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Neuroscience

एक सरल और Reproducible विधि हौसले से अलग चूहे मस्तिष्क Microvessels से झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57698
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

यहां, चूहे मस्तिष्क microvessels के अलगाव के लिए एक विधि और झिल्ली के नमूनों की तैयारी के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल व्यक्तिगत पशुओं से स्वीकार्य प्रोटीन की उपज के साथ समृद्ध microvessel नमूनों के उत्पादन का स्पष्ट लाभ है । नमूने तो मस्तिष्क microvascular endothelium में मजबूत प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) विभिन्न pathophysiological और औषधीय उत्तेजनाओं का जवाब है कि एक गतिशील बाधा ऊतक है । इन उत्तेजनाओं से उत्पन्न इस तरह के परिवर्तन बहुत मस्तिष्क को दवा वितरण मिलाना कर सकते हैं और, विस्तार से, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों के उपचार में काफी चुनौतियों का कारण. कई BBB परिवर्तन है कि pharmacotherapy को प्रभावित, प्रोटीन है कि स्थानीय और endothelial कोशिकाओं के स्तर पर व्यक्त शामिल हैं । दरअसल, स्वास्थ्य और रोग में BBB फिजियोलॉजी पर इस तरह के ज्ञान का इन झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन में काफी रुचि छिड़ी हुई है. एक बुनियादी विज्ञान अनुसंधान के दृष्टिकोण से, यह मस्तिष्क ऊतक से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल लेकिन मजबूत और reproducible विधि प्रयोगात्मक पशुओं से काटा के लिए एक आवश्यकता का तात्पर्य । आदेश में हौसले से अलग microvessels से झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए, यह आवश्यक है कि नमूना तैयारी endothelial कोशिकाओं में समृद्ध किया जा सकता है, लेकिन neurovascular इकाई के अन्य कोशिका प्रकार की उपस्थिति में सीमित (यानी, astrocytes, microglia, न्यूरॉन्स, pericytes) । एक जोड़ा लाभ के लिए व्यक्तिगत पशुओं से नमूने तैयार करने की क्षमता है ताकि एक प्रयोगात्मक जनसंख्या में प्रोटीन अभिव्यक्ति की असली परिवर्तनशीलता पर कब्जा करने के लिए । इस पांडुलिपि में, एक विधि है कि चूहे मस्तिष्क microvessels और झिल्ली के नमूनों की तैयारी अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है के बारे में विवरण प्रदान की जाती हैं । Microvessel संवर्धन, व्युत्पंन नमूनों से, जहां dextran नमूना बफर में शामिल है चार केंद्रापसारक कदम का उपयोग करके हासिल की है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से अपने स्वयं के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल से उत्पंन नमूनों के लिए प्रोटीन विश्लेषण प्रयोगों है कि बहुत शारीरिक, pathophysiological, और औषधीय उत्तेजनाओं को BBB प्रतिक्रियाओं की समझ सहायता कर सकते है से मजबूत प्रयोगात्मक डेटा उपज दिखाया गया है ।

Introduction

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और प्रणालीगत संचलन के बीच इंटरफेस पर मौजूद है और मस्तिष्क homeostasis के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । विशेष रूप से, BBB कार्य करने के लिए ठीक मस्तिष्क extracellular द्रव में घुला हुआ सांद्रता नियंत्रण और कुशलतापूर्वक उन पोषक तत्वों है कि मस्तिष्क ऊतक द्वारा आवश्यक है की आपूर्ति के लिए सीएनएस1की काफी चयापचय मांगों को पूरा । इन भूमिकाओं का मतलब है कि BBB, जो microvascular endothelial सेल के स्तर पर मुख्य रूप से मौजूद है, असतत तंत्र है कि कुछ पदार्थों को मस्तिष्क पैरेन्काइमा का उपयोग करने में सक्षम है, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि संभावित हानिकारक xenobiotics नहीं कर सकते है अधिकारी चाहिए जमा. दरअसल, मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं fenestrated और प्रदर्शन सीमित pinocytosis नहीं कर रहे हैं, जो गैर की कमी-चयनात्मक पारगम्यता सुनिश्चित करता है2. इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शन और adherens जंक्शन प्रोटीन कि आसंन endothelial कोशिकाओं के बीच एक भौतिक "मुहर" फार्म और बहुत मस्तिष्क में रक्त जनित पदार्थों के paracellular प्रसार को प्रतिबंधित करने के लिए कार्य एक्सप्रेस पैरेन्काइमा. दरअसल, अंतर्जात और exogenous पदार्थों के चयनात्मक पारगम्यता और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक अभिव्यक्ति की आवश्यकता है3। कुल मिलाकर, तंग जंक्शनों, adherens जंक्शनों, और ट्रांसपोर्टरों BBB के अद्वितीय बाधा गुणों को बनाए रखने के लिए संगीत कार्यक्रम में काम करते हैं ।

BBB एक गतिशील बाधा है कि शारीरिक, pathophysiological, और औषधीय उत्तेजनाओं का जवाब है । उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया/reऑक्सिजन तनाव महत्वपूर्ण तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए दिखाया गया है (यानी, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), जो संवहनी मार्करों के लिए वृद्धि की paracellular पारगम्यता के साथ जुड़ा हुआ है ऐसे सुक्रोज4,5,6के रूप में । इसी तरह की टिप्पणियों दर्दनाक मस्तिष्क चोट7 और परिधीय भड़काऊ दर्द की सेटिंग में BBB पर किया गया है8,9. ये वही बीमारियां भी BBB10,11,12,13,14में परिवहन तंत्र मिलाना कर सकते हैं । दरअसल, हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन चोट Oatp1a4 में कार्बनिक आयनों परिवहन पॉलीपेप्टाइड 1a4 (BBB) के कार्यात्मक अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जो विशिष्ट Oatp परिवहन सब्सट्रेट के रक्त में मस्तिष्क परिवहन में उल्लेखनीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं taurocholate और atorvastatin13. BBB गुण भी खुद pharmacotherapy द्वारा बदला जा सकता है, एक तंत्र है कि मस्तिष्क में दवा प्रभावशीलता में दोनों गहरा परिवर्तन और नशीली दवाओं के लिए बातचीत के लिए एक आधार बनाने के लिए कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एसिटामिनोफेन मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में परमाणु रिसेप्टर संकेतन तंत्र लक्ष्य, महत्वपूर्ण समाप्ति ट्रांसपोर्टर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) के कार्यात्मक अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, और समय पर निर्भर analgesia को संशोधित अफ़ीम, एक opioid एनाल्जेसिक दवा द्वारा संमानित और पी जीपी परिवहन सब्सट्रेट15की स्थापना की । BBB परिवर्तन की एक पूरी तरह से समझ, कि रोगों द्वारा या दवाओं द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, यह भी पहचान और विशिष्ट विनियामक तंत्र है कि इन संशोधनों को नियंत्रित करने के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । दरअसल, असतत संकेत मार्ग मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं है कि तंग जंक्शन प्रोटीन की आणविक अभिव्यक्ति नियंत्रण में पहचान की गई है16,17 और ट्रांसपोर्टरों15, 18,19. एक साथ ले लिया, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि जटिल आणविक मार्ग BBB तंग जंक्शनों और ट्रांसपोर्टरों दोनों स्वास्थ्य और रोग में के नियमन में शामिल हैं ।

BBB के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रयोगात्मक पशुओं से व्युत्पंन मस्तिष्क ऊतक से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल और प्रभावी विधि की पूर्ण आवश्यकता है और झिल्ली के नमूनों की बाद में तैयारी है । इन नमूनों को तैयार किया जाना चाहिए ताकि वे दोनों मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में समृद्ध हो और अन्य कोशिका प्रकार की उपस्थिति में सीमित. पिछले कई वर्षों में, मूषक मस्तिष्क से microvasculature के अलगाव के लिए कई तरीके वैज्ञानिक साहित्य13,20,21,22में सूचित किया गया है । यह लेख चूहे मस्तिष्क से microvessels के अलगाव के लिए एक सरल, मजबूत, और reproducible विधि का वर्णन करता है और endothelial झिल्ली-समृद्ध नमूनों कि प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए । इस microvessel अलगाव प्रोटोकॉल का एक लाभ के लिए उच्च गुणवत्ता के नमूना तैयार करने और एक व्यक्ति प्रयोगात्मक पशु से पर्याप्त प्रोटीन उपज के साथ प्राप्त करने की क्षमता है । यह प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर-पशु परिवर्तनशीलता के विचार को सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में इस तरह के एक अग्रिम बहुत BBB अध्ययन की मजबूती में सुधार हुआ है क्योंकि अधिक अनुमान (या के तहत अनुमान) BBB में प्रोटीन परिवर्तन के सच परिमाण के अब बचा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, dextran के साथ कई केंद्रापसारक कदम के शामिल किए जाने के प्रयोगात्मक नमूनों में microvessels के सुधार संवर्धन सक्षम बनाता है, जबकि ऐसे ंयूरॉंस के रूप में अवांछित सेलुलर घटकों को हटाने की सुविधा ।

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Protocol

नीचे उल्लिखित सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) और पशु अनुसंधान के अनुरूप: Vivo प्रयोगों (आने) के दिशानिर्देशों में रिपोर्टिंग. प्रोटोकॉल के लिए प्रक्रियात्मक प्रवाह चित्र 1में दर्शाया गया है ।

1. प्रक्रिया के लिए सेट अप

  1. ब्रेन microvessel बफर (BMB) तैयार करें । ५४.६६ g D-mannitol, १.९० g EGTA, और १.४६ g 2-एमिनो-2-(hydroxymethyl)-1, 3-propanediol (यानी, Tris) बेस एक स्वच्छ चोंच में द्वारा शुरू करो । जल के १.० एल जोड़ें । एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर BMB बफर के घटकों को मिलाएं । एक बार समाधान अच्छी तरह से मिलाया गया है, १.० एम एचसीएल का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें ।
  2. anesthetizing पशुओं से पहले 26% dextran (मेगावाट ७५,०००) समाधान (डब्ल्यू/वी) तैयार करें । निंन चरणों में बताए अनुसार dextran समाधान तैयार करें ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है इस समाधान तैयार करने के लिए समय से आगे है क्योंकि dextran ले जा सकते है लगभग 1.5-2 ज जलीय बफर में भंग करने के लिए ।
    1. एक साफ चोंच में पाउडर dextran (१०० मिलीलीटर बफर प्रति 26 ग्राम) बाहर वजन ।
    2. बाहर BMB के उचित मात्रा उपाय और एक अलग, स्वच्छ चोंच में बांटना ।
    3. धीरे से पाउडर dextran युक्त चोंच में BMB डालो. मैन्युअल रूप से एक गिलास हलचल रॉड का उपयोग BMB के घनघोर के दौरान पाउडर dextran मिश्रण.
    4. उपयोग करने के लिए तुरंत पहले १.० M HCl के साथ ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें ।
      नोट: 12 व्यक्तिगत Sprague-Dawley चूहों से मस्तिष्क microvessels का एक विशिष्ट अलगाव (पुरुष या महिला; 3 महीने की उम्र; 200-250 g प्रत्येक) की आवश्यकता है २०० मिलीलीटर की dextran समाधान (यानी, ५२ ग्राम dextran में २०० मिलीलीटर BMB) ।

2. Sprague-Dawley चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों का निष्कर्षण

  1. वांछित प्रयोगात्मक उपचार के बाद, anesthetize Sprague-Dawley चूहों ketamine का उपयोग (५० मिलीग्राम/kg; २.५ मिलीलीटर/केजी आईएफसआई) और xylazine (10 मिलीग्राम/एमएल; २.५ मिलीलीटर/ ketamine और xylazine ०.९% खारा में 20 मिलीग्राम/एमएल और ४.० मिलीग्राम/एमएल क्रमशः के अंतिम सांद्रता के लिए पतला । decapitation द्वारा Euthanize पशुओं IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार एक तेज गिलोटिन का उपयोग कर । पुरुष और महिला Sprague-Dawley चूहों दोनों के लिए एक ही प्रक्रिया का प्रयोग करें ।
  2. सर्जिकल कैंची का उपयोग कर एक सिंगल अनुप्रस्थ कट बनाकर चूहे की खोपड़ी से त्वचा को संप्रदाय किया जाए ।
  3. rongeurs का प्रयोग, ध्यान से खोपड़ी की थाली को हटाने और मस्तिष्क को बेनकाब ।
  4. एक रंग का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें । मस्तिष्क अलग और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अलग मस्तिष्क ऊतक जगह BMB के 5 मिलीलीटर युक्त । जोड़ें १.० μL का उपयोग करने के लिए तुरंत पहले BMB बफर की १.० मिलीलीटर प्रति चिढ़ाने अवरोधक कॉकटेल ।

3. ब्रेन प्रोसेसिंग

  1. ब्रेन टिशू को ५० एमएल शंकु ट्यूब से एक क्लीन पेट्री डिश में ट्रांसफर करें ।
  2. संदंश का प्रयोग, धीरे से १२.५ सेमी व्यास फिल्टर कागज पर मस्तिष्क रोल बाहरी मेनिन्जेस, जो शिथिल मस्तिष्क प्रांतस्था का पालन कर रहे है हटाने के लिए । धीरे फिल्टर कागज के खिलाफ मस्तिष्क ऊतक दबाएँ और ऊतक फिर से रोल. इस चरण के दौरान फ़िल्टर काग़ज़ अक्सर चालू करें ।
  3. संदंश का उपयोग कर सेरेब्रल गोलार्द्धों से रंजित जाल अलग.
    नोट: रंजित जाल एक स्पष्ट झिल्लीदार मस्तिष्क निलय की सतह के लिए स्थानीय ऊतक के रूप में प्रकट होता है ।
  4. धीरे मस्तिष्क ऊतक समतल और संदंश का उपयोग कर शेष मेनिन्जेस और घ्राण बल्ब हटा दें ।
  5. एक ठंडा कांच मोर्टार में cortical मस्तिष्क ऊतक रखें । मोर्टार करने के लिए BMB की ५.० मिलीलीटर युक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल जोड़ें ।
  6. एक उपरि शक्ति homogenizer का प्रयोग, homogenize मस्तिष्क ऊतक 15 अप और नीचे ३,७०० rpm पर स्ट्रोक का उपयोग कर । एक 10 मिलीलीटर मोर्टार और मूसल ऊतक चक्की का उपयोग कर homogenization प्रदर्शन । प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के homogenization के बीच, मूसल ७०% इथेनॉल का उपयोग कर साफ ।
    नोट: Homogenization स्ट्रोक गति और परिमाण के मामले में सुसंगत होना चाहिए ।
  7. लेबल केंद्रापसारक ट्यूबों में homogenate डालो ।

4. केंद्रापसारक कदम

  1. प्रत्येक लेबल वाले केंद्रापसारक ट्यूब मस्तिष्क homogenate युक्त 26% dextran समाधान के ८.० मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. दो बार ट्यूब पलटना और फिर अच्छी तरह से नमूना भंवर । 26% dextran समाधान के साथ मस्तिष्क homogenate समाधान का एक पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कई कोणों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के भंवर आचरण ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ५,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
    नोट: कुछ विश्लेषण के लिए, यह मस्तिष्क पैरेन्काइमा के साथ मस्तिष्क microvessels तुलना करने के लिए उपयोगी है. मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रोटीन अभिव्यक्ति के आकलन की आवश्यकता होना चाहिए, इस केंद्रापसारक कदम से supernatant (यानी, मस्तिष्क parenchymal अंश) एकत्र किया जा सकता है और भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  4. एक वैक्यूम aspirator और ग् पाश्चर पिपेट का प्रयोग कर supernatant को हटा दें ।
    नोट: सावधानी गोली परेशान नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए । अंयथा, मस्तिष्क microvessels एकत्र की मात्रा कम हो जाएगा, जो काफी इस प्रक्रिया से प्रोटीन की उपज में कमी आएगी ।
  5. BMB के ५.० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड से युक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल (यानी, १.० μL BMB बफर के १.० मिलीलीटर प्रति चिढ़ाना कॉकटेल) । भंवर गोली पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
  6. इस प्रोटोकॉल के चरण 4.1-4.2 में वर्णित के रूप में प्रत्येक केंद्रापसारक ट्यूब और भंवर के लिए 26% dextran की ८.० मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ५,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  8. एक वैक्यूम कुप्पी और ग्लास पिपेट का उपयोग करना, महाप्राण supernatant और सुनिश्चित करें कि गोली मस्तिष्क microvessel युक्त है बाधित नहीं है ।
    नोट: अतिरिक्त सामग्री है कि ट्यूब दीवार का पालन किया है microvessels शामिल नहीं है और सावधानी से साफ और हटा दिया जाना चाहिए ।
  9. दोहराएं चरण ४.५ के माध्यम से ४.८ एक अतिरिक्त दो बार ।
  10. एक बार 4 dextran केंद्रापसारक कदम पूरा कर लिया गया है, BMB के प्रत्येक गोली और भंवर को ५.० मिलीलीटर जोड़ने के लिए नमूने reसस्पेंड ।
    नोट: ४.१० कदम के पूरा होने के बाद, पूरे microvessels प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है । यह पुनः के एक ५० μL aliquot-निलंबित microvessel गोली और एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर धब्बा लेने के द्वारा पूरा किया जा सकता है । Microvessels रहे है तो गर्मी-९५ ° c पर तय 10 मिनट के लिए एक हीटिंग बर्फ में निर्धारण के बाद ब्लॉक पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ठंड इथेनॉल । स्लाइड तब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है इमेजिंग अध्ययन के लिए आवश्यक है ।

5. Ultracentrifugation कुल ब्रेन Microvascular झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए

  1. ठंडा गिलास homogenizer के लिए स्थानांतरण नमूने ।
  2. एक उपरि शक्ति homogenizer का उपयोग करना, homogenize मस्तिष्क ऊतक ३,००० rpm पर 8-10 अप और डाउन स्ट्रोक का उपयोग कर । Homogenization एक 10 मिलीलीटर मोर्टार और मूसल ऊतक चक्की का उपयोग कर आयोजित किया जाता है । साफ मूसल का प्रयोग ७०% प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के homogenization निंनलिखित इथेनॉल ।
  3. ultracentrifuge ट्यूबों को साफ करने के लिए नमूने स्थानांतरण । संख्या और प्रत्येक व्यक्तिगत ट्यूब तौलना । संतुलन और ट्यूबों ultracentrifuge रोटर में लदान से पहले जोड़ी ।
    नोट: सभी वजन और ultracentrifuge ट्यूबों के बाँधना पर टोपियां के साथ आयोजित किया जाना चाहिए ट्यूब वजन की सही माप सुनिश्चित करने के लिए.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए १५०,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  5. एक वैक्यूम कुप्पी और ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, महाप्राण केशिका झिल्ली गोली बाधित करने के लिए नहीं देखभाल का उपयोग supernatant ।
  6. गोली के आकार के आधार पर, भंडारण बफर, जो एक 1:1 (v/v) अनुपात में जल और BMB के शामिल है की एक उपयुक्त मात्रा में जोड़ें । सामांयतया, छर्रों 400-500 μL संग्रह बफ़र में reसस्पैंड कर रहे हैं । भंडारण बफर के १.० मिलीलीटर प्रति १.० μL के अनुपात में भंडारण बफर करने के लिए छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल जोड़ें ।
  7. भंवर नमूने भंडारण बफर में गोली reसस्पेंड करने के लिए ।
  8. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, एक लेबल १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए केशिका झिल्ली के नमूने हस्तांतरण ।
  9. नमूना अच्छी तरह से मिलाया जाता है सुनिश्चित करने के लिए एक सुई सिरिंज 5x के माध्यम से पास और कोई सेलुलर समुच्चय मौजूद है कि.
  10. नमूनों पर-८० ° c विश्लेषण के लिए आवश्यक तक स्टोर ।
    नोट: प्रत्येक microvessel झिल्ली नमूने के प्रोटीन सामग्री ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग कर मापा जाता है ।

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Representative Results

चूहे मस्तिष्क microvessels के अलगाव के लिए प्रयोगात्मक प्रवाह और microvessel झिल्ली के नमूनों की तैयारी के लिए चित्रा 1में दिखाया गया है । यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का प्रयोग, चूहे मस्तिष्क से बरकरार microvessels के सफल अलगाव (चित्रा 2a) का प्रदर्शन किया है । इन जहाजों dextran के साथ केंद्रापसारक के पूरा होने के बाद प्राप्त की और तुरंत शुरू ultracentrifugation से पहले झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए (यानी, ४.१० कदम के पूरा होने के बाद) थे । इस छवि में, microvessel Oatp1a4, एक ट्रांसपोर्टर है कि अच्छी तरह से मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं2,11,13के प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त किया जा दिखाया गया है के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग दाग है, 18. पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 2 बी) का उपयोग करना, मादा Sprague से काटा microvessels से झिल्ली की तैयारी-Dawley चूहों को दिखाया गया प्लेटलेट endothelial कोशिका आसंजन अणु-1 में समृद्ध (PECAM-1; भी CD31 के रूप में जाना जाता है), के लिए एक मार्कर प्रोटीन ब्रेन microvasculature. PECAM-1 एक निरोधात्मक सह रिसेप्टर टी में शामिल सेल और बी-सेल संकेत है कि अत्यधिक संवहनी endothelial कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त की है । इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, PECAM संवर्धन झिल्ली नमूने दो और चार dextran केंद्रापसारक कदम का उपयोग कर तैयार में मनाया गया । जैसा चित्र bमें दिखाया गया है, इन विभिंन केंद्रापसारक चरणों का उपयोग कर तैयार नमूनों के बीच PECAM अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं था; हालांकि, चार dextran स्पिन endothelial परिवहन प्रोटीन की अभिव्यक्ति में सुधार के परिणामस्वरूप, जो नमूनों में सुधार microvessel संवर्धन इंगित करता है । इसके अतिरिक्त, चार dextrans का उपयोग अवांछित सेलुलर घटकों को हटाने में सुधार के रूप में इस तरह के synaptophysin18के रूप में ंयूरॉंस मार्कर प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति द्वारा संकेत spins । इसलिए, मस्तिष्क microvessel झिल्ली के लिए सभी बाद की तैयारी चार dextran केंद्रापसारक कदम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । हमारे पश्चिमी ब्लाट प्रयोगों में, microtubule घटक प्रोटीन tubulin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । के रूप में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित, झिल्ली की तैयारी आम तौर पर ५.० मिलीग्राम/एमएल और १०.० मिलीग्राम/एमएल के बीच लेकर प्रोटीन सांद्रता उपज । प्रतिनिधि प्रोटीन ठहराव परिणाम तालिका 1में चित्रित कर रहे हैं । इन प्रोटीन मूल्यों एक मानक वक्र है कि गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA; २.० मिलीग्राम/एमएल) मानक के रूप में (चित्रा 3) का उपयोग कर उत्पंन किया गया था के आधार पर निर्धारित किया गया । प्रोटीन नमूने ब्रैडफोर्ड परख में 10 गुना पतला थे ।

प्रोटीन ठहराव के बाद, microvessel झिल्ली के नमूनों में पश्चिमी दाग विश्लेषण, डॉट दाग, या सह-immunoprecipitation जैसे प्रोटीन विश्लेषण के लिए जैव रासायनिक तरीकों के लिए उपयोग किया जा सकता है । चित्रा 4a BBB परिवहन प्रोटीन ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर-1 (भरमार-1) जहां 1 तालिका से नमूनों का विश्लेषण किया गया के लिए एक प्रतिनिधि पश्चिमी दाग को दर्शाया गया है । स्पष्ट उचित आणविक वजन पर एकल बैंड (यानी, ५४ केडीए होने की भविष्यवाणी) के लिए यह अत्यधिक व्यक्त BBB प्रोटीन प्रत्येक झिल्ली नमूने में पाया गया । इस पश्चिमी दाग में प्रत्येक व्यक्ति लेन microvessel झिल्ली एक भी प्रयोगात्मक पशु से तैयार नमूना का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक लेन में बराबर प्रोटीन सोडियम-पोटेशियम ATPase का उपयोग कर निर्धारित किया गया था (यानी, Na+/K+ ATPase; अनुमानित आणविक भार = ११३ केडीए) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में. के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, भरमार की उच्च अभिव्यक्ति-1 BBB में पुरुष चूहों में मनाया गया के रूप में उनकी महिला समकक्षों की तुलना में । ना+/K+ ATPase की अभिव्यक्ति में कोई अंतर पुरुष और मादा जानवरों के बीच मनाया गया. इस densitometric विश्लेषण के लिए, बैंड ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग quantitated थे ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल की रूपरेखा चूहे मस्तिष्क microvessels को अलग करने और झिल्ली के नमूने तैयार करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बरकरार microvessel और एक संवहनी endothelial सेल मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति दिखा प्रतिनिधि डेटा. क: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला Oatp1a4, एक ट्रांसपोर्टर है कि अच्छी तरह से BBB पर व्यक्त किया जा दिखाया गया है के स्थानीयकरण दिखाया, एक बरकरार मस्तिष्क में इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अलग microvessel । Oatp1a4 स्थानीयकरण 1:10 के एक कमजोर पड़ने पर Oatp1a4 के खिलाफ एक विशिष्ट खरगोश polyclonal एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया । माध्यमिक एंटीबॉडी एक फ्लोरोसेंट संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी कि 1:300 के एक कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार = ७.५ माइक्रोन । B: पश्चिमी दाग विश्लेषण विशिष्ट endothelial सेल मार्कर प्रोटीन PECAM-1 है, जो एक 1:100 कमजोर पड़ने पर एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया था के संवर्धन दिखाकर microvessel नमूनों की पवित्रता का प्रदर्शन किया । माध्यमिक एंटीबॉडी एक विरोधी माउस आईजीजी था पर एक 1:50000 कमजोर पड़ने । BH = ब्रेन homogenate, MV = क्रूड microvessel अंश, MVM = ब्रेन microvessel झिल्ली. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के लिए एक प्रतिनिधि मानक वक्र । गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था और निम्नलिखित सांद्रता करने के लिए पतला था: 0, ०.१२५, ०.२५, ०.५०, ०.७५, १.०, १.५, और २.० मिलीग्राम/ अवशोषक = ५९५ एनएम में मापा गया था । प्रत्येक डेटा बिंदु BSA एकाग्रता प्रति तीन अवशोषक रीडिंग के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि पश्चिमी दाग में सेक्स मतभेदों को दिखा-झिल्ली अलग चूहे मस्तिष्क Microvessels से तैयार नमूने में 1 अभिव्यक्ति । एक: पश्चिमी दाग विश्लेषण भरमार की अभिव्यक्ति से पता चलता है-झिल्ली में पुरुष और महिला Sprague-Dawley चूहों से पृथक microvessel से तैयार नमूनों में 1 । भरमार-1 एक 1:500 कमजोर पड़ने पर एक खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया था । माध्यमिक एंटीबॉडी एक मोनोक्लोनल विरोधी खरगोश आईजीजी पर एक 1:40000 कमजोर पड़ने था । Na=/K+ ATPase, एक प्लाज्मा झिल्ली मार्कर, और लोड हो रहा है नियंत्रण, एक polyclonal विरोधी खरगोश आईजीजी का उपयोग कर पाया गया था एक 1:४०,००० कमजोर पड़ने पर. B: Densitometric की भरमार-1 अभिव्यक्ति की झिल्ली नमूने में पुरुष और महिला Sprague-Dawley चूहों से पृथक । परिणाम उपचार समूह प्रति 6 प्रयोगात्मक पशुओं से SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । तारांकन नियंत्रण से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा बिंदुओं को इंगित करता है । p < ०.०५ के मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पशु औसत अवशोषक समायोजित अवशोषक गणना एकाग्रता वास्तविक एकाग्रता
(λ = ५९५ एनएम) (mg/एमएल) (mg/एमएल)
पुरुष 1 ०.७९६७ ०.३८५९ ०.७६८ ७.६८
पुरुष 2 ०.७८४९ ०.३७४१ ०.७४१७ ७.४२
पुरुष 3 ०.८१८७ ०.४०७९ ०.८१७३ ८.१७
पुरुष 4 ०.७९८५ ०.३८७७ ०.७७२१ ७.७२
पुरुष 5 ०.७९४३ ०.३८३५ ०.७६२८ ७.६३
पुरुष 6 ०.७२५१ ०.३१४३ ०.६०८४ ६.०८
महिला 1 ०.७११४ ०.३००६ ०.५७८ ५.७८
महिला 2 ०.७९९३ ०.३८८५ ०.७७३८ ७.७४
महिला 3 ०.८२०१ ०.४०९३ ०.८२०३ ८.२
महिला 4 ०.७५२६ ०.३४१८ ०.६६९८ ६.७
महिला 5 ०.८००८ ०.३९ ०.७७७३ ७.७७
महिला 6 ०.७९७५ ०.३८६७ ०.७७ ७.७

तालिका 1: प्रतिनिधि मस्तिष्क Microvessel की तैयारी से प्रोटीन सांद्रता पुरुष और महिला Sprague-Dawley चूहों से व्युत्पंन । समायोजित अवशोषक मूल्यों प्रत्येक प्रयोगात्मक पशु के लिए औसत अवशोषक मूल्यों से एल = ५९५ एनएम पर पृष्ठभूमि अवशोषण घटाकर द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । इस परख में, पृष्ठभूमि अवशोषक ०.४१०८ होना निर्धारित किया गया था ।

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Discussion

इस लेख में, microvessels से झिल्ली प्रोटीन नमूने तैयार करने का एक सरल और प्रभावी तरीका हौसले से अलग चूहे मस्तिष्क ऊतक से पृथक वर्णित है । चूहे के अलगाव के लिए कई दृष्टिकोण मस्तिष्क microvessels और/या अलग microvasculature से झिल्ली तैयार करने की पीढ़ी के साहित्य में रिपोर्ट किया गया है13,20,21,22 , 24. हालांकि microvessel आइसोलेशन प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित सिद्धांत में समान है, इस दृष्टिकोण एक प्रयोगात्मक पशु से उत्कृष्ट प्रोटीन उपज के साथ झिल्ली के नमूनों की तैयारी को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया है । इस अग्रिम के लिए प्रोटीन विश्लेषण के लिए विभिंन तरीकों में उपयोग के लिए संतोषजनक प्रोटीन संवर्धन के साथ नमूने प्राप्त करने के क्रम में कम से microvessels तीन Sprague-Dawley चूहों से पूल के लिए जरूरत समाप्त हो गया है । इस तरह के तरीकों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, पश्चिमी दाग विश्लेषण, डॉट दाग, और सह immunoprecipitation । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई प्रयोगात्मक पशुओं से microvessels पूलिंग का अभ्यास एक एकल नमूना उत्पंन करने के लिए बहुत अंतर समूह परिवर्तनशीलता कम कर देता है । इस हद तक, microvessel पूलिंग कम फैल कि प्रयोगात्मक पशुओं की आबादी में मनाया प्रोटीन अभिव्यक्ति में सही परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है के साथ डेटा में परिणाम कर सकते हैं । नमूने के बाद से एक प्रयोगात्मक पशुओं से तैयार किया जा सकता है, एक अध्ययन जनसंख्या की सही परिवर्तनशीलता पर कब्जा कर लिया है, जो प्रयोगात्मक डेटा के लिए अनुमति देता है प्राप्त किया जा करने के लिए कि pathophysiological या औषधीय प्रक्रिया के तहत अधिक प्रतिनिधि है परीक्षा. एक अतिरिक्त लाभ यह है कि microvessel झिल्ली के नमूनों प्रयोगात्मक पशुओं की एक कम संख्या का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है ।

शायद इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में सबसे महत्वपूर्ण विचार के केंद्रापसारक कदम शामिल है । वास्तव में, उनके आयु, निर्माता, और/या समग्र स्थिति और अखंडता के कारण प्रयोगशालाओं के बीच अलग कर सकते हैं । यह स्पिन से स्पिन करने के लिए वास्तविक g स्तर (या rpm स्तर) में महत्वपूर्ण बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । नमूना अखंडता में इस भिन्नता की भूमिका एक ही समय में एक ही रोटर में एक साथ एक तुलनात्मक विश्लेषण में सभी नमूनों की केंद्रापसारक से कम किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यदि एक रोटर नमूना ट्यूबों के लिए केवल बारह उपलब्ध स्लॉट है, तो अलगाव और एक व्यक्तिगत प्रयोग में microvessel नमूनों की तैयारी बारह तक ही सीमित हो जाएगा । यह विचार है कि तैयार नमूनों तुलनीय गुणवत्ता के है और प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतलब प्रोटीन अभिव्यक्ति में किसी भी परिवर्तनशीलता इलाज की स्थिति के लिए ही सौंपा जा सकता है कि यह सुनिश्चित करता है ।

एक अतिरिक्त विचार के 26% dextran समाधान है, जो अंतर केंद्रापसारक के माध्यम से मस्तिष्क microvessels और मस्तिष्क parenchymal ऊतक की जुदाई के लिए आवश्यक है की तैयारी शामिल है । Dextran α-1, 6-लिंक्ड इकाइयों की एक व्यापकता के साथ एक ग्लूकोज बहुलक है और आम तौर पर एक रैखिक संरचना25के पास । यह भी एक उच्च जल बाध्यकारी क्षमता है । उदाहरण के लिए, dextran ७५ के 1 जी (यानी, ७५,००० दा के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है की एक मतलब आणविक वजन के साथ dextran) पानी की लगभग 20-25 मिलीलीटर बरकरार रखती है । dextran का यह गुण जलीय बफर में पाउडर भंग करने में गहन चुनौतियों का कारण बन सकता है । जलीय घुलनशीलता ४० डिग्री सेल्सियस के एक अधिकतम तापमान के लिए dextran समाधान हीटिंग द्वारा सुधार किया जा सकता है । हीटिंग पर, बहुलक पानी के अणुओं के साथ कम सूचना का आदान प्रदान, जिससे dextran एक कम विस्तारित अनुरूप अपनाने के लिए पैदा (यानी, पानी प्रतिधारण के कम डिग्री) समाधान में । उच्च तापमान करने के लिए हीटिंग dextran बहुलक को तोड़ने के लिए कारण होगा और, इसलिए, यह एक अलग एजेंट के रूप में अप्रभावी हो जाएगा । इसके अतिरिक्त, यह आवश्यक है कि dextran समाधान के पीएच ७.४ तुरंत उपयोग करने से पहले समायोजित किया जा । 26% dextran के समाधान महत्वपूर्ण पीएच बदलाव का अनुभव कर सकते हैं, यहां तक कि तैयारी के बाद 1-2 घंटे से अधिक । इन बातों के कारण, 26% dextran समाधान प्रयोग के दिन पर तैयार किया जाना चाहिए, लेकिन मस्तिष्क ऊतक के अलगाव से पहले पर्याप्त समय के साथ विघटन और पीएच के उचित समायोजन के लिए अनुमति देने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा microvessel तैयारी में neurovascular इकाई (NVU) के अंय प्रकार के सेल की उपस्थिति शामिल है । endothelial कोशिकाओं के अलावा, NVU glial कोशिकाओं (यानी, astrocytes, microglia), pericytes, और न्यूरॉन्स 3,26,27सहित विभिन्न सेलुलर घटकों के शामिल है. microvessels का अलगाव कुतर मस्तिष्क से आम तौर पर संवहनी endothelial कोशिकाओं के साथ संवर्धन से पता चलता है; हालांकि, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), एक स्थापित astrocyte मार्कर की अभिव्यक्ति के साथ ही न्यूरॉन मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति भी मनाया जाता है । इसके अतिरिक्त, pericytes संवहनी endothelium के साथ उनके अंतरंग सहयोग के कारण नमूना तैयारियों में मौजूद हैं । वर्तमान में, यह लगभग असंभव है प्रयोगात्मक पशुओं से मस्तिष्क microvessels को अलग करने और सभी pericytes, न्यूरॉन्स, और astrocytes को खत्म करने के लिए. हालांकि, इस प्रोटोकॉल कई केंद्रापसारक कदम के माध्यम से उंनत किया गया है ताकि नमूनों endothelial कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे है (यानी, के रूप में PECAM की अभिव्यक्ति में सुधार के द्वारा संकेत-1 प्रत्येक केंद्रापसारक कदम निंनलिखित) अंय प्रकार के सेल की सीमित उपस्थिति के साथ ( यानी, के रूप में ंयूरॉंस मार्कर प्रोटीन synaptophysin-1 के कम अभिव्यक्ति द्वारा संकेत प्रत्येक केंद्रापसारक कदम निंनलिखित) ।

कुल मिलाकर, चूहे मस्तिष्क microvessels के अलगाव के लिए इस दृष्टिकोण और झिल्ली के नमूनों की तैयारी के लिए pathophysiological या औषधीय स्थितियों के तहत BBB प्रोटीन का अध्ययन करने में रुचि के साथ किसी भी प्रयोगशाला में अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल microvessel नमूने है कि दवा परिवहन प्रोटीन है कि BBB2,18पर व्यक्त endogenously है के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता प्रदान करता है । इस दृष्टिकोण की मजबूती औषधीय उत्तेजनाओं, प्रयोगात्मक डेटा कि BBB में ट्रांसपोर्टर समारोह और विनियमन का आकलन करने के लिए कठोर अध्ययन के डिजाइन सूचित किया है के जवाब में Oatp1a4 में असतत परिवर्तन का अवलोकन सक्षम है । ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल भी शारीरिक स्थितियों के तहत BBB को समझने के प्रयास में तंग जंक्शन प्रोटीन और adherens जंक्शन प्रोटीन के प्रोटीन विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है और pathophysiological के जवाब में BBB अखंडता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए और औषधीय तनाव । जाहिर है, इस प्रोटोकॉल BBB क्षेत्र में कई अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इसलिए, एक सरल अभी तक मजबूत और reproducible विधि है कि BBB अध्ययन में शामिल किया जा सकता है प्रोटीन विश्लेषण की आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (R01-NS084941) और एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (ADHS16-162406) PTR करने के लिए । WA स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान (T32-HL007249) के एक राष्ट्रीय संस्थानों को पूर्व डॉक्टरेट नियुक्ति से पिछले समर्थन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich #P8340 Component of brain microvessel buffer
D-mannitol Sigma-Aldrich #M4125 Component of brain microvessel buffer
EGTA Sigma-Aldrich #E3889 Component of brain microvessel buffer
Trizma Base Sigma-Aldrich #T1503 Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000) Spectrum Chemical Mftg Corp #DE125 Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine MWI Animal Health #501072 General anesthetic
Xylazine Western Medical Supply #5530 General anesthetic
0.9% saline solution Western Medical Supply N/A General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter) VWR #28320-100 Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes Sarstedt #60.540.386 Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay ThermoFisher Scientific #23236 Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer DWK Life Sciences #903475 Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder DWK Life Sciences #358039 Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich #H1758 Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific #23210 Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps Fine Science Tools #91100-12 Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools #16020-14 Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific #352070 Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets ThermoFisher Scientific #13-678-20C Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous Sigma-Aldrich #459836 Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter #41121703 Used for ultracentrifugation of samples

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References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
  3. Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
  4. Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
  5. McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
  6. Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
  7. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  8. Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
  9. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  10. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  11. Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
  12. Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
  13. Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
  14. Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
  15. Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
  16. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  17. Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
  18. Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
  19. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  20. Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
  21. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
  22. McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
  23. Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
  24. Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
  25. Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
  26. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  27. Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).

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Brzica, H., Abdullahi, W., Reilly, B. G., Ronaldson, P. T. A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels. J. Vis. Exp. (135), e57698, doi:10.3791/57698 (2018).

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