Summary
इस कागज Drosophila मस्तिष्क के पूर्व vivo कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि में, प्राकृतिक या सिंथेटिक यौगिकों बफर करने के लिए अपने मस्तिष्क में विशेष ंयूरॉंस को सक्रिय करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
अंग-अंत में संकेतन द्वारा अंग संचार, उदाहरण के लिए, परिधि से मस्तिष्क तक, homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. अंत में स्रावी अनुसंधान, Drosophila melanogaster, जो परिष्कृत आनुवंशिक उपकरण और जीनोम जानकारी है के लिए एक मॉडल पशु के रूप में, तेजी से इस्तेमाल किया जा रहा है । यह आलेख Drosophila ब्रेन explants की कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इस विधि मस्तिष्क के लिए एक हार्मोन के प्रत्यक्ष संकेत का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है । यह सर्वविदित है कि कई पेप्टाइड हार्मोन जी के माध्यम से कार्य-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), जिसका सक्रियकरण intracellular Ca2 +एकाग्रता में वृद्धि का कारण बनता है । तंत्रिका सक्रियकरण भी intracellular ca2 + स्तर, दोनों ca2 + आमद और ca के रिलीज2 + endoplasmic जालिका (एर) में संग्रहित से उंनयन । एक कैल्शियम सेंसर, GCaMP, इन Ca2 + परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं. इस विधि में, GCaMP हित के न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, और GCaMP-व्यक्त लार्वा मस्तिष्क में विच्छेदित और संस्कृति है पूर्व vivo. परीक्षण पेप्टाइड तो मस्तिष्क explant के लिए लागू किया जाता है, और GCaMP में फ्लोरोसेंट परिवर्तन एक कताई डिस्क फोकल एक सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पाए जाते हैं । इस विधि का प्रयोग, किसी भी पानी में घुलनशील अणु का परीक्षण किया जा सकता है, और विभिंन सेलुलर तंत्रिका सक्रियण के साथ जुड़े घटनाओं उपयुक्त फ्लोरोसेंट संकेतकों का उपयोग कर imaged किया जा सकता है । इसके अलावा, इमेजिंग चैंबर को संशोधित करके, इस विधि अन्य Drosophila अंगों या अन्य जानवरों के अंगों की छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
अंग-अंग संचार एक evolutionarily homeostasis को बनाए रखने के लिए पर्यावरण परिवर्तन से निपटने के लिए रणनीति का संरक्षण है । मानव में, हार्मोन की एक किस्म संचलन में अंत में स्रावी ग्रंथियों से arereleased । इन हार्मोन के कई मस्तिष्क, जो चयापचय प्रक्रियाओं और1,2खिला के रूप में मौलिक व्यवहार को नियंत्रित करता है की hypothalamus लक्ष्य । कई हार्मोन स्तनधारी मॉडल का उपयोग कर की खोज की गई है । हालांकि, उनकी कार्रवाई के तंत्र, विशेष रूप से अंग नेटवर्क जिसमें वे भाग लेते हैं, मोटे तौर पर अस्पष्ट रहते हैं ।
Drosophila melanogaster अंग-अंग के संचार के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है । कीड़ों में, कई शारीरिक प्रक्रियाओं हार्मोन द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । जल्दी विकास और कायापलट पर ध्यान केंद्रित अध्ययन बड़े कीड़ों का इस्तेमाल किया । इन अध्ययनों में, हटाने या विशिष्ट अंगों के प्रत्यारोपण अंतर अंग संकेतन अणुओं के अस्तित्व की भविष्यवाणी की; बाद में, जुवेनाइल हार्मोन (जैक् स), Prothoracicotropic हार्मोन (PTTH), और Ecdysone को3,4,5को रासायनिक रूप से शुद्ध किया गया । एक बड़े परिवार के सेलुलर संकेत पेप्टाइड्स कीट जीवन चक्र6,7के दौरान विभिन्न शारीरिक घटनाओं में शामिल होने के लिए सोचा है । इन पेप्टाइड्स के अधिकांश जी पर अधिनियम-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), हालांकि विशिष्ट GPCRs शुरू में पारंपरिक दृष्टिकोण का उपयोग की पहचान करने के लिए मुश्किल थे. Drosophila पूरे जीनोम अनुक्रम8 के प्रकाशन सफलता है कि अंय कीड़ों में पाया उन लोगों के लिए उनके समरूपता के आधार पर Drosophila सक्रिय पेप्टाइड्स की पहचान सक्षम था । इसके अलावा, कई पेप्टाइड्स के लिए रिसेप्टर्स सेल का उपयोग कर जीनोम में भविष्यवाणी GPCRs से पहचाने गए थे-संस्कृति आधारित GPCR-ligand बाध्यकारी परख. अगले, अभिव्यक्ति विश्लेषण अंग करने वाली अंग इन पेप्टाइड्स और रिसेप्टर्स द्वारा निकाले रास्ते की भविष्यवाणी की । विशेष रूप से, ख्यात पेप्टाइड रिसेप्टर्स के कई मस्तिष्क में व्यक्त कर रहे हैं, सुझाव है कि मस्तिष्क पेप्टाइड हार्मोन का एक प्रमुख लक्ष्य है9. इसके अलावा, Drosophila में उंनत आनुवंशिक उपकरण पेप्टाइड-GPCR संयोजन की शारीरिक भूमिकाओं की पहचान के लिए योगदान दिया है । उदाहरण के लिए, GAL4 और LexA-आधारित बाइनरी transcriptional सिस्टम एक स्थानिक और अस्थाई नियंत्रित तरीके से जीन पछाड़ना या अधिकता को सक्षम बनाता है । GAL4, खमीर में पहचाने गए एक प्रतिलेखन कारक, एक विशिष्ट सीआईएस-विनियामक अनुक्रम को बांधता है जिसे ऊपर सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) कहा जाता है । GAL4/यूएएस सिस्टम में, ड्राइवर लाइन ऊतक-विशिष्ट या स्टेज-विशिष्ट GAL4 अभिव्यक्ति प्रदान करता है और उत्तरदाता लाइन यूएएस ब्याज की जीन के ऊपर किया जाता है या shRNA अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए निर्माण । LexA/LexAop प्रणाली एक समान तंत्र पर आधारित है । ऊतक के Phenotypic विश्लेषण-विशिष्ट पेप्टाइड-पछाड़ना और ऊतक-विशिष्ट GPCR-पछाड़ना जानवरों पेप्टाइड-GPCR संकेतन की विधा और कार्रवाई की साइट के बारे में जानकारी प्रकट कर सकते हैं । हालांकि, निष्कर्ष है कि केवल आनुवंशिक डेटा द्वारा पहुंचा जा सकता है सीमित हैं । दूसरी ओर, एक बार एक विशेष पेप्टाइड हार्मोन के ख्यात लक्ष्य नीचे एक ऊतक या कोशिका प्रकार के लिए संकुचित है, अंग explants में पूर्व vivo कैल्शियम इमेजिंग स्पष्ट के लिए अंग-अंग संचार पेप्टाइड-GPCR संकेतन द्वारा मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक Gq-युग्मित GPCR के सक्रियण पर, intracellular ca2 + एकाग्रता के कारण बढ़ जाता है ca2 + एर10से रिलीज । मस्तिष्क में, तंत्रिका सक्रियकरण भी intracellular Ca2 + स्तर तरक्की । इस तरह के ca2 + बढ़ जाती है एक कैल्शियम सेंसर, GCaMP, जो सीए2 + प्रतिदीप्ति उत्सर्जन11में जिसके परिणामस्वरूप की उपस्थिति में गठन के परिवर्तन से पता लगाया जा सकता है ।
इस आलेख में, एक कैल्शियम इमेजिंग विधि का उपयोग कर Drosophila ब्रेन explants वर्णन किया गया है । एक पेप्टाइड की क्षमता का परीक्षण करने के लिए विशिष्ट ंयूरॉंस को सक्रिय करने के लिए, एक परीक्षण पेप्टाइड GCaMP-व्यक्त मस्तिष्क explant के लिए लागू किया जाता है, और प्रतिदीप्ति परिवर्तन फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा निगरानी कर रहे हैं । GPCR की भागीदारी तो एक उत्परिवर्ती GPCR कमी मस्तिष्क का उपयोग कर एक ही परख प्रदर्शन से पुष्टि की है । इमेजिंग और आनुवंशिकी के इस संयोजन के लिए पेप्टाइड्स द्वारा अंग-अंग संचार के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है-GPCRs. संभव संशोधनों और इस प्रोटोकॉल के आवेदनों पर भी चर्चा कर रहे हैं ।
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Protocol
1. लार्वा ब्रेन Explants की तैयारी
- एक इमेजिंग चैंबर बनाओ ।
नोट: स्थिर रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है कि मस्तिष्क explants सीमित हो । यहां, एक कम लागत, हाथ से बना इमेजिंग चैंबर Ca2 + इमेजिंग प्रणाली में प्रयोग किया जाता है ।- संदंश का प्रयोग, एक प्लास्टिक संस्कृति डिश के नीचे केंद्र खरोंच (३५ मिमी x 10 मिमी) लार्वा मस्तिष्क के ventral नाड़ीग्रंथि के लिए एक सेंध बनाने के लिए बढ़ते आसान बनाने (कदम १.३, चित्रा 1) ।
- एक दंर्तखोदनी के साथ, सेंध के दोनों ओर superglue की एक छोटी सी बूंद जगह और गोंद के लिए एक टंगस्टन रॉड (०.१२५ मिमी व्यास, 6 से 7 मिमी लंबाई) देते हैं ।
- पुटी की तरह पुन: प्रयोज्य चिपकने वाला का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करना, एक परिपत्र दीवार (10 मिमी व्यास में और 3 मिमी उच्च) सेंध आसपास (चित्रा 1) बनाते हैं ।
नोट: दीवार के अंदर अंतरिक्ष बाद फॉस्फेट बफर खारा के साथ भरा जाएगा (पंजाब; ०.१४ मीटर NaCl, ०.००२७ मीटर KCl, ०.०१ एम पीओ43-, पीएच ७.४ ± ०.०५ 25 डिग्री सेल्सियस) ।
- पशु तैयारी
नोट: कैल्शियम इमेजिंग के लिए, एक कैल्शियम सूचक, GCaMP6s, ब्याज के सेल प्रकार में व्यक्त किया जाता है, जो सामान्यतः ऊतक-विशिष्ट GAL4 और यूएएस-GCaMP6sके संयोजन का उपयोग कर प्राप्त होता है. यह सुनिश्चित करने के लिए कि संकेत उंमीदवार रिसेप्टर के माध्यम से मध्यस्थता है, GCaMP6s भी रिसेप्टर में एक उत्परिवर्ती दोषपूर्ण में व्यक्त की है ।- जब जंगली प्रकार और म्यूटेंट जैसे विभिन्न पादी के लिए प्रयोगात्मक तुलना की आवश्यकता होती है, GCaMP6 अभिव्यक्ति स्तर विविधताओं और विकासात्मक चरणों के कारण शारीरिक मतभेदों से बचने के लिए आयु मैच परीक्षण लार्वा ।
- माता पिता मक्खियों रखें (प्रत्येक सेक्स के लिए 30 मक्खियों) एक संस्कृति की शीशी में 8 के लिए मानक मक्खी भोजन युक्त अंडे की अनुमति के लिए भोजन की सतह पर बिछाने । संस्कृति एक 12-एच प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत मास में 25 डिग्री सेल्सियस और 60-70% सापेक्ष आर्द्रता में लार्वा ।
- लार्वा मस्तिष्क का विच्छेदन
- अंडा बिछाने (AEL) के बाद 90-120 ज पर, लार्वा एकत्र करें और उन्हें अनुयाई भोजन के मलबे को हटाने के लिए आसुत जल के साथ कम से कम 3 बार धोएं ।
- एक वर्ग १.५ इंच देखो बर्फ ठंडे पंजाबियों से भरा गिलास पर एक लार्वा प्लेस ।
नोट: अगले दो कदम बाहर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत इस घड़ी गिलास में किया जाता है । - उपयोग संदंश धीरे लार्वा के मध्य भाग हड़पने के लिए । एक और संदंश का उपयोग करने के लिए मुंह हुक हड़पने के लिए और मुंह खींच धीरे शरीर के बाकी हिस्सों से मस्तिष्क युक्त लार्वा के पूर्वकाल हिस्सा अलग करने के लिए हुक ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, शल्य कैंची इस्तेमाल किया जा सकता है । - संदंश द्वारा पूर्वकाल टिप पकड़ो और बाहर अंदर लार्वा बारी । इस तरह के काल्पनिक डिस्क, वसा शरीर, और अंगूठी ग्रंथि के रूप में मस्तिष्क से जुड़ी बाहरी ऊतक निकालें । धीरे से मस्तिष्क को mouthparts से अलग कर ।
- लागू २०० µ एल की अंगूठी के अंदर करने के लिए इस तरह से पुटीन-पुन: प्रयोज्य चिपकने वाला इमेजिंग चैंबर में बनाया । धीरे से एक पाश्चर पिपेट में पंजाबियों के साथ विच्छेदित मस्तिष्क चूसना, और फिर यह इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरण ।
- इमेजिंग चैंबर में मस्तिष्क की स्थापना
- का प्रयोग करें संदंश मांसपेशी ventral गैंग्लिया से विस्तार फाइबर हड़पने के लिए । टंगस्टन तार के नीचे सेंध में धीरे मस्तिष्क डालें ।
- एक और संदंश का प्रयोग, टंगस्टन तार थोड़ा ऊपर खींचने के लिए इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए सही स्थिति में मस्तिष्क जगह है ।
2. Ca के अधिग्रहण2 + प्रतिदीप्ति छवियां
नोट: पंजाब में डूबे ब्रेन explants एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged हैं जो एक 20X जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस (एनए = ०.५) से सुसज्जित हैं । पंजाब मस्तिष्क में कोशिकाओं को सक्रिय नहीं करता है । यदि Z-अक्ष छवियों की आवश्यकता है, उद्देश्य लेंस एक piezoelectric-सक्रिय लेंस प्रस्तावक के साथ मुहिम शुरू की है । एक स्पिनिंग डिस्क फोकल सिर समय संकल्प को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है । कम प्रकाश इमेजिंग के लिए, एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है । GCaMP6s प्रतिदीप्ति की इमेजिंग (उत्तेजना/उत्सर्जन: 488/509 एनएम) एक dichroic बीम अलगानेवाला और एक उत्सर्जन फ़िल्टर के साथ उत्तेजना के लिए एक ४८८ एनएम लेजर की आवश्यकता है (उदा, ५२८ ± ३८ एनएम बैंड bandpass फ़िल्टर) ।
- माइक्रोस्कोप के तहत ब्रेन explant युक्त इमेजिंग चैंबर लगाएं ।
- उद्देश्य लेंस कम जब तक यह पंजाबियों को छूता है । उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत, मस्तिष्क की स्थिति और ध्यान में लाना । फ्लोरोसेंट रोशनी में स्विच और GCaMP6s-लेबल कोशिकाओं पर ध्यान समायोजित करें ।
नोट: GCaMP6s का बेसल ग्रीन प्रतिदीप्ति दिखाई देना चाहिए । - २५० ms/फ़्रेम में ५१२ × ५१२ पिक्सेल के एक प्रस्ताव पर पानी ठंडा मोड उपयुक्त अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (उदा, µ प्रबंधक) में अधिग्रहण शुरू करें । जोखिम समय को समायोजित सीसीडी कैमरे की गतिशील रेंज के भीतर प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, लेकिन कम नहीं से १००० (मनमाना इकाइयों), 16 बिट छवियों (गतिशील रेंज 0-65535) के साथ ।
नोट: कम जोखिम समय GCaMP6s के फोटो ब्लीचिंग कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जोखिम समय प्रत्येक प्रयोग में अनुकूलित किया जाना चाहिए के रूप में यह GCaMP6 की अभिव्यक्ति के स्तर और पता लगाने प्रणाली की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है । यह हमारे प्रयोग में १०० ms था dilp2 > GCaMP6s का उपयोग कर. जब z-वर्गों किसी दिए गए इमेजिंग गहराई के लिए आवश्यक हैं, तो कई z-अनुभाग छवियां एक्सपोज़र समय और फ़्रेम अंतराल के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है । यदि कैमरे में पर्याप्त स्थानिक संकल्प है, तो बिन्नी का आकार (उस चिप पर रजिस्टर की संख्या जो एक डिजिटल पिक्सेल में बिन्नी को दी जाएगी) एक्सपोज़र समय को कम करने के लिए बढ़ाई जानी चाहिए । - एक बार इमेजिंग पैरामीटर निर्धारित कर रहे हैं, के लिए 1 मिनट के लिए छवियों लेने से पहले पेप्टाइड प्रशासन आधारभूत संकेत तीव्रता का पता लगाने के लिए (एफ0).
- परीक्षण पेप्टाइड लागू करें; इस के लिए, पंजाब में पेप्टाइड समाधान के १०० µ एल भंग और यह सीधे लार्वा स्नान में एक इष्टतम एकाग्रता उपज पिपेट ।
नोट: पेप्टाइड समाधान धीरे इंजेक्ट किया जाना चाहिए (उदा, एक पिपेट का उपयोग कर स्नान समाधान में प्रवाह दर 20 µ एल/ पंजाबियों में घुल रहे सिंथेटिक पेप्टाइड को नकारात्मक नियंत्रण के तौर पर इस्तेमाल किया जाता है । - कुछ मिनट के लिए GCaMP6s उत्सर्जन रिकॉर्ड ।
3. डेटा विश्लेषण
नोट: इमेजिंग डेटा ImageJ के साथ ऑफ़लाइन विश्लेषण कर रहे हैं । समय-चूक इमेजिंग के दौरान, pipetting लार्वा मस्तिष्क को स्थानांतरित करने के लिए कारण बनता है । इसलिए, धारावाहिक छवियों के स्थान का वाकया विश्लेषण से पहले सही किया जाना चाहिए । सुधार एक ImageJ प्लग में, TurboReg के रूप में इस प्रकार का उपयोग किया जा सकता है ।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और संदर्भ छवि के रूप में पहले फ़्रेम (पेप्टाइड अनुप्रयोग से पहले) का उपयोग करें ।
- चुनें Plugins । पंजीकरण । TurboReg।
- स्रोत और लक्ष्यके रूप में संदर्भ छवि के रूप में सीरियल छवि फ़ाइल चुनें ।
- जांच कठोर शरीर (समानांतर विस्थापन और छवियों के रोटेशन) और सटीक ("फास्ट" मोटे लेकिन तेजी से विश्लेषण के बजाय प्रसंस्करण विधि और गुणवत्ता के लिए, क्रमशः है) ।
- छवि संसाधन प्रारंभ करने के लिए बैच क्लिक करें ।
- विश्लेषण का उपयोग करके ब्याज (ROIs) के कई क्षेत्रों का चयन करें । उपकरण । ImageJ में रॉय प्रबंधक ।
- अधिक क्लिक करके पिक्सेल तीव्रता को मापने के । बहु उपाय | रॉय प्रबंधक विंडो में ठीक है ।
- ΔF/f0 = (f-f0) का परिकलन करें0, जहां एफ उत्तेजना के समय रॉय तीव्रता है, और एफ0 एक समय खिड़की पर तीव्रता है तुरंत एक विशेष प्रयोगात्मक घटना से पहले (जैसे, 30 फ्रेम पूर्ववर्ती उत्तेजना शुरुआत) ।
- दोहराने प्रयोग एकाधिक मस्तिष्क के नमूनों का प्रयोग, सांख्यिकीय प्रसंस्करण का आयोजन करने का मतलब है और हर समय बिंदु पर (SEM) के मानक त्रुटि प्राप्त करते हैं ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, मस्तिष्क इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं के सक्रियण (IPCs) पेप्टाइड हार्मोन, CCHa2 द्वारा, की जांच की गई । जंगली प्रकार के मस्तिष्क के IPCs dilp2-GAL412 (dr. Rulifson से एक उपहार) और यूएएस-GCaMP6s13 (डॉ किम से एक उपहार) के संयोजन का उपयोग GCaMP6s के साथ लेबल थे । लार्वा ब्रेन explants एक सिंथेटिक CCHa2 पेप्टाइड के साथ इलाज किया गया, और GCaMP6s से प्रतिदीप्ति वास्तविक समय में दर्ज किया गया था । इस प्रयोग में, छवियों को एक ही फोकल विमान से प्राप्त किया गया । प्रत्येक IPC क्लस्टर में लगभग 14 कक्ष14, और 3 से 6 कक्षों के संकेतों का पता लगाया गया है । GCaMP6s संकेत तीव्रता नाटकीय रूप से CCHa2 प्रशासन पर बढ़ गया था (चित्रा 2एक, फिल्म 1) । जंगली प्रकार के दिमाग Ghrelin या Nociceptin (फिल्म 2 और 3, क्रमशः), जो एक Drosophila homologue के बिना स्तनधारी पेप्टाइड हार्मोन हैं के लिए एक स्पष्ट प्रतिक्रिया नहीं दिखा । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि CCHa2 द्वारा IPCs के मनाया सक्रियण CCHa2 के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया है । स्पष्ट है कि CCHa2 CCHa2-r के माध्यम से कार्य करता है, एक ही विश्लेषण CCHa2-r उत्परिवर्ती दिमाग का उपयोग कर आयोजित किया गया । संकेत तीव्रता में कोई ऐसी वृद्धि उत्परिवर्ती दिमाग (फिल्म 4) में CCHa2 प्रशासन के बाद मनाया गया था । सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला कि जंगली प्रकार और CCHa2-आर उत्परिवर्ती दिमाग के बीच संकेत तीव्रता में अंतर CCHa2 आवेदन के बाद 2 मिनट के भीतर महत्वपूर्ण हो गया और कम से 7 मिनट (चित्रा 2बी) के लिए बनाए रखा गया था । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि IPCs विशेष रूप से CCHa2-R के माध्यम से CCHa2 द्वारा सक्रिय हैं । इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी पेप्टाइड्स पंजाब से पतला थे 10 के एक अंतिम एकाग्रता उपज-9 एम ।
चित्र 1 . इमेजिंग चैंबर
(क) संस्कृति पकवान (३५ मिमी x 10 मिमी) एक छोटे से सेंधा और tethering रॉड के साथ. (ख) अंगूठी के आकार की दीवार की तरह उपयोग करने योग्य चिपकने वाला पुटीन से बना । (ग) इमेजिंग चैंबर में एक लार्वा ब्रेन explant डाला गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . लार्वा ब्रेन explant की कैल्शियम इमेजिंग
वन्य-प्रकार (dilp2-Gal4/यूएएस-GCaMP6s) मस्तिष्क CCHa2, Ghrelin, और Nociceptin के संपर्क में था । CCHa2-r उत्परिवर्ती (dilp2-Gal4, CCHa2-rताल-३४/यूएएस-GCaMP6s, CCHa2-rताल-३४) मस्तिष्क CCHa2 के संपर्क में था । IPCs में GCaMP6s संकेतों को फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा २५० ms/फ्रेम में पाया गया । अभी भी चयनित समय बिंदुओं की छवियां (A) में दिखाई जाती हैं । छवियों को बेहतर अलग संकेत तीव्रता कल्पना pseudocolored थे । ΔF/F0 प्रत्येक समय बिंदु (B) में प्लॉट किया गया था । ΔF/F0 5 से 10 विभिंन तैयारियों की गणना की गई थी । ROIs सेल निकायों कि एक ही फोकल विमान में पाया गया पर सेट किया गया । ठोस लाइनें 5 से 10 नमूनों के माध्य को इंगित करती हैं, और डॉटेड रेखाएं माध्य की मानक त्रुटि की ऊपरी और निचली सीमाएं चिह्नित करते हैं । छायांकित क्षेत्र प्रयोगों में संकेतों की भिन्नता का संकेत देते हैं. स्केल बार ५० µm इंगित करता है । यह आंकड़ा सानो एट अल से अनुकूलित है । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चलचित्र 1. वंय-प्रकार IPCs उजागर करने के लिए CCHa215 कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
चलचित्र 2. वंय-प्रकार IPCs उजागर करने के लिए Ghrelin15 कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
चलचित्र 3. वंय-प्रकार IPCs उजागर करने के लिए Nociceptin15 कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
चलचित्र 4. CCHa2-R उत्परिवर्ती IPCs उजागर करने के लिए CCHa2 15 कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
Ca2 + इमेजिंग विधि यहां वर्णित मस्तिष्क में हार्मोन के समारोह के परीक्षण के लिए एक उपयोगी प्रणाली है । vivo में, मस्तिष्क विभिन्न स्रावी अंगों से हार्मोन प्राप्त करता है । इसके अलावा, मस्तिष्क लगातार संवेदी जानकारी है, जो सहज न्यूरॉन सक्रियण का कारण बनता है आरोही मानता है । इस पूर्व vivo प्रणाली इस तरह के शोर को समाप्त और vivo इमेजिंग में से एक बेहतर संकेत/ इस प्रणाली में, अणुओं अकेले या संयोजन में परीक्षण किया जा सकता है । पेप्टाइड हार्मोन के अलावा, किसी भी पानी में घुलनशील अणुओं, प्राकृतिक या सिंथेटिक यौगिकों सहित, मस्तिष्क explant के लिए लागू किया जा सकता.
सीए2 + इमेजिंग के लिए, मस्तिष्क explants सीमित होने की जरूरत है । इस प्रयोजन के लिए, एक जेल मैट्रिक्स कम पिघल बिंदु agarose या फाइब्रिन से बना पहले16,17इस्तेमाल किया गया है । इन जेल मैट्रिक्स नमूना छुरा पकड़ कर सकते हैं, तथापि, ऊतकों को 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म कर रहे हैं । इस तापमान poikilothermic जानवरों जैसे कीड़ों में एक गर्मी सदमे प्रतिक्रिया का कारण बनता है । गर्मी तनाव से बचने के लिए, मस्तिष्क शारीरिक रूप से सीमित किया जा सकता है । मस्तिष्क छल्ली से जुड़ा कीट पिन के साथ बांध रहे हैं18. एक टंगस्टन तार का उपयोग कर हमारे विधि नमूना के सरल और स्थिर पकड़े प्रदान करता है । इस प्रणाली को तैयार करने और पुन: प्रयोज्य आसान है, और उत्तेजक लक्ष्य कोशिकाओं को और अधिक आसानी से जेल embedding विधि की तुलना में पहुंचने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, यह ligand स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
फ्लोरोसेंट संकेतक का चुनाव लक्ष्य न्यूरॉन्स के प्रकार पर निर्भर करता है, न्यूरॉन में व्यक्त रिसेप्टर्स के प्रकार, और जैविक सवालों को संबोधित किया जा रहा. विभिंन अस्थाई Ca2 + गतिशीलता का पता लगाने के लिए अनुकूलित GCaMP6 वेरिएंट की एक श्रृंखला13उत्पंन किया गया है । विशेष रूप से, GCaMP6 वेरिएंट उनके जवाब कैनेटीक्स में अलग: GCaMP6s (धीमा), GCaMP6m (मध्यम), और GCaMP6f (फास्ट). GCaMP6s और 6m के लिए क्षय बार अपेक्षाकृत धीमी है (यानी, τ1/2 के बाद 10 एक हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी में कार्रवाई की क्षमता) जबकि GCaMP6f के लिए तेजी से है (τ1/2 के बाद 1 कार्रवाई की क्षमता) । उपलब्ध फ्लोरोसेंट संकेतकों के अंय प्रकार के तंत्रिका गतिविधि के लिए EPAC-शिविर (कैंप), Synapto-pHluorin (synaptic जारी), और ArcLight (झिल्ली संभावित)19,20,21शामिल हैं । इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संकेतकों विशिष्ट कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है । इस प्रकार, पूर्व vivo इमेजिंग प्रणाली वांछित ंयूरॉंस में विभिंन प्रतिक्रियाओं का पता लगा सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, बाहरी ऊतकों मस्तिष्क से हटाया जाना चाहिए एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए । तेज संदंश और सर्जिकल कैंची के प्रयोग से नाजुक काम में आसानी होती है. दूसरा, विच्छेदित मस्तिष्क की स्थिति में स्थिर होना चाहिए । कभी कभार, मस्तिष्क नमूना थोड़ा pipetting से चलता है (रेंज लगभग 5 µm). मस्तिष्क को हिलने से रोकने के लिए इमेजिंग चैंबर में टंगस्टन वायर की ऊंचाई को ब्रेन सैंपल के आकार में समायोजित किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, एक गुरुत्वाकर्षण फ़ीड छिड़काव प्रणाली कोमल उत्तेजना के लिए स्थापित किया जा सकता है । तीसरा, मस्तिष्क इमेजिंग के परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । मस्तिष्क को लागू ligand अप्रत्याशित ंयूरॉंस को उत्तेजित हो सकता है, जो बदले में लक्ष्य ंयूरॉंस को सक्रिय कर सकता है । विशिष्ट ंयूरॉंस पर एक हार्मोन के प्रत्यक्ष प्रभाव का पता लगाने के लिए, रिसेप्टर targetneurons में नीचे खटखटाया जाना चाहिए । इस मामले में, फ्लोरोसेंट सूचक की अभिव्यक्ति रिसेप्टर RNAi Gal4/यूएएस प्रणाली का उपयोग कर के साथ जोड़ा जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल की एक छोटी सी सीमा है कि इमेजिंग की अवधि मस्तिष्क के नमूने के अंतिम क्षति के कारण सीमित है । हमारे हाथ में, Drosophila मस्तिष्क के लिए लगभग ६० इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर मिनट के लिए imaged किया जा सकता है । इस तरह के Hemolymph के रूप में 3.1 खारा22, और लेजर तीव्रता दीर्घकालिक इमेजिंग सक्षम सकता है जैसे समाधान, । इसके अलावा, वर्तमान इमेजिंग सेटअप एक ही नमूने के दोहराव उत्तेजना के लिए उपयुक्त नहीं है । ऐसे प्रयोगों के लिए, एक छिड़काव स्नान किया जा सकता है ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल विभिंन अनुप्रयोगों है । इमेजिंग चैंबर को संशोधित करके, वयस्क मस्तिष्क और अन्य Drosophila ऊतकों या अन्य जानवरों के ऊतकों छवि हो सकता है. गैर-मॉडल जीवों में आनुवांशिक साधनों की कमी ने जीनोम में फ्लोरोसेंट संकेतकों का परिचय देना मुश्किल कर दिया है. हालांकि, हाल ही में विकसित CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन तकनीक इन जानवरों में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए दरवाजे खोल दिया है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जानवरों की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर अंग संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस कार्य को JSPS (हिरोशी Ishimoto, हिरोको सानो), एक Inamori फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट (HI) के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (15K07147, 17K07419) के लिए अनुदान-इन-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, और विकास चिकित्सा के लिए संयुक्त उपयोग/अनुसंधान केंद्र के कार्यक्रम में आण्विक भ्रूणविज्ञान और आनुवंशिकी संस्थान, कुमामोटो विश्वविद्यालय (एच एस के लिए) । हम डॉ Azusa Kamikouchi और श्री दाइची यामादा इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने में उनकी मदद के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
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