Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57698
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

Abstract

מחסום הדם - מוח (BBB) היא רקמה מכשול דינמי המגיבה לגירויים שונים הקשורים pathophysiological ולא תרופתי. שינויים כאלה הנובעות גירוי יכול במידה רבה לווסת את משלוח סמים למוח ולגרום, לפי סיומת, אתגרים ניכרים בטיפול של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות. שינויים BBB רבים המשפיעים על pharmacotherapy, לערב חלבונים לשפות אחרות, בא לידי ביטוי ברמה של תאי אנדותל. אכן, ידיעה על BBB הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה עוררה עניין רב במחקר של חלבונים אלה ממברנה. מבחינת מחקר מדע בסיסי, זה מרמז על דרישה עבור שיטה פשוטה אך חזקים לשחזור עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח שנקטפו חיות ניסוי. לשם הכנת ממברנה דגימות microvessels טרי מבודד, זה חיוני כי ההכנות המדגם להיות מועשר בתאי האנדותל אבל מוגבלת בנוכחות סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (קרי, האסטרוציטים מיקרוגלייה, הנוירונים, pericytes). יתרון נוסף הוא היכולת להכין דגימות מבעלי חיים בודדים על מנת ללכוד את ההשתנות נכון של חלבונים ביטוי אוכלוסיה ניסיוני. כתב יד זה, ניתנים פרטים בנוגע שיטה כי הוא מנוצל עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels והכנת דוגמאות ממברנה. Microvessel העשרה, מדגימות נגזר, מושגת באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה איפה לתוספי נכלל במאגר של הדגימה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות על ידי מעבדות אחרות עבור יישומים ספציפיים משלהם. דוגמאות שנוצר מתוך פרוטוקול זה הוכחו תשואות נתונים ניסיוני של ניסויים ניתוח חלבון זה יכול לסייע מאוד את ההבנה של BBB תגובות לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי.

Introduction

מחסום הדם - מוח (BBB) קיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) את מחזור מערכתי ואת ממלא תפקיד חיוני שמירה על הומאוסטזיס המוח. באופן ספציפי, BBB הפונקציות בדיוק שליטה ממס ריכוזי נוזל חוץ-תאי המוח, לספק ביעילות המזינים הללו הנדרשים על ידי רקמת המוח כדי למלא את דרישות המטבולית ניכר של ה-CNS1. תפקידים אלה לרמוז כי BBB, אשר קיים בעיקר ברמה של תא אנדותל microvascular, צריך להחזיק דיסקרטית מנגנונים המאפשרים כמה חומרים לגשת parenchyma המוח תוך הבטחת ואינטראקציות מזיקים לא יכול לצבור. אכן, תאי אנדותל microvascular המוח אינם fenestrated, התערוכה פינוציטוזה מוגבלת, אשר מבטיחים מחסור של חדירות לא בררניים2. בנוסף, תאי אנדותל של המוח microvessel אקספרס צמוד לצומת, adherens צומת חלבונים לפעול טופס בדיקה גופנית "לאטום" בין תאי אנדותל סמוכים ולהגביל במידה רבה paracellular דיפוזיה של חומרים נישא בדם לתוך המוח parenchyma. אכן, חדירות סלקטיבית של חומרים אנדוגניים ו אקסוגני מחייב ביטוי פונקציונאלי של ספיגת ו בזרימת מובילי3. צמתי הכללית, חזק, צמתי adherens, מסועי לעבוד ביחד כדי לשמור על המאפיינים מכשול ייחודי של BBB.

BBB היא מכשול דינאמי מגיב לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי. לדוגמה, היפוקסיה/reoxygenation מתח הוכח לווסת ביטוי של חלבונים צומת קריטית חזק (קרי, occludin, zonulae occluden-1 (זואי-1)), אשר מזוהה עם חדירות מוגברת paracellular אל כלי דם סמנים כזה כמו סוכרוז4,5,6. תצפיות דומות שנעשו ב- BBB בסביבה של פגיעה מוחית טראומטית7 ו-8,כאבים דלקתיים היקפיים9. אלה אותן מחלות יכול גם לווסת את מנגנוני הובלה ב BBB10,11,12,13,14. אכן, היפוקסיה/reoxygenation פגיעה מגבירה ביטוי פונקציונאלי אורגני אניון. מעביר מפוליפפטיד 1a4 (Oatp1a4) ב- BBB, אשר יכול להוביל עליות משמעותיות התעבורה דם-כדי-מוח של סובסטרטים תחבורה Oatp ספציפיים כגון taurocholate ו atorvastatin13. מאפייני BBB יכול להשתנות גם ע י pharmacotherapy עצמו, מנגנון זה יכול ליצור בסיס עבור שני שינויים עמוקים של אפקטיביות התרופה במוח, סמים-תרופתיות. לדוגמה, פרצטמול מטרות קולטן גרעיני מנגנוני איתות ב microvascular אנדותל תאי המוח, מגביר ביטוי פונקציונאלי של המשגר בזרימת קריטי P-גליקופרוטאין (P-gp), ומשנה תלויי-זמן שיכוך כאבים שהוענקו מורפיום, כאבים אופיואידים סמים ו P-gp הוקמה תחבורה המצע15. הבנה מעמיקה של שינויים BBB, יכולה להיגרם על ידי מחלות או סמים, דורש גם זיהוי ואפיון של מנגנוני הרגולציה ספציפי לשלוט לבצע שינויים אלה. אכן, דיסקרטית איתות המסלולים זוהו תאי אנדותל microvascular המוח לשלוט הביטוי מולקולרית של צומת חזק חלבונים16,17 ו מובילי15, 18,19. יחדיו, תצפיות אלה מציינים מורכבים מסלולים מולקולריים המעורבים ברגולציה של צמתי צר BBB, מסועי על בריאות ומחלה.

אתגר משמעותי במחקר של BBB היא הדרישה המוחלטת של שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח נגזר חיות ניסוי והכנה עוקבות של דגימות ממברנה. דגימות אלה חייבים להיות מוכנים כך הם גם מועשר בתאי האנדותל microvascular המוח, מוגבל בנוכחות של סוגי תאים אחרים. במהלך השנים האחרונות, מתודולוגיות מרובים עבור בידוד של microvasculature מהמוח מכרסמים דווחו21,2220,13,הספרות המדעית. מאמר זה מתאר פשוט, חזקה, בעלת שיטה לשחזור עבור בידוד של microvessels מהמוח עכברוש, הכנת דוגמאות מועשרת ממברנה אנדותל שיכול לשמש לניתוח של ביטוי חלבון. יתרון של הפרוטוקול בידוד microvessel היא היכולת להשיג תכשירים לדוגמה באיכות גבוהה ועם תשואה מספיק חלבון של חיה ניסיוני בודדים. פעולה זו מאפשרת השיקול ההשתנות הבין-בעלי חיים בביטוי חלבונים. כזה מקדמה של פרוטוקול זה השתפרה במידה החוסן של BBB מחקרים כי הערכת יתר (או תת הערכה) על המשמעות האמיתית של חלבון שינויים ב- BBB עכשיו ניתן להימנע. בנוסף, הכללת מספר השלבים צנטריפוגה עם לתוספי מאפשר העשרת משופרת של microvessels בדגימות ניסיוני תוך עידוד הסרה של המרכיבים הסלולר לא רצויות כגון נוירונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ו לציית הלאומית המכונים לבריאות (NIH) ומחקר חיה: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) הנחיות. הזרם פרוצדורליים עבור הפרוטוקול מתואר באיור1.

1. הגדרת תהליך

  1. להכין מאגר microvessel המוח (BMB). התחל על ידי שקילה 54.66 g D-מניטול, 1.90 g EGTA ו- 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (קרי, טריס) בסיס לתוך גביע נקי. להוסיף אני 1.0 ליטר מים יונים. לערבב את הרכיבים של המאגר BMB באמצעות של פגים. לאחר הפתרון היה מעורב באופן יסודי, להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 1.0 M HCl.
  2. להכין 26% לתוספי (MW 75,000) פתרון (w/v) לפני מאלחש חיות. הכינו את הפתרון לתוספי כפי שתואר בשלבים הבאים.
    הערה: חשוב באופן קריטי להכין פתרון זה מבעוד מועד כי לתוספי יכול לקחת כ- 1.5-2 h כדי להמיס במאגר מימית.
    1. שוקלים לצאת לתוספי אבקת (26 גרם לכל מאגר 100 מ ל) לתוך גביע נקי.
    2. למדוד את נפח מתאים של BMB, לוותר על תוך גביע נפרדים, נקי.
    3. שופכים לאט BMB לתוך כשהספל המכילה אבקת לתוספי. באופן ידני מערבבים את אבקת לתוספי בזמן מזיגת BMB באמצעות מוט מערבבים זכוכית.
    4. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl M 1.0 מיד מוקדמת לשימוש.
      הערה: בידוד טיפוסי של המוח microvessels מ 12 חולדות ספראג-Dawley בודדים (זכר או נקבה; בגיל 3 חודשים; 200-250 g) דורש 200 מ של פתרון לתוספי (קרי, לתוספי 52 g ב- 200 מ של BMB).

