Summary
ويرد هنا، وسيلة لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. هذا البروتوكول له ميزة واضحة لإنتاج ميكروفيسيل المخصب العائد مع البروتين مقبول عينات من الحيوانات الفردية. ثم يمكن استخدام عينات لتحليل البروتين قوية في البطانة ميكروفاسكولار الدماغ.
Abstract
حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) من أنسجة حيوية حاجز الذي يستجيب لمختلف المثيرات الفيزيولوجية المرضية والدوائية. هذه التغييرات الناتجة عن هذه المحفزات يمكن إلى حد كبير تعدل إيصال المخدرات إلى الدماغ، واستطراداً، يسبب تحديات كبيرة في علاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض. التغيرات BBB الكثيرة التي تؤثر على العلاج الصيدلاني، تنطوي على البروتينات التي هي مترجمة وأعرب على مستوى الخلايا البطانية. في الواقع، هذه المعرفة في علم وظائف الأعضاء BBB في الصحة والمرض أثارت اهتماما كبيرا في دراسة هذه البروتينات الغشاء. من وجهة نظر بحوث علوم أساسية، وهذا يعني الحاجة إلى طريقة بسيطة ولكنها قوية واستنساخه لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ حصادها من الحيوانات التجريبية. بغية إعداد عينات غشاء من ميكروفيسيلس طازجة معزولة، من الضروري أن الاستعدادات عينة أثري في خلايا بطانية لكن يقتصر حضور أنواع الخلايا الأخرى لوحدة نيوروفاسكولار (أي، أستروسيتيس، ميكروجليا، والخلايا العصبية، بيريسيتيس). ميزة إضافية هي القدرة على إعداد عينات من الحيوانات الفردية من أجل التقاط التغير الحقيقي التعبير البروتين في حالة سكان تجريبية. في هذه المخطوطة، ترد تفاصيل فيما يتعلق بطريقة التي تستخدم لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. تخصيب ميكروفيسيل، ومن العينات المستمدة، يتحقق باستخدام أربع خطوات استخدام الطرد المركزي حيث يتم تضمين ديكستران في المخزن المؤقت للعينة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة بمختبرات أخرى للتطبيقات الخاصة بهم. وقد أظهرت العينات التي تم إنشاؤها من هذا البروتوكول أن تسفر عن بيانات تجريبية قوية من البروتين تحليل التجارب التي يمكن أن تساعد إلى حد كبير فهم الاستجابات BBB للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية.
Introduction
حاجز الدم في الدماغ (BBB) موجود في مجال التفاعل بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدوران الجهازي وتلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على التوازن في الدماغ. على وجه التحديد، مهام BBB دقة التحكم ذائبة التركيزات في الدماغ السائل خارج الخلية وكفاءة توفير تلك العناصر الغذائية المطلوبة بواسطة أنسجة المخ للوفاء بمطالب الأيضية كبيرة الجهاز العصبي المركزي1. هذه الأدوار يعني أن بي بي بي، القائم أساسا على مستوى الخلية البطانية microvascular، يجب أن تمتلك الآليات المنفصلة التي تمكن بعض المواد للوصول حمة الدماغ مع ضمان أن لا يمكن أن تكون ضارة xenobiotics تتراكم. في الواقع، خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ليست فينيستراتيد ويحمل pinocytosis محدودة، مما يضمن عدم نفاذية غير انتقائية2. بالإضافة إلى ذلك، أعرب خلايا المخ ميكروفيسيل بطانية البروتينات مفرق ضيق مفرق وأدهيرينس أن تتصرف بشكل مادية "ختم" بين الخلايا المتجاورة بطانية وتقيد إلى حد كبير باراسيلولار نشر المواد المنقولة بالدم في الدماغ حمة. في الواقع، يتطلب انتقائية نفاذية المواد الداخلية والخارجية للتعبير الوظيفي من الناقلين الإقبال وافلوكس3. تقاطعات عموما، ضيق، والوصلات أدهيرينس والناقلين العمل يدا واحدة للحفاظ على خصائص فريدة من نوعها الحاجز بي بي بي.
