Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57701
Automatic Translation
1, 2
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Department of Molecular Genetics, Institute of Life Science, Kurume University

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

Abstract

עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.

Introduction

עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.

דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה 8 היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים9. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז2 + Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca2 + מ ה ER10. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות2 + Ca תאיים. Ca2 + עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca2 + וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית11.

במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת המוח זחל Explants

  1. להפוך חדר הדמיה.
    הערה: הקלטה יציבה מחייבת explants המוח להיות קשורה. . הנה, תא הדמיה נמוכים, בעבודת יד משמש את Ca2 + מערכת הדמיה.
    1. באמצעות מלקחיים, לגרד במרכז תחתית לצלחת פלסטיק תרבות (35 מ"מ x 10 מ"מ) כדי ליצור גומה עבור גנגליון הגחוני של המוח זחל שהופך הרכבה קלה יותר (שלב 1.3, איור 1).
    2. עם קיסם, במקום טיפה קטנה של דבק מגע על צדי השקע וחבר מוט טונגסטן (0.125 מ"מ קוטר, 6-7 מ מ אורך) הדבק.
    3. באמצעות פיסה קטנה של דבק לשימוש חוזר, כמו מרק, יצירת קיר עגול (10 מ מ בקוטר של 3 מ מ) סביב השקע שנוצר (איור 1).
      הערה: החלל בתוך הקיר אחר כך יתמלא buffered פוספט תמיסת מלח (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M אשלגן כלורי, פו40.01 M3 -, pH 7.4 ± 0.05 25 ° c).
  2. הכנת בעלי חיים
    הערה: עבור הדמיה סידן, מחוון סידן, GCaMP6s, מתבטאת בסוג התא של עניין, אשר בדרך כלל מושגת באמצעות שילובים של רקמות ספציפיות GAL4 ו UAS-GCaMP6s. כדי להבטיח כי האות מתווך באמצעות הקולטן המועמד, GCaMP6s מתבטאת גם מוטציה פגומה של הקולטן.
    1. כאשר השוואות ניסיוני עבור אחרים שונים כגון סוג הפרוע מוטציות נדרשים, הזחלים מבחן התאמה גיל כדי להימנע GCaMP6 ביטוי ברמה וריאציות, הבדלים פיזיולוגיים עקב שלבים התפתחותיים.
    2. שמור הורים זבובים (30 זבובים לסקס כל) מבחנה אחת תרבות המכיל מזון לטוס סטנדרטי עבור 8 שעות לאפשר הטלת ביצים על פני השטח של המזון. הזחלים תרבות המונית תחת מחזור בהירה-כהה 12-h ב- 25 ° C ו- 60-70% לחות יחסית.
  3. דיסקציה של המוח זחל
    1. 90-120 h לאחר ביצה הנחת (AEL), לאסוף את הזחלים, לשטוף אותם לפחות 3 פעמים עם מים מזוקקים להסרת פסולת מזון חסיד.
    2. המקום זחל על זכוכית השעון סקוור 1.5 אינץ מלא PBS קר קרח.
      הערה: השלבים שני הבא מתבצעות בכוס הזו לצפות במיקרוסקופ ויבתר.
    3. להשתמש מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. להשתמש מלקחיים אחר כדי לתפוס את הווים הפה ומשוך את הווים הפה בעדינות כדי להפריד בין החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר חלקי הגוף.
      הערה: לחלופין, מספריים כירורגיים יכול לשמש.
    4. להחזיק את הקצה הקדמי על ידי מלקחיים ופנו הזחל מבפנים החוצה. הסרת רקמת חיצוני המחובר אל המוח, כגון דיסקים דמותי, שומן הגוף ובלוטת טבעת. בעדינות להפריד בין המוח לבין mouthparts.
    5. µL 200 ל- PBS חלות על החלק הפנימי של הטבעת עשוי דבק לשימוש חוזר דבק שפכטל דמוי בבית הבליעה הדמיה. למצוץ בעדינות את המוח ביתור עם PBS לתוך פיפטה פסטר, ולאחר מכן להעביר אותו לחדר ההדמיה.
  4. הגדרת המוח לחדר ההדמיה
    1. להשתמש מלקחיים לתפוס סיבי השריר המשתרעת הגרעינים הגחון. הכנס המוח בעדינות לתוך השקע שנוצר מתחת לגדר טונגסטן.
    2. באמצעות מלקחיים אחר, משוך החוט טונגסטן מעט עד מקום המוח במיקום הנכון הדמיה (איור 1).

