Summary
Dette dokumentet beskriver en protokoll for ex vivo kalsium bildebehandling i Drosophila hjernen. I denne metoden, kan naturlige eller syntetiske forbindelser brukes til buffer teste deres evne til å aktivere bestemte nerveceller i hjernen.
Abstract
Orgel-til-orgel kommunikasjon av endokrine signalnettverk, for eksempel er fra periferien til hjernen, avgjørende for å opprettholde homeostase. Som en modell dyr for endokrine forskning, blir Drosophila melanogaster, som har sofistikerte genetisk verktøy og genom informasjon, stadig mer brukt. Denne artikkelen beskriver en metode for kalsium avbilding av Drosophila hjernen explants. Dette gjør påvisning av direkte signalene av et hormon til hjernen. Det er kjent at mange peptidhormonene handle gjennom G-protein-kombinert reseptorer (GPCRs), som aktivisering forårsaker en økning i intracellulær Ca2 +konsentrasjon. Nevrale aktivisering hever også intracellulær Ca2 + nivåer, fra Ca2 + tilstrømningen og utgivelsen av Ca2 + lagret i det endoplasmatiske retikulum (ER). En kalsium sensor, GCaMP, kan overvåke disse Ca2 + endringene. Denne metoden GCaMP uttrykkes i nervecellene i interesse, og GCaMP-uttrykke larver hjernen er dissekert og kultivert ex vivo. Test peptid brukes deretter hjernen explant og fluorescerende endringene i GCaMP er oppdaget bruker en roterende plate AC confocal mikroskop utstyrt med CCD kamera. Bruker denne metoden, et vannløselig molekyl kan testes og ulike mobilnettet hendelser knyttet neural aktivisering kan avbildes ved hjelp av de aktuelle fluorescerende indikatorene. Videre, ved å endre tenkelig kammeret, denne metoden kan brukes å image andre Drosophila organer eller organer i andre dyr.
Introduction
Orgel-til-orgel kommunikasjon er et evolusjonært bevarte strategi for å opprettholde homeostase å takle miljøendringer. Hos mennesker, en rekke hormoner arereleased fra endokrine kjertler i sirkulasjonen. Mange av disse hormonene målrette hypotalamus i hjernen, som regulerer metabolske prosesser og grunnleggende atferd som fôring1,2. Mange hormoner har blitt oppdaget med pattedyr modeller. Mekanismer for sine handlinger, spesielt interorgan nettverkene som de deltar, beholdes imidlertid i stor grad uklart.
Drosophila melanogaster har dukket opp som en nyttig modell for å studere orgel-til-orgel kommunikasjon. I insekter, er mange fysiologiske prosesser kontrollert av hormoner. Studier med fokus på vekst og metamorfose brukt store insekter. I disse studiene spådd fjerning eller transplantasjon av bestemte organer eksistensen av Inter orgel signalnettverk molekylene; senere, var Juvenile hormon (JH) og Prothoracicotropic hormon (PTTH) isoinokosterone biokjemisk renset3,4,5. Familien intercellulære signalnettverk peptider er antatt å være involvert i ulike fysiologiske hendelser under insekt livssyklus6,7. De fleste av disse peptider handle på G-protein-kombinert reseptorer (GPCRs), selv om de bestemte GPCRs var utgangspunktet er vanskelig å identifisere ved hjelp av konvensjonelle metoder. Utgivelsen av Drosophila hele genomet sekvens8 var gjennombrudd som aktivert identifikasjon av Drosophila bioaktive peptider basert på deres homologi til i andre insekter. I tillegg ble reseptorer for flere peptider identifisert fra GPCRs spådde i genomet bruker celle-kultur-baserte GPCR-ligand binding analyser. Deretter spådd uttrykk analyser orgel-til-orgel veier skapte disse peptider og reseptorer. Spesielt, er mange av antatte peptid reseptorer uttrykt i hjernen, tyder på at hjernen er et mål av peptid hormon9. Videre har avansert genetisk verktøyene i Drosophila bidratt til identifisering av fysiologiske roller av peptid-GPCR kombinasjoner. For eksempel aktiverer GAL4 og Meglos-baserte binære transcriptional systemer genet knockdown eller overuttrykte på en romlig og timelig kontrollert måte. GAL4, en transkripsjon faktor i gjær, binder seg til en bestemt cis-regulatoriske sekvens kalt oppstrøms aktivisering sekvens (UAS). I GAL4/UAS systemet, driver linjen inneholder vev-spesifikke eller scenen-spesifikke GAL4 uttrykk og responder linjen bærer UAS oppstrøms av genet av interesse eller konstruere å kjøre shRNA uttrykk. Meglos/LexAop er basert på en tilsvarende ordning. Fenotypiske analyser av vev-spesifikke peptid-knockdown og vev-spesifikke GPCR-knockdown dyr kan avsløre informasjon om peptid-GPCR signalering modus og stedet for handlingen. Konklusjonene som kan nås av genetisk data er imidlertid begrenset. Derimot, når antatte målet for en bestemt peptid hormon er smalere ned til en vev eller celle, benyttes ex vivo kalsium bildebehandling i organ explants til å belyse orgel-til-orgel kommunikasjon formidlet av peptid-GPCR signalering. Ved aktivering av en Gq-kombinert GPCR øker intracellulær Ca2 + konsentrasjonen grunn til utgivelsen av Ca2 + fra ER10. I hjernen hever nevrale aktivisering også intracellulær Ca2 + nivåer. Slike Ca2 + øker kan oppdages ved en kalsium sensor, GCaMP, som gjennomgår conformational endringer i nærvær av Ca2 + resulterer i fluorescens utslipp11.
En kalsium bildebehandling metode bruker Drosophila hjernen explants er beskrevet i denne artikkelen. For å teste muligheten for et peptid å aktivere bestemte nerveceller, brukes en test peptid GCaMP-uttrykke hjernen explant og fluorescens endringer overvåkes av AC confocal mikroskopi. Involvering av GPCR deretter bekreftet av utfører den samme analysen bruker en mutant hjernen mangler i GPCR. Denne kombinasjonen av bildebehandling og genetikk gir presis informasjon om orgel-til-orgel kommunikasjon av peptider-GPCRs mulige modifikasjoner og programmer i denne protokollen er også diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av larver hjernen Explants
- Gjøre en tenkelig kammer.
Merk: Stabil innspillingen krever at hjernen explants bli bundet. Her, brukes en rimelig, håndlagde tenkelig kammer i den Ca2 + tenkelig system.- Ved hjelp av pinsett, skrap midten nederst i en plast kultur parabol (35 mm x 10 mm) å lage en bulk for det ventrale ganglion av larver hjernen å gjøre montering enklere (trinn 1.3, figur 1).
- Med en tannpirker, plassere en liten dråpe superglue på hver side av bulk og fest en tungsten stang (0.125 mm diameter, 6 til 7 mm lengde) til limet.
- Bruker et lite stykke putty-lignende gjenbrukbare lim, rundt lage en sirkulær vegg (10 mm i diameter og 3 mm høy) bulk (figur 1).
Merk: Den innenfor senere fylt med fosfat bufret saltvann (PBS, 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7.4 ± 0,05 ved 25 ° C).
- Dyr forberedelse
Merk: For kalsium imaging, en kalsium indikator, GCaMP6s, er uttrykt i celle type interesse, noe som oppnås vanligvis ved hjelp av kombinasjoner av vev-spesifikke GAL4 og UAS-GCaMP6s. For å sikre at signalet er formidlet gjennom kandidat reseptor, er GCaMP6s også uttrykt i en mutant defekt i reseptoren.- Når eksperimentelle sammenligninger til ulike genotyper som wild type og mutanter, nivå alder kamp test Larvene å unngå GCaMP6 uttrykk variasjoner og fysiologiske forskjeller på grunn av utviklingsstadier.
- Vær foreldre fluer (30 fluer for hvert kjønn) kultur ampuller som inneholder standard fly mat 8 h å tillate egg-legging på overflaten av maten. Kultur larver i masse under en 12-h lys og mørke syklus ved 25 ° C og 60-70% relativ fuktighet.
- Disseksjon av larver hjernen
- På 90-120 h etter egglegging (jel), samle larver og vaske dem minst 3 ganger med destillert vann for å fjerne tilhenger matrester.
- Stedet en larve til et firkantet 1.5-tommen se glass fylt med is kaldt PBS.
Merk: De neste to trinnene er utført i denne ur glass under dissecting mikroskop. - Bruk tang til å forsiktig ta den midtre delen av Larven. Bruk en tang til å ta munnen kroker og trekke munnen kroker forsiktig for å skille den fremre delen av Larven inneholder hjernen fra resten av kroppen.
Merk: Alternativt kirurgisk saks kan brukes. - Hold fremre spissen av tang og slå Larven genseren. Fjerne overflødig vev knyttet til hjernen, som imaginal disker, fett organer og ring kjertel. Forsiktig skille hjernen fra munndelene.
