Summary
Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.
Abstract
A barreira hemato - encefálica (BBB) é um tecido dinâmico barreira que responde a vários estímulos fisiopatológicos e farmacológicos. Tais alterações resultantes destes estímulos podem grandemente modulam a entrega da droga para o cérebro e, por extensão, causam consideráveis desafios no tratamento do sistema nervoso central (CNS) doenças. Muitas mudanças BBB que afetam a farmacoterapia, envolvem as proteínas que são localizadas e expresso a nível das células endoteliais. Com efeito, tal conhecimento sobre fisiologia do BBB na saúde e na doença gerou considerável interesse no estudo destas proteínas de membrana. Do ponto de vista de pesquisa de ciência básica, isto implica uma exigência para um método simples mas robusto e reprodutível para isolamento de microvessels de tecido cerebral, colhido em animais experimentais. Para preparar amostras de membrana de microvessels recentemente isolada, é essencial que os preparativos da amostra ser enriquecidos em células endoteliais mas limitados na presença de outros tipos de células da unidade neurovascular (i.e., astrócitos, micróglia, neurônios, pericitos). Um benefício adicional é a capacidade para preparar amostras de animais individuais, a fim de capturar a verdadeira variabilidade da expressão da proteína em uma população experimental. Neste manuscrito, detalhes a respeito de um método que é utilizado para isolamento de microvessels de cérebro de rato e preparação de amostras de membrana são fornecidos. Enriquecimento de Microvessel, de amostras derivadas, é conseguido usando quatro etapas de centrifugação onde dextrano é incluído no buffer de amostra. Este protocolo pode facilmente ser adaptado por outros laboratórios para suas próprias aplicações específicas. Amostras geradas a partir deste protocolo foram mostradas para produzir robustos dados experimentais de experimentos de análise de proteína que podem ajudar muito a compreensão das respostas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos.
Introduction
A barreira hemato - encefálica (BBB) existe na interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação sistêmica e desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase do cérebro. Especificamente, as funções BBB para precisamente controle soluto concentrações no fluido extracelular de cérebro e eficientemente fornecer os nutrientes necessários para atender as demandas metabólicas consideráveis do CNS1pelo tecido cerebral. Essas funções implicam que o BBB, que existe principalmente no nível da célula endotelial microvascular, deve possuir mecanismos discretos que permitem que algumas substâncias acessar o parênquima cerebral, garantindo simultaneamente que xenobióticos potencialmente prejudiciais não pode se acumulam. Com efeito, as células endoteliais microvascular do cérebro não são fenestradas e exibem pinocitose limitado, que garante uma falta de permeabilidade não-seletivo2. Além disso, as células endoteliais do cérebro microvessel expressam apertado junção aderente junção proteínas e que agem para formar um físico "selar" entre células endoteliais adjacentes e restringir consideravelmente paracellular difusão de substâncias pelo sangue para o cérebro parênquima. Com efeito, permeabilidade seletiva de substâncias endógenas e exógenas requer expressão funcional de captação e efluxo de transportadores3. Globalmente, apertados cruzamentos, entroncamentos adherens e transportadores trabalham em conjunto para manter as propriedades de barreira exclusivo do BBB.