2. רכישת Ca2 + זריחה תמונות

הערה: המוח explants שקוע PBS הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד 20 X עדשה המטרה טבילה במי (נ. א = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם ציר z תמונות נדרשים, העדשה המטרה נטענה עם mover עדשה פיזואלקטריים מופעל. ראש ספינינג דיסק קונאפוקלית משמש כדי לשפר את הרזולוציה זמן. עבור תאורה הדמיה, אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה נטענה על המיקרוסקופ. ההדמיה של זריחה GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורש 488 ננומטר לייזר עבור עירור עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר, מסנן פליטה (למשל., 528 ± 38 nm הלהקה bandpass מסנן).

  1. המקום תא הדמיה המכיל את explant המוח מתחת למיקרוסקופ.
  2. . תוריד את העדשה המטרה עד שייגע מגניב. תחת תאורה בהירים-שדה, מקם את המוח ולהביא אותה לידי המוקד. לעבור אור ניאון והתאימו את המוקד על תאים התווית על-ידי GCaMP6s.
    הערה: קרינה פלואורסצנטית ירוק הבזליים של GCaMP6s צריכים להיות גלויים.
  3. התחלה רכישה ב 250 ms/מסגרת ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים במצב water-cooled באמצעות התוכנה רכישת המתאים (למשל., µManager). להתאים את זמן החשיפה להשיג ערכי פלורסצנטיות בתוך הטווח הדינמי של מצלמה CCD, אבל לא נמוכה יותר 1000 (יחידות שרירותיות), עם תמונות 16 סיביות (טווח דינמי 0-65,535).
    הערה: זמן חשיפה נמוכה אמור לשמש כדי למזער את הלבנת לצילום של GCaMP6s. זמן החשיפה צריך להיות מוטבת ניסוי זה תלוי רמות הביטוי של GCaMP6 ואת הרגישות של מערכת זיהוי. . זה היה 100 ms שלנו באמצעות ניסוי dilp2 > GCaMP6s. כאשר z-סעיפים הנדרשים עבור עומק הדמיה נתון, ניתן לרכוש מספר תמונות z-סעיף בהתאם מרווחי הזמן ומסגרת של חשיפה. אם המצלמה יש מספיק רזולוציה מרחבית, גודל binning (מספר הקופות על השבב זה להיות מנופה לתוך פיקסל דיגיטלית אחד) צריך להיות מוגברת כדי לצמצם את זמן החשיפה.
  4. ברגע דימות פרמטרים נקבעים, לקחת את תמונות עבור 1 דקות לפני פפטיד המינהל כדי לזהות עוצמות האות הבסיסית (F0).
  5. להחיל את מבחן פפטיד; בשביל זה, להמיס 100 µL של פתרון פפטיד PBS, pipette זה ישירות לתוך האמבט זחל להניב תשואה של ריכוז אופטימלי.
    הערה: הפתרון פפטיד צריך להיות מוזרק לאט (למשל, תזרים שיעור 20 µL/s) בתוך תמיסת אמבט באמצעות פיפטה של. לא קשורים פפטיד סינתטי מומס PBS משמש פקד שלילי.
  6. להקליט את פליטת GCaMP6s לכמה דקות.