- 200 µL av PBS gjelde innsiden av ringen laget av putty-lignende gjenbrukbare limet i tenkelig kammeret. Forsiktig suger dissekert hjernen med PBS i en Pasteur pipette, og deretter overføre den til tenkelig kammeret.
- Sette hjernen i tenkelig kammeret
- Bruk tang til å fange muskel fiber fra de ventrale Ganglion. Sett inn hjernen forsiktig i bulk under tungsten ledningen.
- Bruker en annen tang, trekke tungsten ledningen litt til stedet hjernen til riktig posisjon for imaging (figur 1).
2. kjøp av Ca2 + fluorescens bilder
Merk: Hjernen explants midt i PBS er avbildet med fluorescens mikroskop utstyrt med en 20 X vann nedsenking linsen (N.A. = 0,5). PBS er ikke aktivere cellene i hjernen. Hvis z bilder er nødvendig, er mål objektivet montert med en piezoelectric-aktivert linsen mover. En roterende plate AC confocal hode brukes til å forbedre tid oppløsningen. For lite lys bildebehandling, er et elektron multiplisere kostnad - sammen enheten kameraet montert på mikroskopet. Avbilding av GCaMP6s fluorescens (eksitasjon/utslipp: 488/509 nm) krever en 488-nm laser for eksitasjon med en dichroic strålen splitter og et utslipp filter (f.eks., 528 ± 38 nm bandet båndpassfilter).
- Plass tenkelig kammeret som inneholder hjernen explant under mikroskop.
- Senk målet linsen til det berører PBS. Under lyse-feltet belysning, plasser hjernen og bringe det i fokus. Bytt til lysstoffrør og Juster fokuseringen på GCaMP6s-merket cellene.
Merk: Den basal grønt fluorescensen av GCaMP6s skal vises. - Start kjøp på 250 ms/ramme med en oppløsning på 512 × 512 bildepunkter vannkjølt modus ved hjelp av riktig oppkjøpet programvare (f.eks., µManager). Justere eksponeringstiden å få fluorescens verdier innen dynamiske i CCD kamera, men ikke lavere enn 1000 (vilkårlig enheter), med 16-bits bilder (dynamikkområdet 0-65 535).
Merk: En lav eksponeringstid skal brukes til å minimere Foto-bleking av GCaMP6s. Eksponeringstid skal optimaliseres i hvert eksperiment som det avhenger uttrykk nivåene av GCaMP6 og følsomheten av gjenkjenning. Det var 100 ms i vår eksperimentet ved å bruke dilp2 > GCaMP6s. Når z-deler er nødvendig for en gitt tenkelig dybde, kan flere z-delen bilder skaffes avhengig av eksponering tid og ramme intervallene. Hvis kameraet har nok romlig oppløsning, økes binning størrelsen (antall registre på chip som vil være binned i én digital piksel) for å redusere eksponeringstid. - Når imaging parameterne bestemmes, ta bilder for 1 min før peptid administrasjon å oppdage planlagte signal intensiteter (F0).
- Bruke testen peptid; for dette, oppløse 100 µL av peptid løsning i PBS og Pipetter det direkte i larver badekaret å gi en optimal konsentrasjon.
Merk: Peptid løsningen skal injiseres sakte (f.eks, flow rate 20 µL/s) i Bad løsningen bruker en pipette. Urelaterte syntetiske peptid oppløst i PBS brukes som en negativ kontroll. - Registrere GCaMP6s utslipp i noen minutter.
3. dataanalyse
Merk: Bildebehandling data analyseres frakoblet med ImageJ. Under den tidsinnstilt bildebehandling forårsaker pipettering larver hjernen til å flytte. Derfor bør posisjonelle avvik på de serielle bildene korrigeres før analyse. Rettelsen utføres med en ImageJ plug-in, TurboReg som følger.
- Åpne analyseprogramvare og bruk det første bildet (før peptid program) som en referanse bildet.
- Velg Plugins | Registrering | TurboReg.
- Velg seriell bildefilen som kilde og referansebildet som mål.
- Sjekk Rigid kropp (parallell forskyvning og rotasjon av bilder) og nøyaktig ("Rask" er grov men rask analyse i stedet) for behandlingsmetode og kvalitet, henholdsvis.
- Klikk satsvis for å starte bildebehandlingen.
- Velg flere områder av interesse (ROIs) ved å bruke analyser | Verktøy | ROI Manager i ImageJ.
- Måle pixel intensiteten ved mer | Multi mål | OK i Avkastningen Manager-vinduet.
- Beregne ΔF/F0 = (F - F0) /F0, der F er ROI intensiteten samtidig med stimulans, og F0 er intensiteten på et tidsvindu umiddelbart før en bestemt eksperimentelle hendelse (f.eks 30 rammer før den stimulans utbruddet).
- Gjenta eksperimentet flere hjernen utvalg, utføre statistiske behandlingen for å få en median og standard feil av gjsnitt (SEM) på hvert tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker denne protokollen, ble aktivering av hjernen insulin-produserende celler (IPCs) av peptid hormon, CCHa2, undersøkt. IPCs av vill-type hjernen ble merket med GCaMP6s med en kombinasjon av dilp2 -GAL412 (en gave fra Dr. Rulifson) og UAS-GCaMP6s13 (en gave fra Dr. Kim). Larver hjernen explants ble behandlet med et syntetisk CCHa2 peptid og fluorescens fra GCaMP6s ble spilt i sanntid. I dette eksperimentet, ble bildene oppnådd fra en enkelt fokalplanet. Hver IPC klynge inneholder rundt 14 celler14, og signaler fra 3 til 6 celler ble oppdaget. GCaMP6s signalet intensiteten økt dramatisk på CCHa2 administrasjonen (figur 2A, film 1). Vill-type hjernen ikke viser et opplagt svar på Ghrelin eller Nociceptin (Movie 2 og 3, henholdsvis), som er pattedyr peptidhormonene uten en Drosophila homologue. Disse resultatene indikerer at observert aktivering av IPCs av CCHa2 er en bestemt respons til CCHa2. For å avklare om CCHa2 fungerer gjennom CCHa2-R, ble det samme analysen gjennomført ved hjelp CCHa2-R mutant hjerner. Ingen slik økning i signal intensiteten ble observert etter CCHa2 administrasjon i mutant hjernen (Movie 4). Statistisk analyse viste at forskjellen i signal intensitet mellom vill-type og CCHa2-R mutant hjernen ble betydelig innen 2 min etter CCHa2 program og ble opprettholdt i minst 7 min (figur 2B). Disse resultatene indikerer at IPCs er spesielt aktivert ved CCHa2 gjennom CCHa2-R. Alle peptider brukt i denne studien var utvannet av PBS å gi en endelig konsentrasjon av 10-9 M.
Figur 1 . Bildebehandling kammeret
(A) kultur parabol (35 mm x 10 mm) med små bulk og tethering stang. (B) ringformede vegg laget av putty-lignende gjenbrukbare lim. (C) en larver hjernen explant i tenkelig kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kalsium avbilding av larver hjernen explant
Vill-type (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) hjernen var utsatt for CCHa2, Ghrelin og Nociceptin. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) hjernen ble utsatt for CCHa2. GCaMP6s signaler i IPCs ble oppdaget av AC confocal mikroskopi på 250 ms/rammen. Fremdeles vises bilder av valgte tidspunkt i (A). Bildene var pseudocolored bedre visualisere ulike signal intensiteter. ΔF/F0 på hvert tidspunkt ble tegnet i (B). ΔF/F0 beregnet fra 5 til 10 forskjellige preparater. ROIs ble satt på cellen legemer som ble oppdaget i en samme fokalplanet. De heltrukne linjene angir gjennomsnittet av 5 til 10 prøver, og prikkete merke øvre og nedre grensene for standardfeilen til gjennomsnittet. De fargede områdene angir varianten av signalene i forsøkene. Skala bar angir 50 µm. Figuren er tilpasset fra Sano et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1. Vill-type IPCs utsatt for CCHa215 Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film 2. Vill-type IPCs utsatt for Ghrelin15 Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Filmen 3. Vill-type IPCs utsatt for Nociceptin15 Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film 4. CCHa2-R mutant IPCs utsatt for CCHa2 15 Klikk Vennligst her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Ca2 + imaging metoden beskrevet her er en nyttig for å teste funksjonen av hormoner i hjernen. I vivo, . hjernen mottar hormoner fra ulike endokrine organer. I tillegg oppfatter hjernen stadig stigende sensoriske informasjonen, som forårsaker spontan neuronal aktivisering. Dette ex vivo systemet eliminerer slik støy og gir en bedre signal/støy-forhold enn i vivo bildebehandling. I dette systemet, kan molekyler testes enkeltvis eller sammen. I tillegg til peptidhormonene, kan noen vannløselige molekyler, inkludert naturlige eller syntetiske stoffer, brukes på hjernen explant.
For Ca2 + bildebehandling må hjernen explants være bundet. For dette formålet, en gel matrise laget av lav-smeltende punkt agarose eller fibrin har vært brukt tidligere16,17. Disse gel matriser kan holde prøven stabilt, men vev er oppvarmet på over 30 ° C. Denne temperaturen forårsaker en varme sjokk respons i poikilothermic dyr som insekter. For å unngå varmestress, kan hjernen være bundet fysisk. Hjernen knyttet til cuticle er festet med insekt pins18. Våre metoden bruker en tungsten wire gir enkel og stabil holder for utvalget. Dette systemet er enkelt å lage og bruke på nytt, og lar sentralstimulerende midler for å nå målet celler lettere sammenlignet med gel innebygging metoden. Dermed vil dette være nyttig for ligand screening.
Valg av fluorescerende indikator avhenger av målet neurons, av reseptorer uttrykt i Nevron og biologiske spørsmål blir adressert. En rekke GCaMP6 varianter optimert for å oppdage ulike timelige Ca2 + dynamics har vært generert13. Spesielt GCaMP6 varianter varierer i sine svar kinetics: GCaMP6s (sakte), GCaMP6m (medium), og GCaMP6f (rask). Forfall tidene for GCaMP6s og 6m er relativt langsom (dvs., τ1/2 etter 10 action potensialer i en hippocampus skive forberedelse) mens som for GCaMP6f er rask (τ1/2 etter 1 handling potensial). Andre tilgjengelige fluorescerende indikatorer for neural aktivitet er EPAC-leiren (cAMP), Synapto-pHluorin (synaptic utgivelse) og ArcLight (membran potensial)19,20,21. Disse genetisk kodet fluorescerende indikatorene kan uttrykkes i spesifikke celletyper. Dermed kanne den ex vivo tenkelig system merker forskjellige svar i ønsket neurons.
Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Første, overflødig vev må fjernes fra hjernen til å få et klart bilde. Bruk av skjerpet tang og kirurgisk saks forenkler den skjøre arbeidet. Andre skal dissekert hjernen festes på plass. Noen ganger flytter hjernen prøven litt fra pipettering (område ca 5 µm). For å hindre hjernen i å flytte, skal høyden på tungsten ledningen i tenkelig kammeret justeres til størrelsen på hjernen prøven. En tyngdekraften-feed perfusjon system kan eventuelt installeres for mild stimulering. Tredje må resultatene av hjernen imaging tolkes med forsiktighet. Ligand brukes til hjernen kan stimulere uventet neurons, som i sin tur kunne aktivere målet neurons. For å oppdage den direkte effekten av et hormon på bestemte nerveceller, reseptoren bør være slått ned i targetneurons. I dette tilfellet kombineres uttrykk for indikatoren fluorescerende med at av reseptoren RNAi ved hjelp av Gal4/UAS-systemet.
En mindre begrensning av denne protokollen er at varigheten av imaging er begrenset på grunn av eventuell skade på hjernen utvalget. I våre hender, kan Drosophila hjernen avbildes opptil ca 60 min bruker denne protokollen. Hemolymph-lignende løsning, som HL3.1 saltvann22og laser intensiteter kan gjøre det mulig langsiktige bildebehandling. Dessuten, er det gjeldende oppsettet for imaging ikke egnet for repeterende stimulering av samme prøven. For slike eksperimenter, kan perfusjon bad brukes.
Endelig, denne protokollen har forskjellige programmer. Ved å endre tenkelig kammeret, kan voksen hjernen og andre Drosophila vev eller vev av andre dyr avbildes. I ikke-modellen organismer, har mangel på genetiske verktøy gjort det vanskelig å innføre fluorescerende indikatorer i genomet. Men har nylig utviklede CRISPR/Cas9 genomet redigeringsteknikker åpnet døren til genteknologi i disse dyrene. Denne protokollen kan dermed brukes til å studere mellom orgel signalering i en rekke dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning (15K 07147, 17K 07419) fra JSP (til Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), en Inamori Foundation forskningsstipend (å HI), og programmet i felles bruk/Research Center for utviklingsmessige medisin, på Institutt for molekylær embryologi og genetikk, Kumamoto University (til HS). Vi takker Dr. i Azusa Kamikouchi og Mr. Daichi Yamada for deres hjelp i å bruke tenkelig systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S.
- Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