BBB هو حاجز حيوي الذي يستجيب للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية. على سبيل المثال، الإجهاد نقص/ريوكسيجينيشن قد ثبت أن تعدل تعبير البروتينات مفرق ضيق الحرجة (أي، أوككلودين، زونولاي أوككلودين-1 (زوي-1))، الذي يرتبط مع باراسيلولار زيادة نفاذية لعلامات الأوعية الدموية مثل كما السكروز4،،من56. ملاحظات مماثلة بذلت في بي بي بي في الإعداد للدماغ إصابة7 و8،الألم التهابات الطرفية9. يمكن أيضا أن تعدل هذه الأمراض نفس آليات النقل في BBB10،11،12،،من1314. والواقع أن يعزز إصابة نقص/ريوكسيجينيشن التعبير الوظيفي للعضوية شاردة نقل 1a4 ببتيد (Oatp1a4) في بي بي بي، الذي يمكن أن يؤدي إلى زيادات كبيرة في نقل الدم إلى الدماغ من ركائز النقل أواتب محددة مثل توروتشولاتي واتورفاستاتين13. ويمكن أيضا تغيير خصائص BBB بالعلاج الصيدلاني نفسه، إليه التي يمكن أن تشكل أساسا لكل التغيرات العميقة في فعالية العقاقير في الدماغ والتفاعلات المخدرات-المخدرات. على سبيل المثال، أسيتامينوفين أهداف مستقبلات النووية آليات إرسال الإشارات في خلايا الدماغ بطانية microvascular، يزيد التعبير الوظيفي للناقل efflux الحرجة فبروتين سكري (ف-gp)، ويعدل التسكين تعتمد على الوقت يمنحها المورفين، المخدرات مسكن افيوني والمنشأة فسباق الجائزة الكبرى والنقل الركازة15. فهم دقيق للتغيرات BBB، الذي يمكن أن يتسبب بالأمراض أو بالمخدرات، كما يتطلب تحديد وتوصيف الآليات التنظيمية المحددة التي تتحكم في هذه التعديلات. وفي الواقع، قد حددت مسارات الإشارات المنفصلة في خلايا بطانية microvascular الدماغ التي تتحكم في التعبير الجزيئي من مفرق ضيق البروتينات16،17 ومتعهدي النقل15، 18،19. وتشير هذه الملاحظات مجتمعة إلى أن مسارات جزيئية معقدة تشارك في تنظيم تقاطعات ضيق BBB والناقلين في الصحة والمرض.
تحديا كبيرا في دراسة BBB هو الشرط المطلق لطريقة بسيطة وفعالة لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ المستمدة من الحيوانات التجريبية وإعداد عينات الغشاء اللاحقة. يجب أن يكون مستعدا هذه العينات حيث أن هي على حد سواء أثرت في خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ومحدودة في وجود أنواع الخلايا الأخرى. على مدى السنوات العديدة الماضية، أبلغ عن منهجيات متعددة لعزل ميكروفاسكولاتوري من الدماغ القوارض في المؤلفات العلمية13،20،،من2122. توضح هذه المقالة بسيطة، قوية، وأسلوب استنساخه لعزل ميكروفيسيلس من الدماغ الفئران وإعداد عينات غشائي غشاء عالي التخصيب التي يمكن استخدامها لتحليل التعبير البروتين. ميزة هذا البروتوكول العزلة ميكروفيسيل هو القدرة على الحصول على عينة الاستعدادات ذات جودة عالية ومع كافية البروتين العائد من الحيوانات تجريبية فردية. وهذا يتيح النظر في التفاوت بين الحيوانات في التعبير البروتين. مثل سلفه في هذا البروتوكول قد تحسنت كثيرا على متانة الدراسات بي بي بي لأنه يمكن الآن تجنب الإفراط في تقدير (أو بخس التقدير) من الحجم الحقيقي للتغييرات البروتين في بي بي بي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدراج عدة خطوات استخدام الطرد المركزي مع ديكستران تخصيب محسنة من ميكروفيسيلس في العينات التجريبية بينما يسهل إزالة المكونات الخلوية غير المرغوب فيها مثل الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات المذكورة أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) وتتفق مع المعاهد الوطنية للصحة (NIH) و "البحوث الحيوانية": فيفو في تجارب (سيصلون) المبادئ التوجيهية للإبلاغ. تدفق الإجرائية للبروتوكول هو مبين في الشكل 1.
1-الإعداد لإجراء
- إعداد المخزن المؤقت ميكروفيسيل الدماغ (BMB). ابدأ بوزنها 54.66 ز د-المانيتول، ز 1.90 عطا، وقاعدة 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (أي تريس) ز 1.46 في كوب نظيف. إضافة 1.0 لتر مياه. خلط مكونات BMB المخزن المؤقت باستخدام محرض مغناطيسية. بمجرد الحل قد تم خلطها بشكل تام، ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام 1.0 M HCl.
- تحضير محلول ديكستران (75,000 ميغاواط) 26% (w/v) قبل أنيسثيتيزينج الحيوانات. إعداد الحل ديكستران كما هو موضح في الخطوات التالية.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يعد هذا الحل قبل الموعد المحدد لأنه يمكن أن يستغرق ديكستران حوالي 1.5-2 ح تذوب في المخزن المؤقت مائي.- تزن من ديكستران مسحوق (26 غرام لكل 100 مل المخزن المؤقت) في كوب نظيف.
- قياس حجم المناسبة BMB والاستغناء عن داخل دورق منفصلة، ونظيفة.
- صب ببطء BMB في الكأس التي تحتوي على مسحوق ديكستران. مزيج ديكستران المجفف يدوياً أثناء صب BMB استخدام قضيب تحريك زجاج.
- قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 1.0 M HCl السابقة مباشرة لاستخدام.
ملاحظة: عزل نموذجية من ميكروفيسيلس الدماغ من 12 من الفئران سبراغ داولي الفردية (ذكرا كان أو أنثى؛ 3 أشهر عمر؛ 200-250 غم) يتطلب 200 مل من محلول ديكستران (أي، ديكستران ز 52 في 200 مل BMB).
2-استخراج أنسجة المخ من الفئران سبراغ داولي
- بعد العلاج التجريبي المرجوة، تخدير الفئران سبراغ داولي استخدام الكيتامين (50 مغ/كغ؛ القائمة 2.5 مل/كغ) وإكسيلازيني (10 ملغ/مل؛ 2.5 مل/كغ الأول، ف.). تضعف من الكيتامين وإكسيلازيني في المحلول الملحي 0.9 في المائة إلى تركيزات النهائي من 20 ملغ/مل و 4.0 ملغ/مل على التوالي. Euthanize الحيوانات بقطع الرأس باستخدام مقصلة شحذ وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. استخدام نفس الإجراء لكل من الذكور والإناث من الفئران سبراغ داولي.
- يرسخ الجلد من الجمجمة الفئران بصنع قطع عرضية واحدة باستخدام مقص جراحي.
- باستخدام رونجيورس، بعناية إزالة لوحة الجمجمة وكشف الدماغ.
- إزالة الدماغ باستخدام ملعقة. فصل في المخ وأنسجة المخ معزولة في أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 5 مل BMB. إضافة ميكروليتر 1.0 من مثبطات البروتياز كوكتيل كل مل 1.0 BMB المخزن المؤقت فورا قبل الاستخدام.
3-تجهيز الدماغ
- نقل أنسجة المخ من أنبوب مخروطي 50 مل إلى طبق بتري نظيفة.
- استخدام الملقط، لفة بلطف الدماغ على ورق الترشيح قطرها 12.5 سم لإزالة السحايا الخارجي، الذي فضفاضة التقيد بقشرة الدماغ. اضغط أنسجة المخ ضد تصفية الورق برفق ودحر الأنسجة مرة أخرى. تحويل ورقة تصفية كثيرا أثناء هذه الخطوة.
- فصل الضفيرة شرويد من نصفي الكرة الدماغي استخدام الملقط.
ملاحظة: يظهر الضفيرة شرويد كنسيج غشائي واضحة مترجمة إلى سطح البطينين الدماغي. - بلطف تسطيح أنسجة المخ وإزالة السحايا والمصابيح شمي استخدام الملقط المتبقية.
- وضع أنسجة المخ القشرية في هاون زجاج مبردة. إضافة مل 5.0 من BMB مثبط البروتياز المحتوية على الكوكتيل بقذائف الهاون.
- باستخدام الخالطون الكهربائية علوية، مجانسة أنسجة المخ باستخدام 15 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية 3,700 لفة في الدقيقة. إجراء تجانس استخدام طاحونة أنسجة مل 10 قذائف هاون ومدقة. بين تجانس كل عينة فردية، قم بتنظيف مدقة استخدام الإيثانول 70%.
ملاحظة: التجانس السكتات الدماغية ينبغي أن تكون متسقة من حيث وتيرة وحجم. - من أجل هوموجيناتي في أنابيب الطرد المركزي المسمى.
4-الطرد المركزي الخطوات
- إضافة 8.0 مل محلول ديكستران 26% لكل أنبوبة الطرد المركزي المسماة التي تحتوي على هوموجيناتي الدماغ.
- عكس الأنبوب مرتين ومن ثم دقة دوامة العينة. إجراء فورتيكسينج لكل عينة باستخدام زوايا متعددة لضمان خلط دقيق للدماغ هوموجيناتي الحل مع الحل ديكستران 26%.
- عينات من أجهزة الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لبعض التحليلات، أنه مفيد لمقارنة ميكروفيسيلس الدماغ مع حمة الدماغ. ينبغي أن يكون تقييم التعبير البروتين في الدماغ حمة المطلوبة، المادة طافية من هذه الخطوة الطرد المركزي (أي المخ متني الكسر) يمكن جمعها وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. - إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ والزجاج ماصة باستور.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لعدم الإزعاج بيليه. خلاف ذلك، سيتم تخفيض كمية ميكروفيسيلس الدماغ التي تم جمعها، التي ستنخفض إلى حد كبير إنتاج البروتين من هذا الإجراء. - ريسوسبيند بيليه في مل 5.0 من BMB المحتوية على مبطلات المانع كوكتيل (أي، ميكروليتر 1.0 حوزتي المانع كوكتيل كل مل 1.0 BMB المخزن المؤقت). دوامة بيليه لضمان خلط دقيق.
- إضافة مل 8.0 من ديكستران 26% لكل أنبوب الطرد المركزي ودوامه كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.2 من هذا البروتوكول.
- عينات من أجهزة الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- استخدام قارورة فراغ وماصة زجاجية، نضح المادة طافية وضمان عدم توقف بيليه أن تحتوي على ميكروفيسيل الدماغ.
ملاحظة: المواد الزائدة التي تمسكت بجدار الأنبوبة لا تحتوي على ميكروفيسيلس وينبغي بعناية تنظيفها وإزالتها. - كرر الخطوات من 4، 5 إلى 4.8 آخرين مرتين.
- خطوات استخدام الطرد المركزي ديكستران 4 مرة واحدة قد اكتملت، إضافة مل 5.0 من BMB كل بيليه ودوامه ريسوسبيند العينة.
ملاحظة: بعد انتهاء خطوة 4، 10، يمكن جمعها كلها ميكروفيسيلس لتحليل البروتين التعريب. يمكن أن يتحقق هذا بأخذه 50 ميكروليتر الكوة ميكروفيسيل تعليق إعادة بيليه وتلطيخ على شريحة الميكروسكوب زجاجية. ثم يتم ميكروفيسيلس الحرارة ثابتة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على كتلة تدفئة متبوعاً بالتثبيت في الإيثانول المثلج ليمكن تخزينها شرائح إضافية كحد أدنى 10 ثم في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة للتصوير الدراسات.
5-تنبيذ فائق تحضير عينات أغشية الدماغ مجموع Microvascular
- نقل العينات إلى الخالطون الزجاج المثلجة.
- باستخدام الخالطون الكهربائية علوية، مجانسة أنسجة المخ باستخدام 8-10 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية على 3000 دورة في الدقيقة. ويجري تجانس استخدام طاحونة أنسجة مل 10 قذائف هاون ومدقة. تنظيف مدقة استخدام الإيثانول 70% بعد تجانس كل عينة الفردية.
- نقل عينات لتنظيف أنابيب أولتراسينتريفوجي. عدد ووزن كل أنبوبة الفردية. التوازن وزوج الأنابيب قبل التحميل إلى الدوار أولتراسينتريفوجي.
ملاحظة: جميع وزنها والاقتران من أنابيب أولتراسينتريفوجي يجب أن تجري مع القبعات على لضمان القياس الدقيق لأنبوب الأوزان. - عينات من أجهزة الطرد المركزي في 150,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية.
- استخدام قارورة فراغ والزجاج ماصة باستور، نضح المادة طافية استخدام الحرص على عدم عرقلة بيليه الأغشية الشعرية.
- استناداً إلى حجم بيليه، إضافة وحدة تخزين مناسبة لتخزين المخزن المؤقت، التي تتألف من المياه و BMB في نسبة 1:1 (v/v). عادة، يتم حراكه الكريات في 400-500 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتخزين. إضافة كوكتيل مثبط البروتياز إلى المخزن المؤقت التخزين بنسبة 1.0 ميكروليتر كل مل 1.0 من المخزن المؤقت لتخزين.
- دوامة عينات ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لتخزين.
- استخدام زجاج ماصة باستور، نقل عينات الأغشية الشعرية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى 1.5 مل.
- تمرير نموذج عن طريق إبرة المحاقن x 5 لضمان العينة يتم خلطها بشكل تام، ووجود لا المجاميع الخلوية.
- تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى اللازمة للتحليل.
ملاحظة: يتم قياس محتوى البروتين من كل عينة غشاء ميكروفيسيل استخدام الأسلوب برادفورد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1تدفق التجريبية لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء ميكروفيسيل. استخدام الإجراء المعروضة هنا، يتجلى نجاح عزل ميكروفيسيلس سليمة من الدماغ الفئران (الشكل 2A). وتم الحصول على هذه السفن بعد الانتهاء من استخدام الطرد المركزي مع ديكستران وفورا قبل البدء تنبيذ فائق تحضير عينات الغشاء (أي، بعد إتمام الخطوة 4.10). في هذه الصورة، وهو الملون ميكروفيسيل استخدام جسم مضاد ضد Oatp1a4، الناقل التي أظهرت أن يعبر جيدا في غشاء البلازما في الدماغ خلايا بطانية ميكروفاسكولار2،،من1113، 18. استخدام تحليل لطخة غربية (الشكل 2)، الغشاء الاستعدادات من ميكروفيسيلس تحصد من إناث الفئران سبراغ داولي وعرضت أن تكون أثري في الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (بيكم-1؛ ويعرف أيضا باسم CD31)، بروتين علامة ميكروفاسكولاتوري الدماغ. بيكم-1 هو مثبطة المشارك مستقبلات المتورطين في خلية تي وب-الخلايا مما يشير إلى أن يتم التعبير عن درجة عالية في غشاء بلازما خلايا بطانية والأوعية الدموية. خلال الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول، لوحظت بيكم تخصيب اليورانيوم في عينات غشاء المعدة باستخدام الخطوات الطرد المركزي ديكستران اثنين وأربعة. كما هو مبين في الشكل 2 (ب)، لم يكن هناك فرق في التعبير بيكم بين العينات المعدة باستخدام هذه الخطوات المختلفة الطرد المركزي؛ ومع ذلك، أدت إلى أربعة ديكستران يدور في تحسين التعبير عن بروتينات النقل بطانية، مما يشير إلى تحسن ميكروفيسيل تخصيب اليورانيوم في العينات. بالإضافة إلى ذلك، استخدام أربعة ديكسترانس يدور تحسين إزالة المكونات الخلوية غير مرغوب فيها كما ورد التعبير انخفاض البروتينات علامة الخلايا العصبية مثل سينابتوفيسين18. لذلك، أجريت جميع الأعمال التحضيرية اللاحقة للأغشية ميكروفيسيل الدماغ باستخدام أربع خطوات استخدام الطرد المركزي ديكستران. في تجاربنا لطخة غربية، كعنصر تحكم تحميل tubulin البروتين المكونة ميكروتوبولي. كما يحددها مقايسة البروتين برادفورد، الاستعدادات غشاء عادة ما تسفر عن تركيزات البروتين تتراوح بين 5.0 ملغ/مل و 10.0 ملغ/مل. ويرد في الجدول 1نتائج التقدير الكمي البروتين الممثل. وتحددت هذه القيم البروتين استناداً إلى منحنى قياسية التي تم إنشاؤها باستخدام ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ 2.0 ملغ/مل) كالمعيار (الشكل 3). كانت تضعف عينات البروتين 10 إضعاف في مقايسة برادفورد.
بعد تحديد مقدار البروتين، يمكن أن تستخدم عينات الغشاء ميكروفيسيل للمنهجيات البيوكيميائية الخاصة بتحليل البروتين مثل تحليل لطخة غربية أو البقع دوت co-إيمونوبريسيبيتيشن. ويصور الشكل 4A وصمة عار غربية ممثل ل BBB النقل البروتين الجلوكوز الناقل-1 (تخمة-1) حيث تم تحليل عينات من الجدول 1 . امسح واحد الفرق في الوزن الجزيئي المناسب (أي، توقع أن تكون كاتشين 54) لهذا BBB أعرب عن شدة تم الكشف عن البروتين في كل عينة من الغشاء. كل حارة الفردية في هذا وصمة عار الغربية تمثل عينة غشاء ميكروفيسيل إعداد من الحيوانات تجريبية واحد. كان يحدد البروتين متساوية في كل حارة باستخدام الصوديوم-البوتاسيوم ATPase (أي، نا+/K+ أتباسي؛ وتوقع الوزن الجزيئي = كاتشين 113) كعنصر تحكم تحميل. كما هو موضح في الشكل 4 باء، لوحظ أعلى تعبير تخمة-1 بي بي بي في الفئران الذكور مقارنة بنظرائهم من الإناث. لا يوجد فرق في التعبير نا+لوحظ/K+ ATPase بين الحيوانات الذكور والإناث. لهذا التحليل دينسيتوميتريك، كانت quantitated العصابات باستخدام البرمجيات إيماجيج.
رقم 1: الخطوط العريضة للإجراءات والبروتوكولات لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: بيانات تمثيلية تبين ميكروفيسيل سليمة والتعبير عن البروتين علامة الخلية البطانية الوعائية. ج: تلوين الفلورة أظهر تعريب Oatp1a4، الناقل أن ثبت أن يعبر جيدا في بي بي بي، في ميكروفيسيل الدماغ سليمة معزولة كما هو موضح في هذا البروتوكول. تعريب Oatp1a4 تم الكشف عن استخدام جسم [بولكلونل] أرنب محددة ضد Oatp1a4 في إضعاف 01:10. وكان جسم الثانوي مفتش أرنب المضادة مترافق فلورسنت التي تم استخدامها في إضعاف رافعة. شريط المقياس = 7.5 ميكرومتر. باء: أظهر تحليل لطخة غربية نقاء عينات ميكروفيسيل من خلال إظهار تخصيب البروتين علامة خلية بطانية معينة بيكم-1، التي تم الكشف عنها باستخدام جسم [مونوكلونل] ماوس في إضعاف 1: 100. وكان جسم الثانوية ماوس المضادة مفتش في إضعاف مقياس. البوسنة والهرسك = هوموجيناتي الدماغ، أم = ميكروفيسيل الخام الكسر، مفم = الأغشية ميكروفيسيل الدماغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: منحنى قياسي ممثل "مقايسة البروتين برادفورد". ألبومين المصل البقري (BSA) كان يستخدم كمعيار، وكان المخفف للتركيزات التالية: 0, 0.125، 0.25، 0.50، 0.75، 1.0 و 1.5 و 2.0 ملغ/مل. وتم قياس امتصاص في = 595 نانومتر. وتمثل كل نقطة بيانات في متوسط ثلاث قراءات امتصاص كل تركيز جيش صرب البوسنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الممثل لطخة غربية عرض "الاختلافات بين الجنسين" في "التعبير" تخمة-1 في "غشاء إعداد عينات" من "ميكروفيسيلس الدماغ الفئران المعزولة". ج: تحليل لطخة غربية يظهر التعبير من تخمة-1 في عينات غشاء المعدة من ميكروفيسيل المعزولة من ذكور وإناث الفئران سبراغ داولي. 1-تخمة تم الكشف عن استخدام جسم [مونوكلونل] أرنب في إضعاف 1: 500. وكان جسم الثانوية مفتش أرنب المضادة [مونوكلونل] في إضعاف 1:40,000. نا=/K+ ATPase وعلامة غشاء البلازما، وتحميل عنصر التحكم، تم الكشف عن استخدام [بولكلونل] أرنب المضادة مفتش في تخفيف 1: 40,000. باء: دينسيتوميتريك تحليل التعبير تخمة-1 في عينات الغشاء المعزولة من ذكور وإناث الفئران سبراغ داولي. يتم التعبير عن النتائج كما يعني SEM من الحيوانات التجريبية 6 كل مجموعة العلاج. النجمة تشير إلى نقاط البيانات التي يعتد بها إحصائيا من عنصر التحكم. وكان يعتبر قيمة p < 0.05 يعتد به إحصائيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الحيوان | امتصاص متوسط | امتصاص المعدلة | التركيز المحسوب | التركيز الفعلي |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| 1 الذكور | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| 2 الذكور | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| 3 الذكور | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| 4 الذكور | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7/7S |
| 5 الذكور | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| 6 الذكور | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| 1 أنثى | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5.78 |
| 2 أنثى | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| 3 أنثى | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| 4 أنثى | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 5 أنثى | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| 6 الإناث | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7.7 |
الجدول 1: تركيزات البروتين الممثل من الدماغ ميكروفيسيل الاستعدادات المستمدة من الفئران الذكور والإناث سبراغ داولي-- تتحدد قيم امتصاص المعدلة طرح امتصاص الخلفية في l = 595 نانومتر من امتصاص متوسط القيم لكل الحيوانات التجريبية. في هذا التحليل، امتصاص خلفية مصممة لتكون 0.4108.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، هو وصف طريقة بسيطة وفعالة لإعداد عينات البروتين غشاء من ميكروفيسيلس طازجة المعزولة من أنسجة المخ الفئران. وأبلغ عدة نهج لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران و/أو جيل من الاستعدادات غشاء من ميكروفاسكولاتوري معزولة في الأدب13،20،،من2122 , 24-على الرغم من أن البروتوكول العزلة ميكروفيسيل الموصوفة أعلاه مشابهة من حيث المبدأ، تم تحسين هذا النهج لتمكين إعداد عينات الغشاء مع الغلة البروتين ممتاز من الحيوانات تجريبية واحد. وألغت هذه السلفة الحاجة إلى تجمع ميكروفيسيلس من ثلاثة على الأقل من الفئران سبراغ داولي بغية الحصول على عينات بتخصيب البروتين مرضية للاستخدام في مختلف النهج لتحليل البروتين. تشمل هذه النهج، ولكن لا تقتصر على، تحليل لطخة غربية والبقع دوت co-إيمونوبريسيبيتيشن. تجدر الإشارة إلى أن الممارسة المتمثلة في تجميع ميكروفيسيلس من الحيوانات التجريبية متعددة لإنشاء عينة واحدة إلى حد كبير يقلل من التباين بين المجموعات. إلى هذا الحد، يمكن أن ينتج ميكروفيسيل تجميع البيانات مع انتشار انخفاض يمثل التغير الحقيقي في التعبير البروتين التي لوحظت في عدد أن حيوانات التجريبية. حيث يمكن إعداد عينات من الحيوانات التجريبية واحد، التغير الحقيقي للسكان دراسة يتم التقاطها، مما يسمح للبيانات التجريبية يمكن الحصول عليها تكون أكثر تمثيلاً للعملية الفيزيولوجية المرضية أو الدوائي تحت الفحص. فائدة إضافية أنه يمكن إعداد عينات الغشاء ميكروفيسيل باستخدام عدد أقل من الحيوانات التجريبية.
ولعل النظر الأكثر أهمية في تنفيذ هذا البروتوكول يتضمن الخطوات الطرد المركزي. في الواقع، يمكن أن تختلف أجهزة الطرد المركزي بين المختبرات سبب بهم العمر، والشركة المصنعة، و/أو عموما الشرط وسلامتها. وهذا يمكن أن يؤدي إلى اختلافات كبيرة في مستوى الفعلية ز (أو مستوى لفة في الدقيقة) من زيادة ونقصان إلى زيادة ونقصان. يمكن التقليل من دور هذا الاختلاف في سلامة العينة بالطرد المركزي لجميع العينات في تحليل مقارن واحد معا في الدوار نفسه في نفس الوقت. على سبيل المثال، إذا كان دوار فقط اثنا عشر فتحات متاحة لأنابيب العينة، ثم عزلة وإعداد عينات ميكروفيسيل في تجربة فردية ستقتصر على اثني عشر. ويضمن هذا الاعتبار أن إعداد عينات ذات جودة قابلة للمقارنة، وأن أي تغير في البروتين يعني التعبير بين المجموعات التجريبية يمكن أن تسند إلى شرط المعاملة نفسها.
وهناك اعتبار آخر ينطوي على إعداد الحل ديكستران 26%، التي تلزم لفصل ميكروفيسيلس المخ وأنسجة المخ متني عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. ديكستران هو بوليمر جلوكوز مع انتشار α-1، 6-ترتبط الوحدات وعادة ما تمتلك من هيكل خطي25. كما أن لديها قدرة على ربط ارتفاع المياه. على سبيل المثال، يحتفظ ز 1 من ديكستران 75 (أي، ديكستران مع وزن الجزيئي يعني دا 75,000 كما يستخدم في هذا البروتوكول) حوالي 20-25 مل من الماء. يمكن أن تؤدي هذه الخاصية من ديكستران إلى تحديات عميقة في إذابة المسحوق في المخزن المؤقت مائي. يمكن تحسين قابلية الذوبان مائي بتدفئة الحل ديكستران إلى أقصى درجة حرارة 40 درجة مئوية. عند التسخين، يتفاعل البوليمر أقل مع جزيئات الماء، مما يسبب ديكستران أن تعتمد تكيف أقل موسعة (أي أقل درجة من الاحتفاظ بالماء) في الحل. التدفئة إلى ارتفاع درجات الحرارة سيؤدي البوليمر ديكستران لكسر، وذلك، سوف يكون من غير فعالة ككاشف فصل. بالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري أن تعدل الرقم الهيدروجيني للحل ديكستران إلى 7.4 فورا قبل الاستخدام. يمكنك تجربة حلول 26% ديكستران تحولات كبيرة درجة الحموضة، حتى أكثر من 1-2 ساعة بعد إعداد. نظراً لهذه الاعتبارات، يجب أن تكون مستعدة الحل ديكستران 26% في اليوم من التجربة ولكن بوقت كاف قبل عزلة أنسجة المخ للسماح لحل وتسوية مناسبة للأس الهيدروجيني.
حد من هذا البروتوكول ينطوي على وجود أنواع أخرى من خلية لوحدة نيوروفاسكولار (NVU) في الاستعدادات ميكروفيسيل. بالإضافة إلى خلايا بطانية، NVU يتألف من المكونات الخلوية المختلفة بما في ذلك الخلايا الدبقية (أي، أستروسيتيس، ميكروجليا)، بيريسيتيس، والخلايا العصبية 3،،من2627. عزل ميكروفيسيلس من الدماغ القوارض عادة ما يظهر تخصيب اليورانيوم مع خلايا بطانية والأوعية الدموية؛ ومع ذلك، التعبير عن البروتينات علامة الخلايا العصبية وكذلك التعبير عن الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني)، علامة astrocyte المتبعة، يلاحظ أيضا. بالإضافة إلى ذلك، بيريسيتيس موجودة في نموذج الأعمال التحضيرية نظراً لارتباطها الحميم بالبطانة الوعائية. وفي الوقت الحاضر، من المستحيل تقريبا لعزل ميكروفيسيلس الدماغ من الحيوانات التجريبية والقضاء على جميع بيريسيتيس والخلايا العصبية، وأستروسيتيس. ومع ذلك، قد تم متقدمة هذا البروتوكول عبر خطوات استخدام الطرد المركزي متعددة حيث أن يتم إثراء العينات في خلايا بطانية (أي، كما أشارت إلى تحسن التعبير عن بيكام-1 بعد كل خطوة الطرد المركزي) مع وجود محدود (أنواع الخلايا الأخرى أي، كما هو مبين بخفض التعبير من البروتين سينابتوفيسين-1 علامة العصبية بعد كل خطوة الطرد المركزي).
وعموما، يمكن تكييفها هذا النهج لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء في أي مختبر مع اهتمام بدراسة البروتينات BBB ضمن الشروط الفيزيولوجية المرضية أو الدوائي. على سبيل المثال، يوفر هذا البروتوكول ميكروفيسيل العينات التي يمكن الاستفادة منها لدراسة البروتينات نقل المخدرات التي يتم التعبير عن اندوجينوسلي في ال بي بي بي2،18. متانة هذا النهج مكن مراقبة التغيرات المنفصلة في Oatp1a4 في الاستجابة للمحفزات الدوائية، البيانات التجريبية التي أبلغته بتصميم دراسات دقيقة لتقييم دالة الناقل والتنظيم في بي بي بي. البروتوكول الموصوفة أعلاه يمكن تطبيقه أيضا على تحليل البروتين من مفرق ضيق البروتينات والبروتينات مفرق أدهيرينس في محاولة لفهم BBB الظروف الفسيولوجية ودراسة التغييرات في سلامة BBB ردا على الفيزيولوجية المرضية وعوامل الإجهاد الدوائي. ومن الواضح أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها لتطبيقات متعددة في مجال بي بي بي، وذلك، يمثل طريقة بسيطة لكنها قوية واستنساخه التي يمكن إدراجها في BBB الدراسات التي تتطلب تحليل البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01-NS084941) ولجنة البحوث الطبية الحيوية أريزونا (ADHS16-162406) إلى PTR. وقد تلقت وا في الماضي دعم من تعيينا قبل دكتوراه على "المعاهد الوطنية لمنحه التدريب الصحي" (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