2. מיצוי של רקמת המוח של חולדות ספראג-Dawley

  1. בעקבות ניסיוני הטיפול הרצוי, עזים ומתנגד חולדות ספראג-Dawley באמצעות קטאמין (50 מ"ג/ק"ג; i.p. 2.5 mL/kg) וחריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/מ"ל; 2.5 מ"ל/ק"ג. אני, p.). לדלל קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים ב- saline 0.9% כדי ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל ו- 4.0 מ"ג/מ"ל בהתאמה. המתת חסד בעלי חיים ע י עריפת ראשו באמצעות גיליוטינה מחודדים בהתאם להנחיות IACUC. השתמש בפרוצדורה זהה עבור חולדות ספראג-Dawley גם זכר וגם נקבה.
  2. נכרות את העור מן הגולגולת חולדה על ידי ביצוע חתך רוחבי אחד באמצעות מספריים כירורגיים.
  3. באמצעות rongeurs, בזהירות הסר את לוחית הגולגולת וחושפים את המוח.
  4. מסירים את המוח בעזרת מרית. לנתק את המוח הגדול ולמקם על רקמת המוח מבודדים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 5 מ של BMB. הוסף μL 1.0 של מעכב פרוטאז קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר מיד לפני השימוש.

3. המוח עיבוד

  1. העברה על רקמת המוח מהצינור חרוט 50 מ ל צלחת פטרי נקי.
  2. בעדינות באמצעות מלקחיים, לגלגל המוח על 12.5 ס מ קוטר מסנן נייר כדי להסיר את קרומי המוח החיצונית, אשר הם דבקו באופן רופף של קליפת המוח. בעדינות לחץ על רקמת המוח נגד נייר סינון וגלגלי הרקמה שוב. הפעל נייר הסינון לעתים קרובות במהלך שלב זה.
  3. להפריד מקלעת דמית העין בין האונות באמצעות מלקחיים.
    הערה: מקלעת דמית העין מופיע ברור עלי הלוואי קרומיים רקמה מקומי על פני השטח של החדרים מוחי.
  4. בעדינות לשטח על רקמת המוח ולהסיר הנותרים קרומי המוח, הריח נורות באמצעות מלקחיים.
  5. למקם את רקמת מוח קליפתי מרגמה סיינג טאו. להוסיף mL 5.0 של BMB מעכב פרוטאז המכיל קוקטייל המליטה.
  6. שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize על רקמת המוח באמצעות 15 לאורך קווים-3,700 סל ד. לבצע המגון באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. בין המגון כל מדגם בודדים, נקה את שהעקב באמצעות אתנול 70%.
    הערה: המגון משיחות צריך להיות עקבי במונחים של קצב ובהיקף.
  7. שופכים את homogenate לתוך צנטריפוגה שכותרתו צינורות.