3. ניתוח נתונים

הערה: הדמיה הנתונים מנותחים במצב לא מקוון עם ImageJ. במהלך ההדמיה זמן לשגות, pipetting גורמת למוח זחל להזיז. לכן, יש לתקן סטיות לפי מיקום של תמונות טורי לפני ניתוח. התיקון יכול להתבצע באמצעות ImageJ של התוספת, TurboReg כפי שמוצג להלן.

  1. פתח את תוכנת ניתוח ועושים שימוש המסגרת הראשונה (לפני יישום פפטיד) תמונת ייחוס.
  2. בחר תוספים | רישום | TurboReg.
  3. לבחור את קובץ התמונה טורי מקור התמונה התייחסות היעד.
  4. בדוק אם גוף קשיח (מקביל הזחה וסיבוב של תמונות), מדויקות ("מהיר" הוא גס אבל ניתוח מהיר במקום) שיטת העיבוד ואת איכות, בהתאמה.
  5. לחץ על אצווה כדי להפעיל את העיבוד תמונה.
  6. בחר אזורים מרובים עניין (ROIs) באמצעות נתח | כלים | רועי מנהל ב ImageJ.
  7. למדוד את עוצמת פיקסל על ידי לחיצה על יותר | ריבוי אמצעי | טוב בחלון מנהל רועי.
  8. חישוב ΔF/F0 = (F - F0) /F0, כאשר F הוא עוצמת ROI בזמן הגירוי ו- F0 היא עוצמת-חלון זמן מיד לפני אירוע מסוים ניסיוני (למשל, 30 מסגרות מקדים תחילת גירוי).
  9. חזור על הניסוי באמצעות דגימות מוח מרובים, בניהול עיבוד סטטיסטי של הנתונים כדי לקבל ממוצע של שגיאת התקן של הממוצע (SEM) בכל נקודה בזמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL412 (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s13 (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתטי, הוקלט על ידי קרינה פלואורסצנטית מ- GCaMP6s בזמן אמת. בניסוי זה, תמונות, התקבלו מוקד מטוס בודד. כל אשכול IPC מכילה תאים בסביבות 1414, אותות 3 אל 6 תאים אותרו. עוצמת האות GCaMP6s היה גדל באופן דרמטי על המינהל CCHa2 (איור 2א, סרט 1). המוח פראי-סוג לא הראה מענה ברור גרלין או Nociceptin (הסרט 2 ו- 3, בהתאמה), אשר הם יונקים פפטיד ההורמונים ללא homologue דרוזופילה . תוצאות אלה מציינים כי הפעלת שנצפה IPCs על ידי CCHa2 היא תגובה ספציפית CCHa2. כדי לברר אם CCHa2 פועלת באמצעות CCHa2-R, הניתוח באותו נערך באמצעות המוח מוטציה CCHa2-R. אין עלייה כזו בעוצמת האות נצפתה לאחר CCHa2 המינהל במוחם מוטציה (4 סרטים). ניתוח סטטיסטי הראה כי ההבדל בעוצמת האות בין פראי-סוג CCHa2-R שכל מוטציה הפכה משמעותית בתוך 2 דקות לאחר יישום CCHa2, נשמר לפחות 7 דקות (איור 2B). תוצאות אלו מצביעות על IPCs במיוחד מופעלים על-ידי CCHa2 דרך CCHa2-R. כל פפטידים השתמשו במחקר זה היו מדולל על ידי PBS להניב ריכוז סופי של 10-9 מ'.

