Summary
Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.
Abstract
Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.
Introduction
Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS1zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es einige Substanzen in Anwesenheit von ermöglichen gleichzeitig sicherstellen, dass potenziell schädliche XENOBIOTIKA können nicht zugreifen akkumulieren. In der Tat Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen sind nicht gefenstert und begrenzten Pinozytose, sorgt für einen Mangel an nicht-selektive Durchlässigkeit2weisen. Darüber hinaus äußern Gehirn kapilläre Endothelzellen engen Kreuzung und Adherens Junction Proteine, die handeln in Form eine körperlichen "Siegel" zwischen benachbarten endothelial Zellen und parazellulär Diffusion von Blut übertragbare Substanzen ins Gehirn stark einschränken Parenchym. In der Tat erfordert selektive Durchlässigkeit der endogene und exogene Stoffe funktionelle Expression von Aufnahme und Efflux-Transporter3. Insgesamt, engen Kreuzungen, Adherens Junctions und Transportern arbeiten gemeinsam, um die einzigartige Barriereeigenschaften der BBB zu pflegen.
Die BBB ist eine dynamische Barriere, die auf physiologischen, pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Z. B. Hypoxie/flussbettfilters Stress erwiesenermaßen modulieren Ausdruck der kritischen tight Junction-Proteine (z.B. occludin, Zonulae Occluden-1 (ZO-1)), die erhöhte parazellulär Durchlässigkeit für solche vaskuläre Marker zugeordnet ist als Saccharose4,5,6. Ähnliche Beobachtungen wurden an der BBB in der Umgebung von Schädel-Hirn-Verletzung-7 und peripheren entzündliche Schmerzen8,9. Diese gleichen Krankheiten können auch Transportmechanismen an der BBB10,11,12,13,14modulieren. In der Tat, Hypoxie/flussbettfilters Verletzungen verbessert funktionelle Expression von Bio Anion Transport Polypeptid 1a4 (Oatp1a4) an der BBB führen kann zu einem signifikanten Anstieg in der Blut-Hirn-Transport von bestimmten Oatp Transport Substrate wie Taurocholate und Atorvastatin13. BBB-Eigenschaften können auch durch Pharmakotherapie selbst, einen Mechanismus geändert werden, die eine Grundlage für beide tief greifende Veränderungen in der Wirksamkeit der Droge im Gehirn und Wechselwirkungen bilden können. Z.B. Paracetamol Ziele nuklearen Rezeptoren Signalisierung Mechanismen im Gehirn der mikrovaskuläre Endothelzellen, erhöht die funktionelle Expression der kritischen Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-Gp), und ändert zeitabhängige Analgesie Übertragen von Morphin, transportieren ein opioid-Analgetikum und etablierten P-Gp Substrat15. Ein gründliches Verständnis der BBB-Änderungen, die durch Krankheiten oder durch Drogen induziert werden kann, erfordert auch die Identifizierung und Charakterisierung der spezifischen regulatorischen Mechanismen, die diese Änderungen zu kontrollieren. In der Tat, diskrete Signalwege wurden im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, die Steuern, die molekulare Ausdruck der engen Kreuzung Proteine16,17 und Transporter15, 18,19. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass komplexe Molekulare Signalwege in der Verordnung von BBB tight Junctions und Transporter in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind.
Eine große Herausforderung in der Studie der BBB ist die absolute Voraussetzung für eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren und anschließende Aufbereitung der Membran Proben abgeleitet. Diese Proben müssen vorbereitet werden, so dass sie sowohl im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen angereichert und in Anwesenheit von anderen Zelltypen begrenzt. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Microvasculature von Nagetier Gehirn in der wissenschaftlichen Literatur13,20,21,22beschrieben. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, robuste, und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus rattengehirn und zur Vorbereitung von endothelialen Membran angereicherten Proben, die für die Analyse der Proteinexpression verwendet werden können. Vorteil dieses Protokolls kapilläre Isolierung ist die Fähigkeit, eine einzelne Versuchstier Probe Vorbereitungen von hoher Qualität und mit ausreichend Proteinausbeute einzuholen. Dies ermöglicht die Berücksichtigung der Inter Tier Variabilität der Proteinexpression. Solch ein Fortschritt in diesem Protokoll hat die Robustheit des BBB Studien erheblich verbessert, weil Überbewertung oder Unterbewertung das wahre Ausmaß der Protein Veränderungen an der BBB jetzt vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme von mehreren Schritten der Zentrifugation mit Dextran verbesserte Anreicherung von mikrogefäßen im experimentellen Proben und erleichtert die Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie Neuronen.
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Protocol
Alle unten beschriebene Verfahren durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und entsprechen den National Institutes of Health (NIH) und Animal Research: In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien zum Berichten. Der verfahrenstechnische Ablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Set-up für das Verfahren
- Bereiten Sie den Gehirn kapilläre Puffer (BMB). Starten Sie durch mit einem Gewicht von 54,66 g D-Mannit, 1,90 g EGTA und 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d. h. Tris) Basis in ein sauberes Becherglas. 1,0 L entionisiertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie die Komponenten des Puffers BMB mit einem Magnetrührer. Sobald die Lösung gründlich vermischt worden ist, passen Sie den pH auf 7,4 mit 1,0 M HCl.
- Bereiten Sie 26 % Dextran (75.000 MW) Lösung (w/V) vor der Tiere zu betäuben. Bereiten Sie die Dextran-Lösung, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Lösung vor der Zeit vorzubereiten, da Dextran aufzulösen in wässrigen Puffer ca. 1,5-2 h dauern kann.- Die pulverförmigen Dextran (26 g pro 100 mL Puffer) in ein sauberes Becherglas abwiegen.
- Das entsprechende Volumen der BMB abmessen und in eine separate, sauberes Becherglas zu verzichten.
- Gießen Sie langsam BMB in das Becherglas mit pulverförmigen Dextran. Manuell mischen Sie die pulverisierte Dextran in Gießen von BMB mit einem Glasstab umrühren.
- Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 1,0 M HCl unmittelbar vor, zu verwenden.
Hinweis: Eine typische Isolation des Gehirns mikrogefäßen aus 12 einzelnen Sprague-Dawley Ratten (männlich oder weiblich; 3 Monate alt, 200-250 g) 200 mL Dextran-Lösung (d. h. 52 g Dextran in 200 mL BMB) erfordert.
2. Gewinnung von Hirngewebe aus Sprague-Dawley Ratten
- Nach der gewünschten experimentelle Behandlung betäuben Sprague-Dawley Ratten mit Ketamin (50 mg/kg; 2,5 mL/kg kg i.p.) und Xylazin (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in 0,9 % Kochsalzlösung zur endgültigen Konzentrationen von 20 mg/mL und 4,0 mg/mL bzw.. Einschläfern von Tieren durch Enthauptung mit einem geschärften Guillotine nach IACUC Richtlinien. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für sowohl weibliche als auch männliche Sprague-Dawley Ratten.
- Resezieren Sie die Haut von der Ratte-Schädel mit einem quer-Schnitt mit einer chirurgischen Schere.
- Mit Rongeurs, sorgfältig entfernen Sie die schädelplatte und setzen Sie des Gehirns aus.
- Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spachtel. Lösen Sie das Großhirn und legen Sie das isolierte Hirngewebe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL der BMB. Fügen Sie 1,0 μL der Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer unmittelbar vor Gebrauch.
(3) Gehirn Verarbeitung
- Übertragen Sie das Hirngewebe aus dem 50 mL konische Röhrchen auf eine saubere Petrischale.
- Rollen Sie mit Pinzette, vorsichtig das Gehirn auf 12,5 cm Durchmesser Filterpapier äußeren Hirnhaut zu entfernen, die Lose der Großhirnrinde eingehalten werden. Sanft drücken Sie das Hirngewebe gegen Filterpapier und Rollen Sie das Gewebe wieder. Schalten Sie das Filterpapier häufig während dieser Schritt.
- Der zerebralen Hemisphären mit Pinzette trennen Sie choroid Plexus.
Hinweis: Das choroid Plexus erscheint als eine klare häutigen Gewebe an die Oberfläche der zerebralen Ventrikel lokalisiert. - Sanft glätten Sie das Hirngewebe und entfernen Sie verbleibenden Meningen und olfaktorischen Birnen mit Pinzette.
- Legen Sie die kortikalen Hirngewebe in ein gekühltes Glas-Mörtel. Der Mörtel 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.
- Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.700 u/min. Führen Sie Homogenisierung mit 10 mL Mörser und Stößel-Gewebe-Mahlwerk. Zwischen jeder einzelnen Probe Homogenisierung reinigen Sie die Stößel mit 70 % Ethanol.
Hinweis: Homogenisierung Striche in Bezug auf Tempo entsprechen müssen und Größenordnung. - Gießen Sie das Homogenat in beschrifteten Zentrifuge Röhren.
4. Zentrifugation Schritte
- Jede beschriftete Zentrifugenröhrchen mit Gehirn Homogenat fügen Sie 8,0 mL 26 % Dextran-Lösung hinzu.
- Invertieren die Röhre zweimal und dann gründlich Wirbel der Probe. Führen Sie den Vortexen jeder Probe mit mehreren Winkeln, gewährleisten eine gute Durchmischung des Gehirns Homogenat Lösung mit 26 % Dextran-Lösung.
- Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
Hinweis: Für einige Analysen ist es sinnvoll, Gehirn mikrogefäßen mit in Anwesenheit von vergleichen. Die Beurteilung der Proteinexpression in Anwesenheit von sein sollte kann erforderlich, überstand aus dieser Zentrifugationsschritt (z. B. Gehirn parenchymatösen Bruch) werden gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert. - Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Glas Pasteurpipette.
Hinweis: Vorsicht muss genommen werden, um die Pellets nicht zu stören. Andernfalls wird Menge an das Gehirn mikrogefäßen gesammelt die verringert deutlich der Proteinausbeute aus diesem Verfahren reduziert werden. - Das Pellet in 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail (d. h. 1,0 μl Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer) aufzuwirbeln. Wirbel der Pellet um gute Durchmischung zu gewährleisten.
- 8,0 mL 26 % Dextran hinzu kommen jedem Zentrifugenröhrchen und Wirbel wie 4.1-4.2 dieses Protokolls beschrieben.
- Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
- Mit einer Thermoskanne und Glaspipette, Aspirieren überstand und stellen Sie sicher, dass Pellet mit Gehirn kapilläre nicht gestört wird.
Hinweis: Überschüssige Material, das an der Rohrwand gehalten hat mikrogefäßen nicht enthalten und sollten sorgfältig gereinigt und entfernt. - Wiederholen Sie Schritte 4,5 bis 4,8 eine zusätzliche zwei Mal.
- Einmal 4 Dextran Zentrifugation Schritte abgeschlossen wurden, 5,0 mL BMB zu jeder Pellet und Wirbel um die Probe erneut hinzufügen.
Hinweis: Nach Abschluss von Schritt 4.10, können ganze mikrogefäßen für Analyse von Protein-Lokalisierung gesammelt werden. Dies kann erreicht werden, indem man eine 50 μL aliquoten neu suspendierten kapilläre Pellet und Verschmieren auf einen Glas-Objektträger. Mikrogefäßen sind dann Hitze fixiert, bei 95 ° C für 10 min auf einem Heizblock gefolgt von Fixierung in eiskaltem Ethanol für eine zusätzliche 10 min. Rutschen dann bei 4 ° C bis zur bildgebenden Verfahren erforderlich gespeichert werden können.
5. Ultrazentrifugation, Proben von insgesamt mikrovaskuläre Hirnhäute vorzubereiten
- Übertragen Sie Proben auf den gekühlten Glas-Homogenisator.
- Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie Hirngewebe mit 8-10 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.000 u/min. Homogenisierung erfolgt mittels einer 10 mL-Mörser und Stößel Gewebe-Schleifmaschine. Reinigen Sie den Stößel mit 70 % Ethanol nach Homogenisierung jeder einzelnen Probe.
- Übertragen Sie Proben Ultrazentrifugen Rohre zu reinigen. Nummer und wiegen jedes einzelne Rohr. Auszugleichen und die Rohre vor der Verladung in den Ultrazentrifugen Rotor zu koppeln.
Hinweis: Alle wiegen und Paarung von Ultrazentrifugen Rohre müssen mit den Kappen auf durchgeführt werden um genaue Messung der Röhre Gewichte zu gewährleisten. - Zentrifuge Proben bei 150.000 X g für 1 h bei 4 ° C.
- Mit einer Thermoskanne und Glas Pasteurpipette, Aspirieren überstand mit sorgen die Kapillare Membran Pellet zu stören.
- Basierend auf der Größe der Pellets, fügen Sie eine entsprechende Volumen der Puffer speichern, die im Verhältnis 1:1 (V/V) von entionisiertem Wasser und BMB besteht. Pellets sind in der Regel in 400-500 μL der Puffer speichern Nukleinsäuretablette. Der Speicher-Puffer in einem Verhältnis von 1,0 μl pro 1,0 mL Puffer speichern Protease Inhibitor Cocktail hinzufügen.
- Vortex Proben zu Pellets im Puffer speichern aufzuwirbeln.
- Mit ein Glas Pasteurpipette übertragen Sie Kapillare Membran Proben zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
- Pass-Probe durch eine Nadel Spritze 5 X, damit die Probe gut durchmischt ist und keine zelluläre Aggregate vorhanden sind.
- Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Analyse erforderlich.
Hinweis: Proteingehalt der Samples kapilläre Membran bemisst sich nach der Methode von Bradford.
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Representative Results
Der experimentelle Fluss zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Probenpräparation kapilläre Membran ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der hier vorgestellten Verfahren erfolgreich Isolation intakt mikrogefäßen aus rattengehirn zeigt (Abbildung 2A). Diese Schiffe wurden nach Abschluss der Zentrifugation mit Dextran und unmittelbar vor Beginn der Ultrazentrifugation, Membran-Proben (d. h. nach Abschluss von Schritt 4.10) vorzubereiten. In diesem Bild ist die kapilläre gebeizt mit einem Antikörper gegen Oatp1a4, ein Transporter, der gezeigt hat, auch in der Plasmamembran von Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen2,11,13ausgedrückt werden, 18. Mit western-Blot Analyse (Abb. 2 b), Membran, die Vorbereitungen von mikrogefäßen geerntet von weiblicher Sprague-Dawley Ratten gezeigt wurden angereichert werden in Thrombozyten Endothelzellen Adhäsion Molekül-1 (PECAM-1, auch bekannt als CD31), ein Marker Protein für Gehirn Microvasculature. PECAM-1 ist eine hemmende ko-Rezeptor T-Zellen und B-Zell-Signalisierung beteiligt, die hoch auf der Plasmamembran von vaskulären endothelialen Zellen exprimiert wird. Bei der Optimierung dieses Protokolls verzeichneten PECAM Bereicherung Membran Proben mit zwei und vier Dextran Zentrifugation Schritte vorbereitet. Wie in Abbildung 2 bgezeigt, gab es keinen Unterschied in PECAM Ausdruck zwischen Proben mit verschiedenen Zentrifugation folgendermaßen zubereitet; jedoch führte vier Dextran Spins in verbesserte Expression von endothelialen Transportproteine, die verbesserte kapilläre Anreicherung in den Proben angibt. Darüber hinaus dreht sich die Verwendung von vier Dextrans verbesserte Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie durch reduzierte Expression von neuronalen Marker-Proteine wie Synaptophysin18angegeben. Daher wurden alle weiteren Vorbereitungen für kapilläre Hirnhäute mit vier Dextran Zentrifugation Schritte durchgeführt. In unseren western-Blot-Experimenten wurde die Mikrotubuli konstituierenden Protein Tubulin laden zur Kontrolle verwendet. Da durch die Bradford Protein Assay bestimmt, Ausbeute Membran Vorbereitungen in der Regel proteinkonzentrationen von 5,0 mg/mL bis 10,0 mg/mL. Repräsentative Protein Quantifizierung Ergebnisse sind in Tabelle 1dargestellt. Diese Proteinwerte wurden ermittelt anhand einer Standardkurve, die generiert wurde mit Rinderserumalbumin (BSA; 2,0 mg/mL), als Standard (Abbildung 3). Proteinproben wurden 10-fach verdünnt in der Bradford-Test.
Im Anschluss an Protein Quantifizierung können kapilläre Membran Proben für Biochemische Methoden zur Proteinanalyse wie western-Blot Analyse, Dot-Blot oder co-Immunopräzipitation genutzt werden. Abbildung 4A zeigt eine repräsentative western-Blot für die BBB Transport Protein Glucose Transporter-1 (Glut-1) wo Proben aus Tabelle 1 analysiert wurden. Löschen einzelner Bands bei der entsprechenden Molekulargewicht (d. h. um 54 kDa vorausgesagt) für diese höchst ausgedrückt BBB Protein wurden in jede Membran-Probe nachgewiesen. Jede einzelne Spur in diesem western-Blot stellt kapilläre Membran Probe aus einem einzigen Versuchstier vorbereitet. Gleiche Protein in jeder Bahn war entschlossen mit Natrium-Kalium-ATPase (d. h. Na+/+ ATPase k; vorausgesagten Molekulargewicht = 113 kDa) laden zur Kontrolle. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, wurde höheren Ausdruck von Glut-1 an der BBB bei männlichen Ratten im Vergleich zu ihren weiblichen Kollegen beobachtet. Kein Unterschied im Ausdruck der Na+war/k+ ATPase zwischen männlichen und weiblichen Tieren beobachtet. Für diese densitometrische Analyse wurden Bands quantitated mit ImageJ-Software.
Abbildung 1: Überblick über Verfahren und Protokolle, Ratte Gehirn mikrogefäßen isolieren und Membran Proben vorzubereiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Daten intakt kapilläre und Ausdruck eines vaskulären endothelialen Zellen Marker Proteins zeigen. A: Immunfluoreszenz-Färbung zeigte Lokalisierung von Oatp1a4, ein Transporter, der nachweislich an der BBB in einem intakten Gehirn kapilläre isoliert, wie in diesem Protokoll beschrieben gut zum Ausdruck gebracht werden. Oatp1a4 Lokalisierung wurde gefunden mit einer spezifischen Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen Oatp1a4 bei einer Verdünnung von 01:10. Der Sekundärantikörper war eine fluoreszierende konjugierten Anti-Kaninchen-IgG, die bei einer Verdünnung von 1: 300 verwendet wurde. Maßstabsleiste = 7,5 μm. B: Western-Blot Analyse beweist, dass die Reinheit der kapilläre Proben zeigen Bereicherung des spezifischen Endothelzellen Marker Proteins PECAM-1, die entdeckt wurde, mit einer Maus monoklonaler Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 100. Der Sekundärantikörper war eine Anti-Maus IgG bei einer Verdünnung von 1: 50.000. BH = Gehirn Homogenat, MV = grobe kapilläre Bruchteil, MVM = kapilläre Hirnhäute. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: eine repräsentative Standardkurve für Bradford Protein Assay. Rinderserumalbumin (BSA) wurde als Standard verwendet und wurde mit den folgenden Konzentrationen verdünnt: 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 und 2,0 mg/mL. Extinktion gemessen wurde bei = 595 nm. Jeder Datenpunkt entspricht einem Durchschnitt von drei Extinktion Lesungen pro BSA-Konzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Repräsentative western-Blot zeigen Geschlechtsunterschiede in Glut-1 Expression in Membran Proben vorbereitet von isolierten Ratte Gehirn Mikrogefäßen. A: Western-Blot Analyse zeigt Ausdruck der Glut-1 Membran Proben aus kapilläre isoliert von männlicher und weiblicher Sprague-Dawley Ratten vorbereitet. GLUT-1 war ein Kaninchen monoklonaler Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 500 mit nachgewiesen. Der Sekundärantikörper war ein monoklonaler Anti-Kaninchen-IgG bei einem 1:40,000 Verdünnung. Na=/k+ ATPase, ein Plasmamembran Marker und das Steuerelement geladen wurde erkannt, mit einer polyklonalen Anti-Kaninchen-IgG bei einer Verdünnung von 1: 40.000. B: Densitometrische Analyse der Glut-1 Expression in Membran Proben isoliert von männlicher und weiblicher Sprague-Dawley Ratten. Ergebnisse werden ausgedrückt als SEM von 6 Versuchstiere pro Behandlungsgruppe bedeuten. Sternchen geben Datenpunkte, die statistisch signifikant von der Kontrolle sind. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant zu sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Tier | Durchschnittliche Absorption | Bereinigte Extinktion | Berechneten Konzentration | Tatsächliche Konzentration |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| Männlich 1 | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7,68 |
| Männlich 2 | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7,42 |
| Männliche 3 | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| AG 4 | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| Männliche 5 | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| Männliche 6 | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Frau 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0,578 | 5,78 |
| Weibliche 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| Frau 3 | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| Weibliche 4 | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| Weibliche 5 | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7,77 |
| Weibliche 6 | 0.7975 | 0.3867 | 0,77 | 7.7 |
Tabelle 1: Vertreter Proteinkonzentrationen von Gehirn kapilläre Vorbereitungen abgeleitet von männlicher und weiblicher Sprague-Dawley Ratten. Bereinigte Extinktion Zeitwerte sind durch Subtraktion Hintergrund Extinktion bei l = 595 nm von durchschnittlichen Absorption Werte für jedes Versuchstier. In diesem Test war Hintergrund Extinktion entschlossen, 0.4108 zu werden.
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Discussion
In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur13,20,21,22 wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. , 24. zwar die kapilläre Isolierung Protokoll beschriebenen im Prinzip ähnlich, dieser Ansatz wurde optimiert, um die Vorbereitung der Membran-Proben mit hervorragenden Proteinausbeute aus einem einzigen Versuchstier zu ermöglichen. Dieser Fortschritt hat die Notwendigkeit zum Pool mikrogefäßen aus mindestens drei Sprague-Dawley Ratten beseitigt werden, um Proben mit zufriedenstellenden proteinanreicherung für den Einsatz in verschiedenen Ansätzen für Protein-Analyse zu erhalten. Solche Ansätze beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf, western-Blot Analyse, Dot-Blot und co-Immunopräzipitation. Es sei darauf hingewiesen, dass die Praxis des Poolings mikrogefäßen aus mehreren Versuchstieren zu eine einzige Probe stark generieren konzerninternen Variabilität reduziert. Insofern kann kapilläre bündeln Daten mit der geringeren Verbreitung führen, die keine echte Variabilität in Protein-Expression in einer Population von Versuchstieren beobachtet darstellt. Da Proben aus einzelnen Versuchstiere zubereiten können, ist die wahre Variabilität einer Studie Bevölkerung erfasst wodurch für experimentelle Daten, d. h. mehr Vertreter des pathophysiologischen oder pharmakologische unter bezogen werden, Prüfung. Ein weiterer Vorteil ist, dass kapilläre Membran Proben mit einer reduzierten Anzahl von Versuchstieren zubereitet werden können.
Vielleicht beinhaltet die wichtigste Überlegung bei der Durchführung dieses Protokolls die Zentrifugation Schritte. In der Tat können Zentrifugen Laboratorien aufgrund ihres Alter oder Hersteller und/oder allgemeine Zustand und Integrität unterscheiden. Dies führt zu starken Schwankungen der tatsächlichen g Ebene (oder u/min Level) von Spin, Spin. Die Rolle dieser Variante in die Probe Integrität kann durch Zentrifugieren aller Proben in einer einzigen Vergleichsanalyse zusammen im gleichen Rotor gleichzeitig minimiert werden. Beispielsweise besitzt ein Rotor nur zwölf verfügbaren Slots für Probenröhrchen, werden dann die Isolierung und die Vorbereitung der kapilläre Proben in einem einzelnen Experiment auf zwölf beschränkt. Diese Überlegung gewährleistet, dass die vorbereitete Proben von vergleichbarer Qualität sind und die Behandlung-Bedingung selbst Variabilität im mittleren Proteinexpression zwischen experimentellen Gruppen zugeordnet werden kann.
Eine weitere Überlegung betrifft die Vorbereitung der 26 % Dextran-Lösung, die für Trennung von Gehirn mikrogefäßen und parenchymatösen Hirngewebe über Differentielle Zentrifugation erforderlich ist. Dextran ist ein Glucose-Polymer mit einer Prävalenz von α-1,6-linked Einheiten und in der Regel eine lineare Struktur25besitzt. Es hat auch eine hohe Wasser-Bindungskapazität. Zum Beispiel behält 1 g Dextran 75 (z.B. Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 75.000 Da wie in diesem Protokoll verwendet wird) ca. 20-25 mL Wasser. Diese Eigenschaft von Dextran führen zu tiefgreifenden Herausforderungen bei der Auflösung des Pulvers in den wässrigen Puffer. Wässrige Löslichkeit kann verbessert werden durch Erhitzen die Dextran-Lösung für eine maximale Temperatur von 40 ° C. Beim Erhitzen interagiert das Polymer weniger mit Wasser-Moleküle, wodurch Dextran, eine weniger erweiterte Konformation (d. h. niedriger Grad der Wassereinlagerungen) Lösung zu beschließen. Heizung auf höhere Temperaturen bewirkt, dass die Dextran-Polymer zu brechen und daher wird es als trennende Reagens unwirksam sein. Darüber hinaus ist es wichtig, dass der pH-Wert der Lösung Dextran 7.4 unmittelbar vor der Anwendung angepasst werden. Lösungen von 26 % Dextran erleben bedeutende pH Verschiebungen, sogar über 1-2 Stunden nach Zubereitung. Aufgrund dieser Überlegungen muss die 26 % Dextran-Lösung am Tag des Experiments aber rechtzeitig vor der Isolierung des Gehirngewebes bereit sein, für Auflösung und entsprechende Einstellung des pH-Wertes zu ermöglichen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls beinhaltet das Vorhandensein von anderen Zelltypen des Referats Neurovaskuläre (NVU) in kapilläre Vorbereitungen. Neben der Endothelzellen besteht das NVU aus verschiedenen zellulären Komponenten einschließlich Gliazellen (Astrozyten, Mikroglia), perizyten und Neuronen 3,26,27. Isolierung von mikrogefäßen von Nagetier Gehirn zeigt in der Regel Anreicherung mit vaskulären endothelialen Zellen; Allerdings ist auch Ausdruck der neuronalen Marker-Proteine sowie Ausdruck des glial fibrillary sauren Proteins (GFAP), eine etablierte Astrozyten Marker beobachtet. Darüber hinaus sind perizyten in Probe Vorbereitungen durch ihre intime Verbindung mit dem vaskulären Endothel. Derzeit ist es praktisch unmöglich, Gehirn mikrogefäßen von Versuchstieren zu isolieren und beseitigen Sie alle perizyten, Neuronen und Astrozyten. Jedoch wurde dieses Protokoll über mehrere Stufen der Zentrifugation vorgebracht worden, so dass die Proben in Endothelzellen angereichert sind (d. h., wie durch verbesserte Ausdruck PECAM-1 nach jedem Zentrifugationsschritt angegeben) mit geringen Präsenz von anderen Zelle Arten ( d. h., wie durch Ausdruck des neuronalen Marker Protein Synaptophysin-1 nach jedem Zentrifugationsschritt reduziert).
Insgesamt kann dieser Ansatz für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben in jedem Labor mit einem Interesse an einem Studium von BBB Proteine unter pathophysiologischen oder pharmakologische Bedingungen angepasst werden. Dieses Protokoll stellt beispielsweise kapilläre Proben, die für das Studium der Droge Transportproteine genutzt werden können, die bei der BBB2,18endogen ausgedrückt werden. Die Robustheit dieses Ansatzes hat die Beobachtung der diskreten Veränderungen in Oatp1a4 in Reaktion auf pharmakologische Reize, experimentellen Daten ermöglicht, die Gestaltung der strenge Studien zur Bewertung Transporter Funktion und Regulierung an der BBB informiert hat. Das oben beschriebene Protokoll auch für Protein Analysen tight Junction und Adherens Junction-Proteine in einer Bemühung, die BBB unter physiologischen Bedingungen verstehen und Veränderungen in BBB Integrität als Reaktion auf pathophysiologischen studieren gelten und pharmakologischen Stressoren. Klar, dieses Protokoll kann für vielfältige Anwendungen in der BBB-Bereich angepasst werden und stellt daher eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode, die in BBB Studien erfordern Proteinanalytik integriert werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01-NS084941) und die Arizona biomedizinische Forschungskommission (ADHS16-162406), PTR. WA erhielt vorbei an Unterstützung von Pre-doc Termin für eine nationale Institute der Gesundheit Ausbildung Grant (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
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