4. צנטריפוגה צעדים

  1. להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי פתרון כל שפופרת צנטריפוגה שכותרתו המכיל homogenate במוח.
  2. היפוך הצינור פעמיים ולאחר מכן ביסודיות מערבולת המדגם. לנהל את vortexing של כל דגימה באמצעות זוויות מרובים כדי להבטיח ערבוב יסודי של המוח פתרון homogenate 26% לתוספי פתרון....
  3. צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    הערה: עבור כמה ניתוחים, זה שימושי להשוות בין המוח microvessels עם parenchyma המוח. צריך להיות להערכת ביטוי חלבון המוח parenchyma הנדרשים, תגובת שיקוע של שלב זה צנטריפוגה (קרי, המוח parenchymal שבר) יכול להיות נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
  4. הסר את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק, זכוכית פסטר פיפטה.
    הערה: זהירות יש לנקוט כדי לא להפריע בגדר. אחרת, כמות microvessels המוח שנאספו יקטן, אשר יקטין באופן משמעותי את התשואה חלבון של הליך זה.
  5. Resuspend בגדר ב mL 5.0 של BMB המכילה פרוטאז מעכב קוקטייל (קרי, 1.0 μL פרוטאז מעכב קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר). מערבולת בגדר כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  6. להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי כל שפופרת צנטריפוגה ו מערבולת כמתואר בצעדים 4.1-4.2 של פרוטוקול זה.
  7. צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
  8. באמצעות תרמוס פיפטה מזכוכית, תשאף תגובת שיקוע ולהבטיח את גלולה המכילה microvessel המוח לא מופרת.
    הערה: חומר עודף יש דבקה הקיר צינור אינו מכיל microvessels, צריך להיות בזהירות מנקים את הסיר.
  9. חזור על שלבים 4.5 עד 4.8 נוספים פעמיים.
  10. פעם צעדים צנטריפוגה לתוספי 4 הושלמו, להוסיף 5.0 מיליליטר BMB צניפה כל המערבולת כדי resuspend את הדגימה.
    הערה: לאחר השלמת שלב 4.10, microvessels כל ניתן לאסוף לניתוח של חלבון לוקליזציה. זה יכול להתבצע על-ידי לקיחת μL 50 aliquot של microvessel מחדש על תנאי צניפה מורחת על משטח זכוכית מיקרוסקופ. Microvessels הם ואז חום-קבוע ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חימום ואחריו קיבוע באתנול קר כקרח עבור שקופיות נוספות 10 דקות ואז ניתן לאחסן ב 4 ° C עד הדרושים עבור הדמיה מחקרים.

5. Ultracentrifugation להכין דגימות של ממברנות Microvascular מוחי מוחלט

  1. העברת דגימות מהמגן סיינג טאו.
  2. שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize רקמת המוח באמצעות 8-10 לאורך קווים ב-3000 סל ד. המגון מתנהל באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. לנקות את שהעקב באמצעות אתנול 70% בעקבות המגון כל דגימה בודדת.
  3. העברת דגימות לנקות צינורות ultracentrifuge. מספר ולשקול כל שפופרת בודדים. איזון, זוג הצינורות לפני טעינה אל הרוטור ultracentrifuge.
    הערה: כל שקילה, זיווג של צינורות ultracentrifuge שחייבת להתנהל עם הפקקים כדי להבטיח מדידה מדויקת של שפופרת משקולות.
  4. צנטריפוגה דגימות ב x 150,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  5. באמצעות flask ואקום זכוכית פסטר פיפטה, תשאף תגובת שיקוע באמצעות טיפול לא להפריע בגדר ממברנה נימי.
  6. בהתבסס על גודל צניפה, להוסיף אמצעי אחסון המתאים מאגר אחסון, אשר מורכבת BMB ומים יונים על יחס 1:1 (v/v). בדרך כלל, כדורי הם resuspended ב 400-500 μL מאגר אחסון. להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז מאגר אחסון על יחס של 1.0 μL לכל 1.0 מ"ל של מאגר אחסון.
  7. מערבולת דגימות resuspend צנפה מאגר אחסון.
  8. באמצעות כוס פסטר פיפטה, העברת דגימות ממברנה נימי צינור microcentrifuge שכותרתו mL 1.5.
  9. מעבר מדגם באמצעות מחט מזרק 5 x כדי להבטיח המדגם באופן יסודי מעורב כי אין אגרגטים סלולרית קיימת.
  10. חנות דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד הנדרש לצורך ניתוח.
    הערה: תכולת החלבון של כל מדגם ממברנה microvessel נמדד באמצעות שיטת ברדפורד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרם ניסיוני עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה microvessel מוצג באיור1. באמצעות ההליך המובאת כאן, בידוד מוצלחת של microvessels ללא פגע מן מוח עכברוש הוא הפגין (איור 2 א). כלים אלה התקבלו לאחר סיום צנטריפוגה עם לתוספי, מיד לפני התחלת ultracentrifugation להכין דגימות ממברנה (קרי, לאחר סיום שלב 4.10). בתמונה זו, microvessel זה ישאר באמצעות נוגדן נגד Oatp1a4, נהג זה הוכח לבוא לידי ביטוי גם ב קרום הפלזמה של המוח תאי אנדותל microvascular2,11,13, 18. באמצעות ניתוח תספיג (איור 2B), קרום גלמי microvessels שנקטפו חולדות נקבות ספראג-Dawley הוצגו להיות מועשר טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM-1; ידוע גם בשם CD31), חלבון סמן עבור microvasculature במוח. PECAM-1 הוא מעכבות שיתוף קולטן מעורב תא T ו- B-cell איתות מתבטאת מאוד על קרום הפלזמה של תאי אנדותל כלי הדם. במהלך המיטוב של פרוטוקול זה, העשרה PECAM נצפתה בדגימות ממברנה המוכנים לשניים עד ארבעה צעדים צנטריפוגה לתוספי. כפי שמוצג באיור 2B, לא היה הבדל בביטוי PECAM בין דגימות שהוכנו באמצעות השלבים צנטריפוגה שונים; עם זאת, ארבע מהדורות לתוספי הביא בביטוי משופרת של תחבורה אנדותל חלבונים, אשר מציין microvessel משופר העשרה הדגימות. בנוסף, השימוש dextrans ארבע ספינים להסרת משופרת של המרכיבים הסלולר לא רצויים כמצוין על-ידי ביטוי מופחתת של חלבונים סמן עצביים כגון synaptophysin18. לכן, כל ההכנות עוקבות עבור המוח microvessel ממברנות בוצעו באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה לתוספי. בניסויים שלנו תספיג ', שימש את טובולין חלבונים המרכיבים אותה microtubule פקד הטעינה. כפי שיקבע את שיטת ברדפורד, ממברנה ההכנות תשואה בדרך כלל ריכוז חלבון הנע בין 5.0 מ"ג/מ"ל 10.0 מ"ג/מ"ל. חלבון נציג כמת תוצאות מתוארים בטבלה1. ערכי חלבון אלה היו נחושים בהתבסס על עיקול רגיל שנוצר באמצעות אלבומין שור (BSA; 2.0 mg/mL) כסטנדרט (איור 3). דגימות חלבון היו מדולל 10-fold ב ברדפורד וזמינותו.

בעקבות חלבון כמת, דגימות ממברנה microvessel יכול להיות מנוצל עבור הביוכימי מתודולוגיות לניתוח חלבון כגון ניתוח תספיג, שהכלים נקודה או co-immunoprecipitation. איור 4A מתאר תספיג נציג עבור ה BBB תחבורה חלבון גלוקוז טרנספורטר-1 (היצף-1) שבו נותחו דגימות טבלה 1 . נקה להקות יחיד במשקל מולקולרי המתאים (קרי, חזה כדי להיות 54 kDa) עבור BBB זו באה לידי ביטוי מאוד חלבון התגלו בכל מדגם ממברנה. כל ליין בודדים בתספיג חלבון זה מייצג microvessel ממברנה מדגם שהוכן מחיה ניסיוני יחיד. חלבון שווה כל ליין נקבע באמצעות ATPase נתרן-אשלגן (קרי, Na+/K+ ATPase; החזוי משקל מולקולרי = 113 kDa) כפקד טעינה. כפי שמוצג באיור 4B, הרגש הגבוה ביותר של היצף-1 ב- BBB נצפתה אצל חולדות זכרים לעומת עמיתיהם הנשי. אין הבדל בביטוי של Na+/K+ ATPase נצפתה בין חיות זכר ונקבה. לניתוח זה densitometric, להקות היו quantitated באמצעות תוכנת ImageJ.

Figure 1
איור 1: חלוקה של הליכים ופרוטוקולים כדי לבודד עכברוש המוח microvessels וכדי להכין דגימות ממברנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג נתונים מציג microvessel ללא פגע וביטוי של חלבון סמן תא אנדותל כלי הדם. ת: Immunofluorescence מכתים הראה לוקליזציה של Oatp1a4, נהג זה הוכח לבוא לידי ביטוי גם ב- BBB, ב- microvessel המוח ללא פגע מבודד כפי שמתואר פרוטוקול זה. Oatp1a4 לוקליזציה זוהה באמצעות נוגדן polyclonal של הארנב ספציפי נגד Oatp1a4 לדילול של 1:10. הנוגדן המשני היה פלורסנט מצומדת ארנב אנטי איג בשעה לדילול 1:300. סרגל קנה מידה = 7.5 μm. ב': ניתוח תספיג הפגינו את הטוהר של דגימות microvessel על-ידי הצגת העשרה של החלבון הסמן תא אנדותל ספציפי PECAM-1, אשר זוהה באמצעות נוגדן חד שבטי העכבר לדילול מטריים. הנוגדן המשני היה העכבר אנטי איג-לדילול 1:50, 000. BH = המוח homogenate, MV = microvessel גולמי שבר, MVM = ממברנות microvessel במוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: עיקול רגיל נציג עבור שיטת ברדפורד. אלבומין שור (BSA) שימשה כסטנדרט, היה מדולל על ריכוזי הבאים: 0 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 mg/mL. ספיגת נמדדה ב = 595 nm. כל נקודת נתונים מייצג ממוצע של שלוש קריאות ספיגת לפי ריכוז BSA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : תספיג נציג, מציג סקס הבדלים בביטוי היצף-1 קרום מוכן דגימות מן Microvessels המוח עכברוש מבודד. ת ניתוח תספיג מראה לביטוי היצף-1 בדגימות ממברנה המוכן microvessel מבודד חולדות ספראג-Dawley זכר ונקבה. היצף-1 זוהה באמצעות נוגדן חד שבטי ארנב לדילול שבערך. הנוגדן המשני היה IgG נגד הארנב monoclonal לדילול 1:40,000. נה=/K+ ATPase, סמן קרום פלזמה, הפקד הטעינה, זוהתה באמצעות IgG polyclonal של הארנב אנטי-דילולים 1: 40,000. ב': ניתוח densitometric של היצף-1 ביטוי בדגימות קרום מבודד חולדות ספראג-Dawley זכר ונקבה. תוצאות באים לידי ביטוי אומר SEM של חיות ניסוי 6 לכל קבוצה לטיפול. כוכביות מצביעים על נקודות נתונים הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית של פקד. ערך של p < 0.05 נחשב להיות משמעותיים מבחינה סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חיה ספיגת ממוצע ספיגת מנוכי עונתיות ריכוז מחושב ריכוז בפועל
(Λ = 595 nm) (mg/ml) (mg/ml)
1 זכר 0.7967 0.3859 0.768 7.68
2 זכרים 0.7849 0.3741 0.7417 7.42
3 זכרים 0.8187 0.4079 0.8173 8.17
4 גברים 0.7985 0.3877 0.7721 7.72
5 זכר 0.7943 0.3835 0.7628 7.63
6 זכרים 0.7251 0.3143 0.6084 6.08
1 נקבה 0.7114 0.3006 0.578 5.78
2 הנשי 0.7993 0.3885 0.7738 7.74
3 נשים 0.8201 0.4093 0.8203 8.2
4 נשים 0.7526 0.3418 0.6698 6.7
5 הנשי 0.8008 0.39 0.7773 7.77
6 הנשי 0.7975 0.3867 0.77 7.7

טבלה 1: נציג חלבון ריכוזים של המוח Microvessel ההכנות נגזר חולדות זכר ונקבה ספראג-Dawley. ספיגת מנוכי עונתיות ערכים נקבעים על-ידי חיסור רקע ספיגת-l = 595 nm מן הממוצע ספיגת ערכים עבור כל חיה ניסיוני. ב הזה assay, רקע ספיגת היה נחוש בדעתו להיות 0.4108.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה מתוארת שיטה פשוטה ויעילה של הכנת דגימות חלבון ממברנה microvessels טרי מבודד מן החולדה רקמת המוח. דווח על מספר גישות עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels ו/או דור של ההכנות ממברנה מ microvasculature מבודדים21,22 20,13,ספרות , 24. פרוטוקול בידוד microvessel המתואר לעיל אמנם דומה עקרונית, גישה זו מוטבה כדי לאפשר הכנת ממברנה דגימות עם חלבון מעולה התשואה מחיה ניסיוני יחיד. הזה מראש חיסל את הצורך אל הבריכה microvessels לפחות שלושה עכברים ספראג-Dawley על מנת לקבל דגימות עם העשרה חלבונית משביע רצון לשימוש בגישות שונות לניתוח חלבון. גישות כאלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תספיג ניתוח, שהכלים נקודה ו- co-immunoprecipitation. יצוין, כי הנוהג של איגוד microvessels של חיות ניסוי מרובים כדי ליצור דוגמה אחת מאוד מפחית את השתנות קבוצתיים. במידה זו, microvessel באגירת עלולה להביא נתונים עם התפשטות מופחתת שאינו מייצג השתנות נכון בביטוי חלבונים נצפתה בקרב אוכלוסיה של חיות ניסוי. מאז ניתן להכין דוגמאות חיות ניסוי יחיד, ההשתנות האמיתי של אוכלוסיה המחקר נלכד, מה שמאפשר עבור נתונים ניסיוני ואפשר להשיג זה עוד נציג של תהליך pathophysiological או תרופתי תחת בדיקה. יתרון נוסף הוא כי דגימות ממברנה microvessel ניתן להכין באמצעות מספר מופחת של חיות ניסוי.