Figure 1
איור 1 . הדמיה תא
(א) תרבות מאכל (35 מ"מ x 10 מ"מ) עם שקע קטן, רוד tethering. (B) בצורת טבעת קיר עשוי דבק שפכטל דמוי דבקים לשימוש חוזר. (ג) A explant המוח זחל הוכנס לחדר ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . סידן הדמיה של explant המוח זחל
המוח פראי-סוג (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) נחשף CCHa2 גרלין, Nociceptin. מוטציה CCHa2-R (dilp2-Gal4, CCHa2-Rטל-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-Rטל-34) המוח נחשף CCHa2. אותות GCaMP6s ב IPCs אותרו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית-ms 250/מסגרת. עדיין תמונות של נקודות זמן נבחר מוצגות באותיות (A). התמונות היו pseudocolored משופרת של עוצמות האות שונה. ΔF/F0 בכל נקודה בזמן הייתה להתוות ב (B). ΔF/F0 מחושב מ 5 כדי 10 תכשירים שונים. ROIs נקבעו על הגופות תא שזוהו על מטוס מוקד זהה. הקווים מוצק מציינים הממוצע של 5-10 דוגמאות, ולסמן הקווים המקווקווים הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע. אזורים מוצללים מציינים את הווריאציה של האותות בניסויים. סולם בר מציין 50 מיקרומטר. הדמות היא ממאמרו של סנו. et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1. IPCs פראי-סוג נחשפים CCHa215 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
הסרט 2. IPCs פראי-סוג נחשפים גרלין15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 3
הסרט 3. IPCs פראי-סוג נחשפים Nociceptin15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 4
סרט 4. CCHa2-R מוטציה IPCs נחשפים CCHa2 15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ויוו הדמיה. במערכת זו, ניתן לבדוק מולקולות ביחידים או במשולב. בנוסף פפטיד ההורמונים, כל מולקולות מסיסים במים, כולל תרכובות טבעיים או סינתטיים, ניתן ליישם את explant במוח.

עבור Ca2 + הדמיה, המוח explants צריך להיות קשור. למטרה זו, מטריצה ג'ל העשוי agarose נקודת התכה נמוכה או פיברין היה בשימוש בעבר16,17. מטריצות אלה ג'ל יכול להחזיק את הדגימה stably, עם זאת, רקמות מחוממים מעל 30 ° C. את החום גורם לתגובה חום-הלם ב poikilothermic בעלי חיים כגון חרקים. כדי למנוע עומס חום, המוח יכול להיות קשור פיזית. המוח המצורפת את הקוטיקולה מהודקים עם סיכות חרקים18. השיטה שלנו באמצעות חוט טונגסטן מספק פשוטה, יציבה מחזיק המדגם. מערכת זו היא קלה להכנה ולשימוש ומאפשרת ממריצים להגיע תאי היעד בקלות רבה יותר בהשוואה הג'ל הטמעת השיטה. לכן, זה יהיה שימושי להקרנה ליגנד.

הבחירה של מחוון פלורסנט תלוי בסוג של היעד נוירונים, הסוג של קולטנים לידי ביטוי הנוירון, והשאלות ביולוגי נותרים ללא מענה. סדרה של משתנים GCaMP6 אופטימיזציה עבור זיהוי שונים טמפורלית Ca2 + דינמיקה כבר שנוצר13. בפרט, GCaMP6 גרסאות נבדלים קינטיקה התגובה שלהם: GCaMP6s (איטי), GCaMP6m (בינוני), ו- GCaMP6f (מהיר). הטיימס דעיכה עבור GCaMP6s ו- 6m איטיים יחסית (כלומר., τ1/2 אחרי 10 פוטנציאל פעולה בהכנה פרוסה בהיפוקמפוס) בזמן זה GCaMP6f הוא מהיר (τ1/2 לאחר פוטנציאל הפעולה 1). סוגים אחרים של מחוונים פלורסנט זמינים עבור פעילות עצבית כוללים במחנה EPAC (מחנה), Synapto-pHluorin (שחרור סינפטית), תאטרון ארקלייט (פוטנציאל ממברנה)19,20,21. בשעונים פלורסנט מקודדים גנטית יכול להתבטא סוגי תאים ספציפיים. לפיכך, ex-vivo מערכת הדמיה לזהות שונים התגובות בנוירונים הרצוי.

ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה. ראשית, שאינם שייכים לרקמות יש להסיר מן המוח כדי לקבל תמונה ברורה. השימוש מחודדים מלקחיים ומספריים כירורגי מקלה על העבודה עדין. שנית, והטרף המוח להיות קבועה למקומן. לעיתים, המדגם המוח עוברת מעט pipetting (טווח כ 5 מיקרומטר). כדי למנוע את המוח זז, הגובה של חוט טונגסטן בבית הבליעה הדימות צריך להיות מותאם בהתאם לגודל המדגם המוח. לחלופין, יכול להתקין מערכת הכבידה-feed זלוף לגירוי עדין. שלישית, התוצאות של הדמיה מוחית יש לפרש בזהירות. ליגנד חלה על המוח עלול לעורר נוירונים בלתי צפויים, אשר בתורו יכול להפעיל את הנוירונים היעד. כדי לזהות את ההשפעה הישירה של הורמון על נוירונים ספציפיים, הקולטן צריך להיות הפילו-מטה targetneurons. במקרה זה, הביטוי של מחוון פלורסנט יכול להיות משולב עם זה של הקולטן RNAi באמצעות מערכת Gal4/UAS.

מגבלה מינור של פרוטוקול זה הוא המשך של הדמיה הוא מוגבל בשל הנזק בסופו של דבר המדגם המוח. בידיים שלנו, המוח דרוזופילה יכול לדימות עבור עד כ 60 דקות שימוש בפרוטוקול זה. פתרון כמו hemolymph, כגון מלוחים HL3.122, ואת עוצמות לייזר עלול לאפשר הדמיה לטווח ארוך. בנוסף, הדמיה הכיוונון הנוכחי אינו מתאים גירוי חוזרות באותה דגימת זרע. לניסויים כאלה, אמבט זלוף יוכל לשמש.

לבסוף, פרוטוקול זה יש יישומים שונים. על-ידי שינוי התא הדמיה, המוח למבוגרים ו רקמות דרוזופילה אחרים או ברקמות של בעלי חיים אחרים יכול לדימות. אורגניזמים שאינם-דגם, העדר כלים גנטיים הפכה אותו קשה להציג מחוונים פלורסנט לתוך הגנום. עם זאת, טכניקות עריכה הגנום CRISPR/Cas9 פיתחה לאחרונה פתחת את הדלת כדי הנדסה גנטית בבעלי חיים אלה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד הבין-עוגב איתות במגוון רחב של החיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ' אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ'י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten rod A-M systems, Sequim, WA, USA 717000
Blu Tack Bostik, Paris, France 3049100 putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA 742300
PBS TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan T900 Phosphated buffered salts
CCHa2 SCRUM Inc., Tokyo, Japan Custum-synthesized peptide
Ghrerin Peptide institute Inc., Osaka, Japan 4372-s
Nociceptin Peptide institute Inc., Osaka, Japan 4313-v
Axio Imager A2 Carl Zeiss, Oberkochen, Germany Axio Imager A2 fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 Carl Zeiss, Oberkochen, Germany 420957-9900-000 water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany N/A piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1 Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan CSU-W1 spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13 Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan C9100-13 EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW Coherent, Santa Clara, CA, USA 1178770 488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter Semrock, Rochester, NY, USA Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock, Rochester, NY, USA FF01-528/38-25 emission filter
µManager Open Imaging, Inc. N/A https://micro-manager.org
ImageJ U. S. National Institutes of Health N/A https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne N/A http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
  2. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
  3. Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
  4. Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
  5. Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
  6. Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
  7. Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
  8. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  9. Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
  10. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
  11. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  12. Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
  15. Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
  16. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
  17. Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
  18. Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
  19. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  20. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
  21. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  22. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).

Tags

מדעי המוח גיליון 136 סידן הדמיה GCaMP המוח explant הורמון קולטן G-חלבון בשילוב דרוזופילה
<em>לשעבר Vivo</em> הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב <em>דרוזופילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishimoto, H., Sano, H. Ex… More

Ishimoto, H., Sano, H. Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (136), e57701, doi:10.3791/57701 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter