Summary
Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.
Abstract
Endokrin sinyal tarafından organ organ iletişim Örneğin, çevre beyne homeostazı korumak için çok önemlidir. Endokrin araştırma modeli hayvan, hangi genetik araçları ve genom bilgileri gelişmiş sahiptir, Drosophila melanogaster, giderek kullanılıyor. Bu makalede Drosophila beyin explants kalsiyum görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem, bir hormon beyne doğrudan sinyal algılama sağlar. İyi birçok peptid hormonlar G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), kimin harekete geçirmek artışa neden olmaktadır intrasellüler Ca2 +toplama yoluyla hareket bilinmektedir. Sinirsel harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri, Ca2 + akını ve endoplazmik retikulum (ER) depolanan Ca2 + sürümü yükseltir. Bir kalsiyum sensör, GCaMP, bu Ca2 + değişiklikleri izleyebilirsiniz. Bu yöntemde, GCaMP faiz nöronlarda ifade edilir ve GCaMP ifade larva beyin disseke ve kültürlü ex vivo. Test peptid sonra beyin explant için uygulanır ve GCaMP floresan değişiklikler CCD fotoğraf makinesi ile donatılmış dönen disk confocal mikroskop kullanarak algılanır. Bu yöntemi kullanarak, suda çözünen herhangi bir molekül test edilebilir ve sinirsel harekete geçirmek ile ilişkili çeşitli hücresel olaylar uygun floresan göstergeler kullanarak yansıma. Ayrıca, görüntüleme odası değiştirerek, bu yöntem diğer Drosophila organ veya diğer hayvanların organlarını görüntü için kullanılabilir.
Introduction
Organ organ iletişim çevresel değişiklikler ile başa çıkmak için homeostazı korumak için evrimsel korunmuş bir stratejidir. İnsanlarda, endokrin bezleri hormon arereleased çeşitli kan dolaşımı içine. Bu hormonların birçoğunu metabolik süreçleri ve1,2besleme gibi temel davranışları düzenleyen beynin hipotalamus hedef. Birçok hormon memeli modelleri kullanarak tespit edilmiştir. Ancak, kendi eylem, özellikle içinde onlar katılmak, interorgan ağlar mekanizmaları büyük ölçüde belirsiz kalır.
Drosophila melanogaster organ organ iletişim eğitim için yararlı bir model olarak ortaya çıkmıştır. Böcekler, birçok fizyolojik süreçleri hormonlar tarafından kontrol edilir. Büyüme ve metamorfoz odaklanarak erken çalışmaları büyük böcekler kullanılır. Bu çalışmalarda, kaldırma veya belirli organ nakli arası organ sinyal molekülleri varlığını tahmin; daha sonra Juvenil hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) ve Ecdysone biyokimyasal olarak saflaştırılmış3,4,5idi. Hücreler arası sinyal peptidler büyük bir ailenin böcek ömrü6,7sırasında çeşitli fizyolojik olaylara karışmış olduğu düşünülmektedir. Belirli GPCRs geleneksel yaklaşımları kullanarak tanımlamak başlangıçta zor olmasına rağmen bu peptidler çoğunu G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), hareket. Drosophila tüm genom dizisi8 yayın Drosophila biyoaktif peptidler onların Homoloji diğer böcekler içinde bulunanlara göre tanımlaması etkin atılım oldu. Ayrıca, birkaç peptidler reseptörleri hücre kültür esaslı GPCR-ligand bağlayıcı deneyleri kullanarak genom tahmin GPCRs üzerinden tespit edilmiştir. Daha sonra ifade analizleri Bu peptidler ve reseptörler tarafından elde edildi organ organ yolları öngördü. Özellikle, birçok sözde peptid reseptörlerinin beyin peptid hormonlar9uğrak bir olduğunu düşündüren beyindeki ifade edilir. Ayrıca, Drosophila gelişmiş genetik araçlarında peptid GPCR kombinasyon fizyolojik rolleri tanımlama için katkıda bulunmuştur. Örneğin, GAL4 ve LexA tabanlı ikili transkripsiyon sistemler gen nakavt veya overexpression dağınık şekilde ve geçici denetimli bir biçimde etkinleştirin. GAL4, Maya, tanımlanan bir transkripsiyon faktörü ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS) adı verilen belirli bir CIS düzenleyici dizisine bağlanır. GAL4/UAS sisteminde doku özel sürücü hattı oluşturur veya Yanıtlayıcı satır ve sahne-özel GAL4 ifade taşır UAS akıntıya karşı gen faiz veya sürücü shRNA ifade için yapı. LexA/LexAop sistem benzer bir mekanizma dayanmaktadır. Doku özgü peptid-nakavt ve doku özgü GPCR nakavt hayvanların fenotipik analizleri peptid GPCR'ın sinyal modu ve site eylem hakkında bilgi ortaya çıkarabilir. Ancak, sadece genetik veri tarafından ulaşılabilir sonuçları sınırlıdır. Öte yandan, bir kez bir belirli peptit hormon sözde hedef bir doku veya hücre türüne aşağı daralmış, organ explants Imaging ex vivo kalsiyum peptid GPCR sinyal tarafından aracılı organ organ iletişim aydınlatmak için kullanılabilir. Gq birleştiğinde GPCR harekete geçirmek, açıklaması, Ca2 + ER10nedeniyle intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu artar. Beyinde, sinir harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri yükseltir. Böyle Ca2 + artar bir kalsiyum sensör, huzurunda floresans emisyon11' kaynaklanan Ca2 + konformasyon değişiklikler geçer GCaMP tarafından tespit edilebilir.
Bu makalede, Drosophila beyin kullanarak görüntüleme yöntemi explants bir kalsiyum açıklanmıştır. Belirli nöronların harekete geçirmek bir peptid yeteneğini test etmek için bir test peptid GCaMP ifade beyin explant için uygulanır ve floresan değişiklikler confocal mikroskobu tarafından izlenir. GPCR katılımı sonra GPCR eksik bir mutant beyin kullanarak aynı tahlil gerçekleştirerek doğruladı. Bu görüntüleme ve genetik organ organ iletişim hakkında kesin bilgi peptidler tarafından sağlar-GPCRs. olası değişiklikler ve uygulamaları bu protokolün de ele alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. larva beyin Explants hazırlanması
- Bir görüntüleme odası yapmak.
Not: İstikrarlı kayıt beyin explants gergin gerekir. Burada, düşük maliyetli, el yapımı görüntüleme odası görüntüleme sistemi Ca2 + içinde kullanılır.- Forseps kullanarak, alt bölümünde ortada bulunan bir göçük montaj daha kolay (adım 1.3, Şekil 1) yapma larva beyin ventral sinir düğümü için oluşturmak için bir plastik kültür çanak (35 mm x 10 mm) kaşı.
- Bir kürdan ile yapıştırıcı küçük bir damla çukuru her iki yanına koyun ve bir tungsten çubuk (0,125 mm çap, 6-7 mm uzunluk) tutkal için ekleyebilirsiniz.
- Küçük bir parça macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı kullanarak, yapmak dairesel duvar (10 mm çapında ve 3 mm yüksek) (Şekil 1) dent çevreleyen.
Not: Duvar içinde boşluk daha sonra fosfat tamponlu tuz ile doldurulur (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M PO43 -, pH 7.4 ± 0,05 25 ° c).
- Hayvan hazırlık
Not: kalsiyum görüntüleme için sık doku özgü GAL4 ve UAS-GCaMP6sbileşimlerini kullanarak elde edilir faiz hücre tipi kalsiyum göstergesi, GCaMP6s, ifade edilir. Sinyal aday reseptör aracılı emin olmak için GCaMP6s da bir mutant reseptör içinde arızalı ile ifade edilir.- Deneysel karşılaştırmalar vahşi türü ve mutantlar gibi farklı genotip için gerekli olduğunda, maç test larva GCaMP6 ifade düzey varyasyonları ve fizyolojik farklılıklar gelişim dönemleri nedeniyle önlemek için yaş.
- Ebeveyn sinekler (30 sinekler her seks için) standart sinek gıda gıda yüzeyinde yumurta döşeme izin vermek 8 h için içeren bir kültür şişe bulundurun. 25 ° C ve 60-%70 bağıl nem bir 12-h koyu döngüsü altında kitle kültürü larvaları.
- Larva beyin diseksiyon
- 90-120 h (AEL) döşeme yumurta sonra larva toplamak ve en az 3 kez yapisan gıda enkaz kaldırmak için distile su ile yıkayın.
- Yer bir larva bir kare 1.5-inç izle cam buz soğuk PBS ile dolu.
Not: Sonraki iki adımı bu seyretmek cam diseksiyon mikroskop altında devam etmektedir. - Forseps yavaşça larva orta parçası kapmak için kullanın. Başka bir forseps ağız kanca al ve yavaşça beyin vücudun geri kalanından içeren larva ön bölümünü ayırmak için ağız kanca çekmek için kullanın.
Not: Alternatif olarak, cerrahi makas kullanılabilir. - Ön uç forseps tarafından tutun ve larva mahvedecekler. Imaginal diskler, yağ organları ve yüzük bezi gibi beyin bağlı yabancı dokuyu. Yavaşça beyin ağız ayırın.
- PBS 200 µL macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı görüntüleme odasında yapılan halka içine uygulanır. Yavaşça Pasteur pipet disseke beynine PBS ile emmek ve ardından görüntüleme odanın içine aktarın.
- Beyin görüntüleme odasına ayarlama
- Forseps kas lifleri ventral gangliyon uzanan kapmak için kullanın. Beyin yavaşça göçük altında tungsten kabloyu takın.
- Başka bir forseps kullanarak, çekme tungsten tel biraz ilâ yer beyin (Şekil 1) görüntüleme için doğru konumda.
2. Ca2 + floresans görüntüleri edinimi
Not: PBS içinde dalmış beyin explants 20 X su-daldırma objektif lens ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak yansıma (N.A. 0,5 =). PBS beyin hücrelerinde etkinleştirmez. Z ekseni görüntüleri gerekiyorsa, objektif lens piezoelektrik aktif lens nakliyeci ile monte edilir. Bir iplik disk confocal kafa zaman çözünürlüğü arttırmak için kullanılır. Düşük ışık görüntüleme için şarj kuplajlı cihaz kamera çarparak bir elektron mikroskobunun monte edilir. GCaMP6s floresan görüntüleme (uyarma/emisyon: 488/509 nm) uyarma bir dikroik ışın ayırıcı ve bir emisyon filtre ile 488-nm lazer gerektirir (Örn., 528 ± 38 nm bant bant filtre).
- Beyin explant mikroskop altında içeren görüntüleme odası yerleştirin.
- PBS dokunana dek objektif lens indirin. Alan parlak aydınlatma altında beyin getirin ve odak haline getirmek. Floresan ışık geçiş ve GCaMP6s etiketli hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.
Not: GCaMP6s bazal yeşil floresans görünür olmalıdır. - Edinme, 250 ms başlatmak/çerçeve uygun satın alma yazılımı kullanılarak su soğutmalı modunda 512 × 512 piksel çözünürlükte (Örn., µManager). CCD kamera dinamik alanı değerlerinin floresans elde, ama (rasgele adet), 1000'den daha düşük değil için pozlama süresi 16-bit görüntüleri (dinamik aralığı 0-65. 535 ') ile ayarlayın.
Not: Düşük çekim hızı fotoğraf-GCaMP6s ağartma en aza indirmek için kullanılır. GCaMP6 ifade düzeyleri ve algılama sistemi duyarlılığını bağlıdır gibi çekim hızı her deneyde optimize edilmelidir. Bizim deneme kullanarak 100 ms olduğunu dilp2 > GCaMP6s. Z-bölümler için belirli bir görüntüleme derinliği gerekli olduğunda, birkaç z-bölümü görüntü pozlama zaman ve çerçeve aralıkları bağlı olarak elde edilebilir. Kamera yeterli Uzaysal Çözünürlük varsa, çekim hızı azaltmak için binning büyüklüğü (kasalar bir dijital piksel binned yonga üzerinde sayısı) artırılmalıdır. - Bir kez görüntü parametreleri belirlenir, peptid yönetim temel sinyal yoğunluklarda (F0) tespit etmek için önce 1 dk. için görüntüleri almak.
- Test peptid uygulanır; Bunun için 100 µL PBS peptid çözümün dağıtılması ve en iyi bir konsantrasyon vermeye larva banyo hemen içine pipette.
Not: Yavaş yavaş peptid çözüm enjekte (Örneğin, akış hızı 20 µL/s) içine bir pipet kullanarak banyo çözüm. PBS içinde çözünmüş ilgisiz sentetik peptid bir negatif kontrol kullanılır. - Kayıt GCaMP6s emisyon birkaç dakika için.
3. veri analizi
Not: Görüntüleme verileri çevrimdışı ImageJ ile analiz edilir. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında taşımak larva beyin pipetting neden olur. Bu nedenle, seri görüntülerin pozisyonel aberasyonları analiz daha önce düzeltilmelidir. Düzeltme gibi bir ImageJ eklenti, TurboReg kullanarak gerçekleştirilebilir.
- Analiz yazılımı açın ve ilk kare (peptid uygulamadan önce) referans görüntü olarak kullanın.
- Eklentileri seçin | Kayıt | TurboReg.
- Seri resim dosyasının kaynak ve hedefolarak başvuru yansıması seçin.
- Katı vücut (paralel deplasman ve görüntülerin rotasyon) ve ("Hızlı" Bunun yerine hızlı analiz kaba) doğru işleme yöntemi ve kalite için sırasıyla kontrol edin.
- Toplu görüntü işleme başlamak için tıklatın.
- Analiz kullanarak ilgi (ROIs) birden fazla bölgesini seçin | Araçlar | ROI Yöneticisi ImageJ içinde.
- Piksel yoğunluğu daha tıklatarak ölçmek | Multi ölçü | Tamam ROI Yöneticisi penceresinde.
- ΔF/F0 hesaplamak = (F - F0) nereye F yatırım getirisi şiddeti uyarıcı anda ise F0 belirli bir deneysel olayından hemen önce bir zaman penceresi yoğunlukta /F0, (Örneğin, 30 kare önceki uyarıcı başlangıçlı).
- Birden fazla beyin örnekleri kullanarak, ortalama ve standart hata, her zaman bir noktada ortalamaya (SEM) elde etmek için istatistiksel işleme iletken denemeyi tekrarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralını kullanan, beyin insülin üreten hücreleri (IPCs) tarafından peptid hormon, CCHa2, aktivasyonu incelenmiştir. IPCs vahşi-türü beyin GCaMP6s ile etiketli dilp2 -GAL412 (Dr. Rulifson hediyesi) ve UAS-GCaMP6s13 (Dr. Kim hediyesi) bir birleşimini kullanarak. Larva beyin explants sentetik bir CCHa2 peptid ile tedavi edildi ve floresan GCaMP6s üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Bu deneyde, bir tek odak düzlem görüntüleri elde edilmiştir. Her IPC küme yaklaşık 14 hücreleri14içerir ve 6 hücrelere 3 sinyalleri tespit edildi. GCaMP6s sinyal yoğunluğu büyük ölçüde CCHa2 Yönetim (Şekil 2A, film 1) yükseltilmiştir. Vahşi-türü beyin açık bir tepki Grelin ya da Nociceptin belli etmedi (Film 2 ve 3, sırasıyla), Drosophila homologue olmaksızın memeli peptid hormonlar vardır. Bu sonuçlar IPCs CCHa2 tarafından gözlenen aktivasyonu CCHa2 belirli bir tepki gösteriyor. CCHa2 CCHa2-R ile davranır olup olmadığını açıklığa kavuşturmak için aynı analiz CCHa2-R mutant beyin kullanılarak yapılmıştır. Sinyal yoğunluğu içinde bir artış yok sonra mutant beyin (Movie 4) yönetiminde CCHa2 gözlendi. İstatistiksel sinyal şiddeti vahşi tipi ve CCHa2-R mutant beyin arasındaki farkı CCHa2 uygulamadan sonra 2 dk içinde önemli oldu ve en az 7 dk. (Şekil 2B) devam edildi gösterdi. Bu sonuçlar IPCs özellikle CCHa2 CCHa2-r ile etkinleştirilir gösterir Bu çalışmada kullanılan tüm peptidler PBS tarafından 10-9 M son bir konsantrasyon vermeye seyreltilmiş.
Resim 1 . Görüntüleme odası
(A) çanak (35 mm x 10 mm) küçük dent ve hayvan zinciri çubuk ile kültür. (B) halka şeklinde duvar macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcılar yaptı. (C) A larva beyin explant görüntüleme odasında takılı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Larva beyin explant kalsiyum görüntüleme
Vahşi-türü (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) beyin CCHa2, Ghrelin ve Nociceptin maruz kalmış. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) beyin CCHa2 için maruz oldu. IPCs GCaMP6s sinyalleri confocal mikroskobu 250 ms/karede tarafından tespit edildi. Hala seçili zaman puan görüntülerini (A) gösterilir. Görüntüleri daha iyi farklı sinyal yoğunluklarda görmek için pseudocolored. ΔF/F0 , her zaman bir noktada (B) çizildi. ΔF/F0 5 ila 10 farklı hazırlıkları için hesaplanır. ROIs hücre cesetlerdeki aynı odak düzlemi içinde tespit edildi kuruldu. Düz çizgiler 5-10 örnekleri ortalamasını gösterir ve ortalama, standart hata alt ve üst sınırlarını noktalı çizgiler işaretleyebilirsiniz. Gölgeli alanlar deneylerde sinyalleri varyasyonu gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm gösterir. Sano vd. adapte rakamdır 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1. Vahşi tipi IPCs için CCHa2 maruz15 lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 2. Vahşi tipli IPCs Grelin için maruz15 lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 3. Vahşi tipi IPCs için Nociceptin maruz15 lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 4. CCHa2-R mutant IPCs için CCHa2 maruz 15 lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemi Imaging Ca2 + işlev hormonların beyinde sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu. İçinde vivo, beyin hormon çeşitli endokrin organ alır. Buna ek olarak, beyin sürekli artan spontan nöronal etkinleştirme Nedenleri duyusal bilgileri algılar. Bu ex vivo sistem böyle gürültü ortadan kaldırır ve in vivo görüntüleme daha daha iyi bir sinyal/noise oranı verir. Bu sistemde moleküllerin tek başına veya birlikte test edilebilir. Peptid hormonlar yanı sıra, doğal veya sentetik bileşikler, dahil olmak üzere herhangi bir suda çözünen molekülleri beyin explant uygulanabilir.
CA2 + görüntüleme için beyin explants gergin gerekiyor. Bu amaçla, bir jel matris düşük erime noktası özel yapılan veya fibrin oldu daha önce kullanılan16,17. Bu jel matrisleri örnek stabil tutabilir, ancak, dokular, 30 ° c üzerinde ısıtılır Bu sıcaklık ısı şok yanıt böcekler gibi poikilothermic hayvanlarda neden olur. Isı stres önlemek için beynin fiziksel olarak gergin. Manikür için bağlı beyin böcek pimleri18ile bağlanır. Tungsten tel kullanarak bizim yöntem basit ve istikrarlı örneğini tutarak sağlar. Bu sistem hazırlamak kolay ve yeniden kullanılabilir ve uyarıcılar daha kolay yöntem katıştırma jel göre hedef hücreleri ulaşmak sağlar. Böylece, bu ligand tarama için faydalı olacaktır.
Floresan göstergesi seçim hedef nöronlar, nöron ve biyolojik sorular ele alınıyor ifade reseptörleri tür türüne bağlıdır. GCaMP6 türevleri çeşitli zamansal Ca2 + dynamics algılamak için en iyi duruma getirilmiş bir dizi oluşturulan13oldu. Özellikle, onların yanıt kinetik GCaMP6 türevleri farklı: GCaMP6s (yavaş), GCaMP6m (orta) ve GCaMP6f (hızlı). Çürüme kez GCaMP6s ve 6m için nispeten yavaş (i.e., τ1/2 ' den sonra 10 Aksiyon potansiyelleri hipokampal dilim hazırlık) iken bu GCaMP6f hızlı için (τ1/2 1 Aksiyon potansiyeli sonra). Sinirsel aktivite için kullanılabilir floresan göstergelerin diğer türleri EPAC-Kampı (kampı), Synapto-pHluorin (sinaptik yayın) ve ArcLight (membran potansiyeli)19,20,21içerir. Bu genetik olarak kodlanmış floresan göstergeleri belirli hücre türleri ifade edilebilir. Böylece, görüntüleme sistemi ex vivo çeşitli yanıt istenen nöronlarda algılayabilir.
Bu protokol için birkaç önemli adım vardır. İlk, yabancı dokular net bir görüntü elde etmek için beyinden kaldırılması gerekir. Bilenmiş forseps ve cerrahi makas kullanımı hassas çalışma kolaylaştırır. İkinci olarak, disseke beyin pozisyona sabit olmalıdır. Zaman zaman, beyin örnek biraz (aralığı yaklaşık 5 µm) pipetting taşır. Beyin hareket etmesini engellemek için görüntüleme odasında tungsten tel yüksekliğini beyin örnek boyutu için ayarlanmalıdır. Alternatif olarak, bir yerçekimi-besleme perfüzyon sistemi için nazik stimülasyon yüklü. Üçüncü olarak, beyin görüntüleme sonuçlarını dikkatle yorumlanmalıdır. Beyne uygulanan ligand sırayla-ebil harekete geçirmek hedef nöronlar beklenmeyen nöronlar teşvik. Bir hormon belirli nöronlar üzerinde doğrudan etkisi algılamak için reseptör çaldı targetneurons içinde aşağı. Bu durumda, floresan göstergesi ifade bu reseptör Gal4/UAS sistemini kullanarak RNAi ile kombine edilebilir.
Bu protokol küçük bir sınırlama görüntüleme süresi beyin örnek nihai hasar nedeniyle sınırlı olmasıdır. Elimizde, Drosophila beyin için yaklaşık 60 dk kadar bu iletişim kuralını kullanan yansıması. HL3.1 tuzlu22ve lazer yoğunluklarda gibi hemolymph gibi çözümü, uzun vadeli görüntüleme olanak verebilir. Buna ek olarak, geçerli görüntüleme kurulumu aynı örnek tekrarlayan uyarılması için uygun değildir. Bu tür deneyler için bir perfüzyon banyo kullanılabilir.
Son olarak, bu iletişim kuralının çeşitli uygulamalar vardır. Görüntüleme odası değiştirerek, yetişkin beyin ve diğer Drosophila doku veya diğer hayvanların doku görüntüsü. Sigara model organizmalarda genetik araçları eksikliği genom floresan göstergeleri tanıtmak zor yaptı. Ancak, son zamanlarda geliştirilen CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknikleri bu hayvanlarda genetik mühendisliği için kapıyı açtı. Böylece, bu iletişim kuralını arası organ hayvanlar geniş bir sinyal çalışma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser oldu Grants-in-Aid tarafından bilimsel araştırmalara (15 K 07147, 17 K 07419) JSP'ler üzerinden (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), bir Inamori Vakfı araştırma hibe (HI) ve ortak kullanım/Araştırma Merkezi Program gelişimsel tıp için desteklenen Enstitüsü Moleküler Embriyoloji ve genetik, Kumamoto Üniversitesi (HS için). Biz Dr Azusa Kamikouchi ve Bay Daichi Yamada görüntüleme sistemi kullanarak onların yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S.
- Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