O BBB é uma barreira dinâmica que responde a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos. Por exemplo, estresse de hipóxia/reoxigenação foi mostrado para modular a expressão de proteínas críticas junção apertada (i.e., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que está associado com aumento paracellular permeabilidade para marcadores vasculares tais como sacarose4,5,6. Observações semelhantes foram feitas no BBB no cenário do de lesão cerebral traumática7 e dor inflamatória periférica8,9. Essas mesmas doenças também podem modular os mecanismos de transporte para o BBB10,11,12,13,14. De fato, lesão hipóxia/reoxigenação aumenta a expressão funcional de ânion orgânico transportando polipeptídeo 1a4 (Oatp1a4) no BBB, que pode levar a aumentos significativos no transporte de sangue-cérebro de substratos de transporte Oatp específicos tais como taurocholate e atorvastatina13. Propriedades BBB também podem ser alteradas por farmacoterapia em si, um mecanismo que pode servir de base para as duas mudanças profundas na eficácia da droga no cérebro e para interações medicamentosas. Por exemplo, paracetamol alvos receptor nuclear mecanismos de sinalização nas células endoteliais microvascular cerebral, aumenta a expressão funcional do transportador efluxo crítico P-glicoproteína (P-gp) e modifica a analgesia dependente do tempo conferidos pela morfina, uma droga analgésica opioide e P-gp estabelecida transportam substrato15. Uma compreensão completa das alterações BBB, que pode ser induzida por doenças ou drogas, também requer a identificação e caracterização de mecanismos regulamentares específicos que controlam estas modificações. Com efeito, as vias de sinalização discretas foram identificadas nas células endoteliais microvascular do cérebro que controlam a expressão molecular de junção apertada proteínas16,17 e transportadores15, 18,19. Tomados em conjunto, estas observações indicam que vias moleculares complexas estão envolvidas na regulação de junções apertadas de BBB e transportadores na saúde e na doença.
Um desafio significativo no estudo do BBB é a exigência absoluta de um método simples e eficaz para isolamento de microvessels de derivados de animais experimentais e posterior preparação de amostras de membrana de tecido cerebral. Estas amostras devem estar preparadas para que eles são ambos enriquecidos em células endoteliais microvascular do cérebro e limitados na presença de outros tipos de células. Ao longo dos últimos anos, várias metodologias para isolamento da microvasculatura do cérebro de roedor têm sido relatadas na literatura científica13,20,21,22. Este artigo descreve um simples, robusto e o método reprodutível para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para preparação das amostras endoteliais de membrana-enriquecido que pode ser usado para a análise da expressão da proteína. Uma vantagem deste protocolo de isolamento de microvessel é a capacidade de obter preparações de amostras de alta qualidade e com rendimento de proteína suficiente de um animal experimental individual. Isto permite a consideração de animal para animal variabilidade na expressão da proteína. Tal adiantamento neste protocolo melhorou extremamente a robustez dos estudos do BBB porque sobreavaliação (ou Under estimativa) a verdadeira amplitude das alterações de proteína no BBB agora pode ser evitada. Além disso, a inclusão de várias etapas de centrifugação com dextran permite melhor enriquecimento de microvessels em amostras experimentais facilitando a remoção dos constituintes celulares indesejados como os neurônios.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) e estar de acordo com o National Institutes of Health (NIH) e pesquisa Animal: Reporting In Vivo experimentos (chegada) orientações. O fluxo processual para o protocolo é descrito na Figura 1.
1. set-up para o procedimento
- Prepare o buffer de microvessel do cérebro (BMB). Comece por pesagem 54,66 g D-manitol, 1,90 g EGTA e base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (ou seja, Tris) 1,46 g para um copo limpo. Adicione 1,0 L de água desionizada. Misture os componentes da reserva BMB utilizando um agitador magnético. Uma vez que a solução tem sido muito bem misturada, ajuste o pH para 7,4 usando 1,0 M de HCl.
- Prepare a solução de dextran (75.000 MW) de 26% (p/v) antes de anestesiar animais. Prepare a solução de dextran conforme descrito nas etapas a seguir.
Nota: É criticamente importante preparar esta solução antes do tempo porque dextrano pode levar cerca de 1,5 a 2 h para dissolver em tampão aquosa.- Pese o dextran em pó (26 g por 100 mL de tampão) em um copo limpo.
- Meça o volume apropriado de BMB e diluir em um copo separado, limpo.
- Lentamente despeje o copo contendo o pó dextrano BMB. Misture manualmente o dextran em pó durante o derramamento de BMB usando uma vareta de vidro celeuma.
- Ajuste o pH para 7,4 com 1,0 HCl M imediatamente antes de usar.
Nota: Um isolamento típico do cérebro microvessels de 12 ratos de Sprague-Dawley individuais (masculino ou feminino; 3 meses de idade; 200-250 g cada) requer 200 mL da solução de dextran (i.e., dextrano 52 g em 200 mL de BMB).
2. extração de tecido cerebral de ratos Sprague Dawley
- Desejado no tratamento experimental, anestesiamos ratos Sprague-Dawley usando cetamina (50mg/kg; i.p. 2,5 mL/kg) e xilazina (10mg/mL; 2,5 mL/kg eu, p.). Dilua a ketamina e xilazina em soro fisiológico a 0,9% para concentrações finais de 20 mg/mL e 4,0 mg/mL, respectivamente. Eutanásia em animais por decapitação usando uma guilhotina afiada em conformidade com as diretrizes IACUC. Use o mesmo procedimento para masculinos e femininos ratos Sprague-Dawley.
- Ressecar a pele do crânio do rato, fazendo um único corte transversal com uma tesoura cirúrgica.
- Usando ruginas, Retire cuidadosamente a placa de crânio e expor o cérebro.
- Remova o cérebro com uma espátula. Desanexe o encéfalo e coloque o tecido cerebral isolada em um tubo cónico de 50 mL contendo 5 mL de BMB. Adicione 1,0 μL de cocktail por 1,0 mL de tampão BMB imediatamente antes da utilização do inibidor da protease.
3. cérebro processamento
- Transferi o tecido cerebral do tubo cónico de 50 mL para um tubo de ensaio limpo.
- Usando fórceps, Rode suavemente o cérebro 12,5 cm de diâmetro, papel de filtro para remover o exteriores meninges, que são vagamente aderiu ao córtex cerebral. Delicadamente pressione o tecido cerebral contra o papel de filtro e rolar o tecido novo. Vire o papel de filtro com frequência durante esta etapa.
- Separe os hemisférios cerebrais usando fórceps do plexo coroide.
Nota: O plexo coroide aparece como um tecido claro membranoso localizado na superfície dos ventrículos cerebrais. - Delicadamente, achatar o tecido cerebral e remover restantes meninges e bulbos olfatórios usando fórceps.
- Coloque o tecido cortical cerebral em um almofariz de vidro refrigerados. Adicione 5,0 mL de cocktail contendo inibidor da protease BMB a argamassa.
- Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 15 subindo e descendo traçados a 3.700 rpm. Realize a homogeneização usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Entre a homogeneização de cada amostra individual, limpe o pilão usando etanol a 70%.
Nota: Homogeneização traços devem ser consistentes em termos de ritmo e magnitude. - Despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulada.
4. centrifugação passos
- Adicione 8,0 mL da solução de dextran de 26% para cada tubo de centrifugação rotulado que contém o cérebro homogeneizado.
- Inverter o tubo duas vezes e então cuidadosamente a amostra de vórtice. Realizar a utilização do Vortex de cada amostra usando vários ângulos para assegurar uma mistura completa da solução de homogeneizado de cérebro com solução de dextran de 26%.
- Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
Nota: Para algumas análises, é útil comparar o cérebro microvessels com parênquima cerebral. Deve ser a avaliação da expressão da proteína em células de parênquima cerebral necessária, o sobrenadante desta etapa de centrifugação (ou seja, cérebro parenquimatosa fração) pode ser recolhido e armazenado a-80 ° C para uso futuro. - Remover o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e pipetas de vidro.
Nota: O cuidado deve ser tomado para não perturbar a pelota. Caso contrário, a quantidade do cérebro microvessels coletados será reduzida, que diminuirá significativamente o rendimento de proteína deste procedimento. - Resuspenda o pellet em 5,0 mL de BMB contendo inibidor da protease cocktail (ou seja, 1,0 μL inibidor da protease cocktail por 1,0 mL de tampão BMB). A pelota para assegurar uma mistura completa de vórtice.
- Adicione 8,0 mL de dextrano de 26% para cada tubo de centrifugação e vórtice, conforme descrito nas etapas 4.1-4.2 do presente protocolo.
- Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Usando um balão de vácuo e pipeta de vidro, aspirar o sobrenadante e garantir aquela pelota contendo microvessel do cérebro não é interrompida.
Nota: Excesso material que está aderido à parede do tubo não contém microvessels e deve ser cuidadosamente limpos e removido. - Repita as etapas 4.5 a 4.8 um adicional duas vezes.
- Uma vez 4 dextrano centrifugação as etapas foram concluídas, adicionar 5,0 mL de BMB cada pellet e vórtice para Ressuspender a amostra.
Nota: Após a conclusão da etapa 4.10, toda microvessels podem ser coletados para a análise da localização da proteína. Isso pode ser feito tomando um 50 μL alíquota de pelota microvessel re-suspensas e manchas em um vidro de microscópio. Microvessels são, então, calor-corrigido a 95 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento seguido de fixação em etanol gelado para um adicional de 10 min. de Slides podem ser armazenados a 4 ° C até necessária para estudos de imagem.
5. ultracentrifugação para preparar amostras de cérebro Total Microvascular membranas
- Transferi as amostras para o homogeneizador copo gelado...
- Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 8-10 e descer traçados a 3.000 rpm. Homogeneização é realizada usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Limpe o pilão usando etanol a 70% após a homogeneização de cada amostra individual.
- Transferi as amostras para limpar os tubos se. Número e pesar cada tubo individual. Equilíbrio e emparelhar os tubos previamente ao seu embarque para o rotor se.
Nota: Todos os pesando emparelhamento dos tubos se devem proceder e com as tampas para garantir uma medição precisa de pesos de tubo. - Centrifugar as amostras a 150.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Usando um balão de vácuo e vidro pipeta Pasteur, aspirar o sobrenadante usando o cuidado para não perturbar a pelota de membrana capilar.
- Baseado no tamanho da pelota, adicione um volume adequado de buffer de armazenamento, que é composta de água desionizada e BMB na proporção de 1:1 (v/v). Normalmente, as pelotas são resuspended em 400-500 μL de tampão de armazenamento. Adicione o cocktail de inibidor de protease para o buffer de armazenamento na proporção de 1,0 μL por 1,0 mL de buffer de armazenamento.
- Amostras de vórtice para resuspenda o pellet em buffer de armazenamento.
- Usando um pipeta Pasteur de vidro, transferi amostras de membrana capilar para um tubo de microcentrifugadora rotulado de 1,5 mL.
- Amostra de passagem através de uma agulha seringa 5 x para garantir que a amostra fique bem misturada e que não agregados celulares existem.
- Armazenar as amostras a-80 ° C até necessária para análise.
Nota: O conteúdo de proteína de cada amostra de membrana microvessel é medido usando o método de Bradford.
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Representative Results
O fluxo experimental para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana de microvessel é mostrado na Figura 1. Usando o procedimento aqui apresentado, é demonstrado sucesso isolamento de microvessels intacto de cérebro de rato (Figura 2A). Estes navios foram obtidos após a conclusão de centrifugação com dextran e imediatamente antes de iniciar a ultracentrifugação para preparar amostras de membrana (i.e., seguinte conclusão da etapa 4.10). Nesta imagem, o microvessel está manchada usando um anticorpo contra Oatp1a4, um transportador que foi mostrado para ser bem expressa na membrana plasmática de cérebro células endoteliais microvascular2,11,13, 18. Usando a análise ocidental do borrão (Figura 2B), membrana de preparações de microvessels de ratas Sprague-Dawley colhidas foram mostradas ser enriquecido em plaquetas células endoteliais adesão molécula-1 (PECAM-1, também conhecida como CD31), uma proteína de marcador para microvasculatura do cérebro. PECAM-1 é um inibitório receptor co envolvido em células T e células B sinalização que é altamente expressa na membrana plasmática das células endoteliais vasculares. Durante a otimização do presente protocolo, enriquecimento PECAM foi observado em amostras de membrana preparadas com dois e quatro etapas de centrifugação de dextrano. Como mostrado na Figura 2B, não houve diferença na expressão PECAM entre amostras preparadas usando estas etapas de centrifugação diferentes; no entanto, quatro rodadas de dextrano resultaram em melhor expressão de proteínas de transporte endotelial, que indica a melhoria microvessel enriquecimento nas amostras. Além disso, o uso de quatro dextranos gira melhorada remoção de constituintes celulares indesejados como indicado pela expressão reduzida de proteínas marcador neuronal como Sinaptofisina18. Portanto, todas as preparações subsequentes para membranas de microvessel do cérebro foram realizadas usando quatro etapas de centrifugação de dextrano. Em nossos experimentos borrão ocidental, a tubulina de constituintes da proteína microtubule foi usada como um controle de carregamento. Conforme determinado pelo ensaio da proteína de Bradford, preparações de membrana normalmente produzem concentrações de proteína variando entre 5,0 mg/mL e 10,0 mg/mL. Resultados de quantificação de proteína representativos são descritos na tabela 1. Esses valores de proteína foram determinadas com base em uma curva padrão que foi gerada usando a albumina de soro bovino (BSA; 2,0 mg/mL) como o padrão (Figura 3). Amostras da proteína foram diluídas 10-fold no ensaio de Bradford.
Após quantificação da proteína, microvessel amostras de membrana podem ser utilizadas para bioquímicas metodologias para análise de proteínas, tais como análise ocidental do borrão, ponto borrões ou co-imunoprecipitação. Figura 4A retrata um representante western blot para o BBB transporte proteína glicose transporte-1 (Glut-1) onde analisaram-se amostras da tabela 1 . Limpar bandas única, com o peso molecular adequado (ou seja, previsto para ser 54 kDa) para este BBB altamente expressa proteína foram detectados em cada amostra de membrana. Cada raia individual neste borrão ocidental representa microvessel amostra de membrana preparada a partir de um único animal experimental. Proteína igual em cada raia foi determinada utilizando de sódio-potássio ATPase (i.e., at+/k+ ATPase; previsto peso molecular = 113 kDa) como um controle de carregamento. Como mostrado na Figura 4B, maior expressão de Glut-1 no BBB foi observado em ratos machos em comparação com os seus homólogos do sexo feminino. Não na expressão do at+/k+ ATPase foi observada diferença entre animais masculinos e femininos. Para esta análise densitométricos, bandas foram quantificadas utilizando software ImageJ.
Figura 1: esquema de procedimentos e protocolos para isolar microvessels de cérebro de rato e para preparar amostras de membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dados representativos mostrando microvessel intacto e expressão de uma proteína do marcador de célula endotelial vascular. R: Mancha da imunofluorescência mostrou a localização de Oatp1a4, um transportador que foi mostrado para ser bem expressa no BBB, em um microvessel de cérebro intacto isolado conforme descrito neste protocolo. Localização de Oatp1a4 foi detectada usando um anticorpo policlonal específico coelho contra a Oatp1a4 a uma diluição de 01:10. O anticorpo secundário era um Conjugado IgG de antifluorescente coelho que utilizou-se a uma diluição de 1: 300. Barra de escala = 7,5 μm. B: Borrão ocidental análise demonstrou a pureza das amostras de microvessel, mostrando o enriquecimento da proteína do marcador de célula endotelial específica PECAM-1, que foi detectado usando um anticorpo monoclonal de rato a uma diluição de 1: 100. O anticorpo secundário era um anti-mouse IgG em uma diluição de 1:50,000. BH = cérebro homogeneizado, MV = fração microvessel bruto, MVM = membranas de microvessel do cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: uma curva padrão representativa para o ensaio da proteína de Bradford. Albumina de soro bovino (BSA) foi usada como um padrão e foi diluída para as seguintes concentrações: 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 e 2,0 mg/mL. Absorbância foi medida em = 595 nm. Cada ponto de dados representa uma média de três leituras de absorvância por concentração de BSA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representação ocidental do borrão mostrando sexo diferenças na expressão de Glut-1 na membrana as amostras preparadas de Microvessels de cérebro de rato isolado. R: análise ocidental do borrão mostra a expressão de Glut-1 na membrana amostras preparadas a partir de microvessel isolada de ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas. GLUT-1 foi detectado usando um anticorpo monoclonal de coelho numa diluição de 1: 500. O anticorpo secundário era um anticorpo monoclonal IgG de antia coelho uma diluição de 1:40,000. At=/k+ ATPase, um marcador de membrana plasmática e o controle de carregamento, foi detectada usando um policlonal IgG de antiem coelho uma diluições de 1: 40.000. B: Densitométricos análise da expressão de Glut-1 na membrana amostras isoladas de ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas. Os resultados são expressos como dizer SEM de 6 animais experimentais por grupo de tratamento. Asteriscos indicam os pontos de dados que são estatisticamente significativos de controle. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Animal | Absorvância média | Absorvância ajustada | Concentração calculada | Concentração real |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Masculino 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0,768 | 7,68 |
| 2 masculino | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| 3 masculino | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| 4 masculino | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7.72 |
| 5 masculino | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| 6 masculino | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| 1 feminino | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5.78 |
| 2 feminino | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| Feminino 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| 4 feminino | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 5 feminino | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7,77 |
| 6 feminino | 0.7975 | 0.3867 | 0,77 | 7.7 |
Tabela 1: concentrações de representante da proteína do cérebro Microvessel preparações derivado de ratos machos e fêmeas Sprague-Dawley. Valores de absorvância ajustada são determinadas subtraindo absorvência de fundo em l = 595 nm de absorvância média valores para cada animal experimental. Neste ensaio, absorvência de fundo estava determinada a ser 0.4108.
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Discussion
Neste artigo, é descrito um método simples e eficaz de preparação de amostras de proteínas de membrana de microvessels recentemente isolada do tecido de cérebro de rato. Várias abordagens para isolamento de microvessels de cérebro de rato e/ou geração de preparações de membrana da microvasculatura isolada têm sido relatadas na literatura13,20,21,22 , 24. embora o protocolo de isolamento microvessel descrito acima é semelhante, em princípio, essa abordagem foi otimizada para permitir a preparação das amostras de membrana com proteína excelente rendimento de um único animal experimental. Este avanço eliminou a necessidade para piscina microvessels pelo menos três ratos Sprague-Dawley, a fim de obter amostras com enriquecimento de proteína satisfatória para uso em diversas abordagens para análise de proteínas. Essas abordagens incluem, mas não estão limitadas a, análise ocidental do borrão, borrões de ponto e co-imunoprecipitação. Note-se que a prática do pool de microvessels de vários animais experimentais para gerar uma única amostra grandemente reduz a variabilidade inter-grupal. Nesta medida, microvessel pool pode resultar em dados com a propagação reduzida que não representa verdadeira variabilidade na expressão da proteína observada em uma população de animais experimentais. Desde que as amostras podem ser preparadas de animais experimentais único, a verdadeira variabilidade de uma população de estudo é capturada, que permite dados experimentais obtidos ou seja a mais representativa do processo fisiopatológico ou farmacológico em exame. Um benefício adicional é que os microvessel amostras de membrana podem ser preparadas usando um número reduzido de animais experimentais.
Talvez a consideração mais crítica na execução do presente protocolo envolve as etapas de centrifugação. Com efeito, centrífugas podem diferir entre laboratórios devido à sua idade, fabricante, e/ou total condição e integridade. Isso pode levar a variações significativas no nível real g (ou nível de rpm) de rotação para girar. O papel desta variação na integridade da amostra pode ser minimizado por centrifugação das amostras em uma única análise comparativa juntos no rotor mesmo ao mesmo tempo. Por exemplo, se um rotor tem apenas 12 vagas disponíveis para os tubos de amostra, então o isolamento e a preparação de amostras de microvessel em uma experiência individual será limitados a doze. Esta consideração garante que as amostras preparadas são de qualidade comparável, e que qualquer variabilidade na expressão da proteína média entre grupos experimentais pode ser atribuída à condição de tratamento em si.