אולי השיקול הכי קריטי בביצוע של פרוטוקול זה כרוך השלבים צנטריפוגה. אכן, צנטריפוגות יכולים להיות שונים בין מעבדות עקב שלהם גיל, יצרן, ו/או הכולל מצב תקינות. זה יכול להוביל וריאציות משמעותית רמת בפועל g (או רמת סל ד) ספין כדי ספין. בתפקיד זה וריאציה שלמות הדגימה ניתן למזער על ידי צנטריפוגה של כל הדגימות ב ניתוח השוואתי יחיד ביחד על הרוטור אותו באותו זמן. לדוגמה, אם הרוטור יש רק 12 חריצי זמינים עבור צינורות מדגם, ואז הבידוד והכנה של דגימות microvessel בניסוי בודדים תהיה מוגבלת לשתים עשרה. שיקול זה מבטיח כי הם דוגמאות מוכן המקבילות כי כל השתנות בביטוי חלבונים כלומר בין קבוצות הניסוי ניתן להקצות את תנאי הטיפול עצמו.

שיקול נוסף כרוך ההכנה של הפתרון לתוספי 26%, אשר נדרש עבור הפרדת microvessels מוח ורקמות parenchymal המוח באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. לתוספי הוא פולימר של גלוקוז עם שכיחות של היחידות α-1, 6-מקושרים, בדרך כלל בעל מבנה ליניארי של25. יש גם קיבולת מים גבוהה מחייב. לדוגמה, 1 גר' לתוספי 75 (קרי, לתוספי עם משקל מולקולרי מרושע של 75,000 דא הוא בשימוש ב פרוטוקול זה) שומר על 20-25 מ ל מים. זה רכוש של לתוספי יכול להוביל אתגרים עמוקה המסת האבקה לתוך המאגר מימית. מסיסות מימית יכולים להשתפר על ידי חימום הפתרון לתוספי טמפרטורה מרבית של 40 מעלות צלזיוס. על חימום, הפולימר אינטראקציה פחות עם מולקולות המים, ובכך לגרום לתוספי לאמץ קונפורמציה פחות המורחב (קרי, תואר נמוך יותר של החזקת מים) בתמיסה. חימום לטמפרטורות גבוהות יגרמו הפולימר לתוספי לשבור, לכן, זה יהיה לא אפקטיבי כמו ריאגנט הפרדת. בנוסף, זה חיוני כי ה-pH של התמיסה לתוספי ניתן לכוונן 7.4 מיד לפני השימוש. פתרונות של 26% לתוספי תוכלו לחוות pH משמעותי משמרות, אפילו מעל 1-2 שעות לאחר ההכנה. בשל שיקולים אלו, 26% לתוספי שהפתרון צריך להיות מוכן ביום של הניסוי, אבל עם מספיק זמן לפני ניתוקה של רקמת המוח כדי לאפשר פירוק והתאמה המתאימים של pH.

מגבלה של פרוטוקול זה כרוך הנוכחות של סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (NVU) בהכנות microvessel. בנוסף תאי אנדותל, מורכבת NVU מרכיבי התא השונים כולל תאי גליה (קרי, האסטרוציטים, מיקרוגלייה), pericytes של הנוירונים 3,26,27. בידוד של microvessels מהמוח מכרסמים בדרך כלל מראה העשרה עם תאי אנדותל כלי הדם; עם זאת, ביטוי של חלבונים סמן עצביים, כמו גם ביטוי של גליה fibrillary חומצי החלבון (GFAP), סמן אסטרוציט הוקמה, הוא גם ציין. בנוסף, pericytes נמצאים בהכנות לדוגמה עקב שיוכן אינטימי אנדותל כלי הדם. בזמן הנוכחי, זה כמעט בלתי אפשרי לבודד את המוח microvessels של חיות ניסוי ולחסל כל pericytes נוירונים, האסטרוציטים. עם זאת, פרוטוקול זה כבר מתקדמים באמצעות צנטריפוגה מרובי שלבים כך הדגימות מועשר בתאי האנדותל (קרי, כפי שמצוין על-ידי ביטוי משופרת של PECAM-1 לאחר כל שלב צנטריפוגה) עם נוכחות מוגבלת של אחרים (סוגי תא קרי, כמצוין על-ידי מופחתת ביטוי של סמן עצביים חלבון synaptophysin-1 לאחר כל שלב צנטריפוגה).

באופן כללי, גישה זו עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות קרום ניתן להתאים במעבדה כל עניין בלימוד BBB חלבונים בתנאים pathophysiological או תרופתי. לדוגמה, פרוטוקול זה מספק דוגמאות microvessel זה יכול להיות מנוצל עבור חקר חלבונים תחבורה סמים endogenously באים לידי ביטוי ב-2,BBB18. החוסן של גישה זו אפשרה את ההתבוננות דיסקרטית לשינויים Oatp1a4 בתגובה לגירויים תרופתי, נתונים ניסיוני הודיע עיצוב קפדני מחקרים להערכת הפונקציה טרנספורטר ורגולציה -BBB. הפרוטוקול המתואר לעיל ניתן גם להחיל על חלבון ניתוחים של צומת חזק חלבונים וחלבונים צומת adherens במאמץ להבין BBB בתנאים פיזיולוגיים וכדי ללמוד שינויים ב- BBB שלמות בתגובה pathophysiological לחצים תרופתי. בבירור, פרוטוקול זה ניתן להתאים ליישומים מרובים בשדה BBB ו, לכן, מייצג שיטה פשוטה אך חזקים, לשחזור כי ניתן לשלב לימודי BBB הדורשים אנליזת חלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01-NS084941), אריזונה הנציבות מחקר ביו-רפואי (ADHS16-162406) PTR. ווה קיבל בעבר תמיכה של פגישה מראש הדוקטורט נבחרת מוסדות של בריאות הכשרה למענק (T32-HL007249).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich #P8340 Component of brain microvessel buffer
D-mannitol Sigma-Aldrich #M4125 Component of brain microvessel buffer
EGTA Sigma-Aldrich #E3889 Component of brain microvessel buffer
Trizma Base Sigma-Aldrich #T1503 Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000) Spectrum Chemical Mftg Corp #DE125 Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine MWI Animal Health #501072 General anesthetic
Xylazine Western Medical Supply #5530 General anesthetic
0.9% saline solution Western Medical Supply N/A General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter) VWR #28320-100 Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes Sarstedt #60.540.386 Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay ThermoFisher Scientific #23236 Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer DWK Life Sciences #903475 Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder DWK Life Sciences #358039 Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich #H1758 Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific #23210 Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps Fine Science Tools #91100-12 Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools #16020-14 Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific #352070 Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets ThermoFisher Scientific #13-678-20C Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous Sigma-Aldrich #459836 Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter #41121703 Used for ultracentrifugation of samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
  3. Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
  4. Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
  5. McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
  6. Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
  7. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  8. Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
  9. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  10. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  11. Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
  12. Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
  13. Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
  14. Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
  15. Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
  16. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  17. Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
  18. Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
  19. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  20. Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
  21. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
  22. McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
  23. Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
  24. Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
  25. Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
  26. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  27. Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).

Tags

מדעי המוח גיליון 135 מחסום הדם - מוח המוח Microvessels לתוספי ההפרדה צנטריפוגה דיפרנציאלית תא אנדותל קרום חלבונים לפרמקולוגיה מולקולרית מובילי צמתי צר ווסטרן סופג
שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brzica, H., Abdullahi, W., Reilly,… More

Brzica, H., Abdullahi, W., Reilly, B. G., Ronaldson, P. T. A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels. J. Vis. Exp. (135), e57698, doi:10.3791/57698 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter