ギャグ応答確認なしで犠牲に正しくことを確認します。応答がある場合は、手順 2.2 を繰り返します。
- 消毒
- 注射やアルコール スプレーと滅菌ガーゼ解剖用の全表面積を消毒します。
- 臓器保存
- すべての脂肪と血収穫器官の周囲を削除するのに鉗子を使用します。3 ml PBS のシャーレで収穫された組織を個別に保存します。コンテナーとメディアは、手続要件に応じて異なる場合があります。
3. 注射ルート
- 6 注入法を使用して、注入依存性免疫応答を調査する: 口腔・鼻腔内・皮下・足蹠、腹腔内、および静脈内投与8,12,13。
4. リンパ節および脾臓の分離
注: は、通常古いマウスのリンパ節まわりで造り上げる脂肪が困難なため、これらの手順若くて健康な無駄のないマウス (6 週齢) を使用を削除し、器官の適切な可視化を防ぐことができます。
- 収穫前の手順
注: このセクションでは、iLN と脾臓の免疫刺激を分析するためのマウスからの mLN の投与後の収穫について説明します。手順 2.3 2.5 犠牲を参照して、応答、および消毒方法をギャグします。- 手術の発泡ボードにマウスの四肢をピンし、70% のエタノールでマウスの腹側を滅菌します。
- 陰部やテントのような外側の皮膚カバーを引き抜くフック使用鉗子の上 2 cm の場所を選択します。この場所に約 1 cm カットをする、さらに郭清カットを行って、皮膚の下にはさみ (2 インチ) をスライドさせます。
- 外皮を両腕をはさみ (2 インチ) の外側の皮膚を縦にカットします。腹膜で覆われている臓器の内部を公開します。
- 皮膚の外側の層をピンします。
-
鼠径リンパ節 (iLN) の分離
- 傾斜文字 'Y' として表示されます左の足の下に行く血管の接続詞の後、足の左側に iLN を探します。
注: 皮下注入されたマウスは、注入の場所の同じ側に iLN を選択します。 - 覆われた脂質層の取り込みし、淡い黄色の iLN (豆の形、2 mm) を収穫する 2 つの鉗子でレイヤーを明らかにします。その後の治療、組織のストレージは、2.6 の手順を参照してください。
- 傾斜文字 'Y' として表示されます左の足の下に行く血管の接続詞の後、足の左側に iLN を探します。
-
脾臓の分離14
- 腹膜を使用しての中心にテント片手に鉗子をフックと薄い小さなを使用は、腹膜を削減する一方で (1 インチ) をはさみ。
- 腸を把握しマウスの腹部の左上に接続されている赤い豆のような脾臓 (約 14 mm の長さ) を見つけてそれをひっくり返して左手でフック使用鉗子。
- フック鉗子で他の臓器を切り離すに右手の鉗子の別のセットを持つ脾臓をそっと抜く。2.6 脾臓を格納するための手順に従ってください。
注: 注意が必要、脾臓を収穫すると簡単に破損した柔らかい器官であります。
-
縦隔のリンパ節 (mLN) の分離
注: mLN は、肋骨の下に約 1 cm の位置し、心臓や肺などの他臓器によって覆われています。位置、サイズが小さいため慎重にピンセットとはさみ (1 インチ) を使用して周辺地域を公開することが重要です。- 横隔膜を切り、肋骨からデタッチします。鉗子で肋骨体を押しはさみ (1 インチ) と肋骨の左右をカットします。心臓や肺を公開する権利をマウスの肩越しにカットオフの肋骨を固定します。
注: 血液を漏れにくく非常に小さな半透明の mLN を検索、心臓や肺、まわりの血管のいずれかを切らないように気を取る。すべての血管を切り取り場合は、優しく地区にガーゼで血液を吸収します。 - 心臓や肺、右に優しく、バックボーンを公開するまで、フリップ フック鉗子を使用すると、右の手で。左手に通常鉗子のペアを使用して、この収穫を支援する右手のフック鉗子で、iLN を削除します。
- 肺をつかむし、バックボーンは、広くさらされるまで、それらを反転させます。MLN (半透明豆形の構造サイズで約 2 mm) が肺と脊椎の間に位置します。
- フック鉗子の mLN の周りの領域を公開して、組織を抽出する他の鉗子を利用します。
注: mLN は、収穫前にピンセットで慎重に削除する必要があります他の多くの組織によって囲まれています。 - 収穫の mLN を格納するための手順 2.7 を参照してください。
- 横隔膜を切り、肋骨からデタッチします。鉗子で肋骨体を押しはさみ (1 インチ) と肋骨の左右をカットします。心臓や肺を公開する権利をマウスの肩越しにカットオフの肋骨を固定します。
5 フローサイトメトリー用試料の調製
注: 収穫 iLN と脾臓の mLN の Dc の活性化を測定するには、これらの組織の単一細胞懸濁液と汚れる DC 固有マーカー、共刺激分子と主要組織適合抗原として抗体を蛍光共役複雑です分子とフローサイトメトリーで分析しました。
-
単一細胞懸濁液の調製: 脾臓
- 6 mm 培養皿に新鮮な培養液 (CM) 5 mL を追加し、氷の上、サンプルを置きます。
- 周囲の血液や脂肪組織を取り出し、培養皿の蓋に組織を置きます。
- 組織を小さな断片にカット (< 1 mm) 曲線はさみで。回転続く PBS でフラグメントを停止ダウン組織 646 × gで 5 分間遠心分離機を使用して、上清を除去します。
- CM の 3 mL のサンプルを再度中断、2% 牛胎児血清 (FBS) 20 分 IV コラゲナーゼを添加した溶液 200 μ L を持つフラグメントを消化します。
- 軽く振るし、1 h. フィルター ナイロン メッシュを通して消化組織の 37 ° C でサンプルをインキュベート (100 nm) とそれらを回転停止。5 mL の PBS の単一セルを洗浄し、遠心分離により上澄みを除去します。
- 再を 5 mL ソリューションを分離するセルのセルを中断します。水性の層によってスタックを形成する明細胞分離溶液 5 mL の別の層を再ロードします。
- 遠心分離機の 2012年 × gで 10 分取得軽い密度分数は、培養上清のセル準備 (< 1.077 g/cm3)、その後フローサイトメトリー解析のため。
- 診断とセルの数をカウントします。
-
単一細胞懸濁液の調製: リンパ節
- ステップ 5.1.1-5.1.2 に従ってください。
- 3-4 回のピペッティングにより細胞を中断する 10 mL のピペットを使用した CM の 5 mL を追加します。徹底的にセルの中断後に、、15 mL の円錐管のコレクションのセルにフィルターを適用するのに滅菌ナイロン メッシュを使用します。
- 646 ×gは 4 ° C で 7 分間ダウン セルをスピンして、上清を除去します。
- 良くピペッティングにより細胞を中断する 10 mL ピペットに CM の追加 5 mL を追加します。
- PBS で洗浄し、セルの数をカウントします。
-
フローサイトメトリー解析
- 分注 0.5 1 × 106セル (FACS) チューブを並べ替え、各蛍光活性化セルに。
- 646 × gで 5 分 4 ° C で遠心し、上清を吸引します。
- 5 μ L 希釈それぞれの蛍光標識抗体作製を再細胞ペレットと渦を中断するセルに追加します。
注: 蛍光に分類された抗体は、光に敏感なのでできるだけ多くの露光から細胞ペレットをシールドすることが重要です。抗体マスター ミックスを生成し、常に Fc ブロックを追加します。 - 100 μ L の PBS、通常国債の熱不活化、0.1% アジ化ナトリウムの 1% を使用して FACS バッファーを準備します。
- 4 ° c 30 分リンス FACS の 2-4 ml 細胞バッファーし、は 4 ° C で 7 分間 1700 rpm でサンプルを遠心チューブのサンプルを配置します。
- 500 μ L の暗闇の中で FACS バッファー内のセルを再停止します。フローサイトメトリーによる細胞を分析します。
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Representative Results
INP のリンパ組織 DC の活性化のための適切な注入ルートを評価、系統として DC の人口を-として定義 CD11c+ 、脾臓、iLN、mLN 細胞し、共刺激分子の発現レベルを分析します。皮下 (サウスカロライナ) と静脈 (静脈) 注射による INP の治療は脾臓、iLN dcs (図 2 bおよび2 C) CD40、CD80、CD86 式の大幅な増加を推進しました。足蹠と INP もかなり調整された PBS 治療コントロール (図 2 bおよび2 C) に比べて CD40、CD80、CD86 脾臓、iLN の Dc での表現のレベルの投与した腹腔内 (i. p.)。刺激 mLN Dc、INP の鼻腔内 (i.n と) 注入は PBS 治療コントロール (図 2 D) と比較して共刺激分子の最高まで規制を推進しました。INP のi. p. ・静脈内注射も経口、皮下中、隔における共刺激分子式の顕著な増加と INP の足蹠注射 mLN (図 2 D) の Dc の活性化を誘発しなかった。
図 1: 腹腔内注入ポイントの位置この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 静脈注射の正確な位置この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: フローサイトメトリーで分析したリンパ系器官の DC アクティブ化。六つの異なる注射ルートと 24 h 注入、脾臓、iLN、百万が収穫された後 c57bl/6 マウスは、INP を注入しました。(リンパ組織の細胞に A) の DC の人口はリネージュ-CD11c として定義されたライブの白血球細胞の+ 。(B D)CD40、CD80、CD86 の発現レベルは、脾臓 (B)、(C)、iLN mLN (D) フローサイトメトリーによって分析されました。六つの独立したサンプルの分析から平均データであります。結果は、平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差として表されます。実験群間差の統計的有意性を求めた分散分析を用いた独立スチューデントのt-テストします。p 値 < 0.05重要な考慮されました。* < 0.05 * * < 0.01 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ナノテクノロジーと免疫は多くの進歩は、ドラッグデリバリーや免疫刺激の治療法の研究によって達成されています。注入法の慎重な選択は、本研究の焦点だった、免疫刺激のため重要であると知られています。
当然のことながら非毒性と生分解性 DNA ベース材料、INP (免疫活性化ナノ粒子)、どのルートが最善の結果を得られた決定するためのルート別の射出成形を行った。このアプローチは、抗体、抗原、または他のアジュバントを含む他の治療剤を提供するためまたものです。
このような注射する免疫応答を分析するには、リンパ組織 (脾臓、iLN、百万) の収穫が必要です。リンパ組織の分離は、このプロトコルの最も重要な側面し、詳細に以前記載されていないテクニックの使用が必須します。さらに、さらに免疫細胞を分析するための単一細胞懸濁液の準備は適切に説明されていません。本研究は、リンパ組織の抽出に焦点を当てて特に iLN、百万、および DC の活性化を分析するため、脾臓。免疫応答の全身の活性化は、主に脾臓の免疫細胞を発生しました。さらに、特定の組織の免疫反応は、近くのリンパ節によって制御されました。分子が、体内の免疫刺激を引き起こすことができるかどうかを決定するため、新開発の免疫調節分子の評価を実施しなければなりません。したがって、新開発の免疫刺激分子の DC の活性化組織のリンパ組織の分離と解析の方法を使用できます。
INP の免疫刺激効果の評価、iLN、百万、および脾臓が収穫され、INP はリンパの DC の活性化を促進するために示されました。以前に決定された INP は効果的にマウス2dcs TLR9 刺激を対象します。マクロファージはまたマウスのゾル性細胞質の TLR9 を表現します。したがって、INP 注入は、DC とマクロファージの活性化を引き起こす可能性があります。しかし、マクロファージは、体内微生物の貪食能に寄与する末梢組織に存在します。また、抗原提示能力とマクロファージのリンパ組織の渡り鳥効果、Dc よりも比較的弱い。したがって、免疫促進効果の INPs の注入経路を評価リンパ組織で Dc を調べるに適しただった。
したがって、免疫アジュバント投与方法は、成功した免疫療法やワクチン ソフト素材を使用して達成するために非常に注意深く考慮されなければなりません。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は創造的な材料探索プログラムを通じて国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および将来計画 (NRF 2017M3D1A1039421)、海洋バイオ テクノロジー プログラムによって資金を供給された資金を供給に支えられ、省の海洋と水産、韓国および補助金 (20150220)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
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