Uma consideração adicional envolve a preparação da solução de dextran de 26%, que é necessária para a separação de microvessels do cérebro e tecidos parenquimatosos cerebrais através de centrifugação diferencial. Dextrano é um polímero de glicose com uma prevalência de α-1,6-unidades e normalmente possui uma estrutura linear de25. Também tem uma ligação de água de alta capacidade. Por exemplo, 1 g de dextran 75 (i.e., dextran com um peso molecular médio de 75.000 Da como é usado no presente protocolo) mantém cerca de 20-25 mL de água. Esta propriedade de dextrano pode levar a profundos desafios na dissolução do pó para o buffer aquoso. Solubilidade na água pode ser melhorada pelo aquecimento da solução de dextran para uma temperatura máxima de 40 ° C. Após o aquecimento, o polímero interage menos com as moléculas de água, causando dextran adotar uma conformação menos expandida (isto é, menor grau de retenção de água) em solução. Aquecimento a temperaturas mais altas fará com que o polímero dextran quebrar e, consequentemente, será ineficaz como um reagente de separação. Além disso, é essencial que o pH da solução de dextran ser ajustado para 7,4 imediatamente antes do uso. Soluções de 26% de dextran podem experimentar mudanças significativa do pH, nem mais 1-2 horas após a preparação. Devido a estas considerações, a solução de dextran 26% deve ser preparada no dia do experimento, mas com tempo suficiente antes do isolamento do tecido cerebral para permitir a dissolução e ajustamento adequado do pH.
Uma limitação do presente protocolo envolve a presença de outros tipos de células da unidade neurovascular (NVU) em preparações de microvessel. Além de células endoteliais, o NVU é composto de vários componentes celulares, incluindo neurônios 3,26,27, pericitos e células gliais (i.e., astrócitos, micróglia). Isolamento de microvessels do cérebro de roedor tipicamente mostra enriquecimento com pilhas endothelial vasculares; no entanto, a expressão de proteínas marcador neuronal, bem como a expressão da glial fibrilar ácida proteína (GFAP), um marcador de astrocyte estabelecida, também é observada. Além disso, pericitos estão presentes nas preparações de amostra devido a sua íntima associação com o endotélio vascular. Actualmente, é praticamente impossível isolar microvessels de cérebro de animais experimentais e eliminar todos os pericitos, neurônios e astrócitos. No entanto, este protocolo tem sido avançado através de várias etapas de centrifugação para que as amostras são enriquecidas em células endoteliais (i.e., como indicado pela expressão melhorada de PECAM-1 seguindo cada passo de centrifugação) com a presença limitada de outros (tipos de célula ou seja, conforme indicado pela reduzida expressão do marcador neuronal proteína Sinaptofisina-1 seguindo cada passo de centrifugação).
Em geral, esta abordagem para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana pode ser adaptada em qualquer laboratório com um interesse em estudar proteínas BBB sob condições fisiopatológicas ou farmacológicas. Por exemplo, este protocolo fornece exemplos de microvessel que podem ser utilizados para o estudo de proteínas de transporte de drogas que são expressos, endogenamente, no BBB2,18. A robustez desta abordagem permitiu a observação de alterações discretas na Oatp1a4 em resposta a estímulos farmacológicos, dados experimentais que informaram a concepção de estudos rigorosos para avaliar a função de transporte e Regulamento no BBB. O protocolo descrito acima também pode ser aplicado a análises de proteína da junção apertada proteínas e proteínas de junção aderente em um esforço para entender o BBB sob condições fisiológicas e estudar mudanças na integridade BBB em resposta a fisiopatológicos e estresse farmacológico. Claramente, este protocolo pode ser adaptado para várias aplicações no campo BBB e, portanto, representa um método simples, mas robusto e reprodutível que pode ser incorporado em estudos BBB que exigem análise de proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (R01-NS084941) e a Comissão de investigação biomédica do Arizona (ADHS16-162406) de PTR. WA recebeu passado o apoio de uma nomeação de doutorandos para um institutos nacionais de saúde formação Grant (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
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