Summary
Dette papir beskriver en protokol for ex vivo calcium billeddannelse af hjernen, Drosophila . I denne metode, kan naturlige eller syntetiske stoffer anvendes på bufferen til at teste deres evne til at aktivere bestemte neuroner i hjernen.
Abstract
Orgel til orgel meddelelse af endokrine signaler, for eksempel er fra periferien til hjernen, afgørende for at opretholde homøostase. Som en model dyr for endokrine forskning, bliver Drosophila melanogaster, som har avancerede genetiske værktøjer og oplysninger, genom, mere og mere brugt. I denne artikel beskrives en metode for calcium billeddannelse af Drosophila hjernen explants. Denne metode giver mulighed for påvisning af den direkte signalering af en hormon til hjernen. Det er velkendt, at mange peptid hormoner handler gennem G-protein-koblede receptorer (GPCRs), hvis aktivering forårsager en stigning i den intracellulære Ca2 +koncentration. Neurale aktivering hæver også intracellulære Ca2 + niveauer, fra både Ca2 + tilstrømning og frigivelse af Ca2 + gemt i det endoplasmatiske reticulum (ER). En calcium sensor, GCaMP, kan overvåge disse Ca2 + ændringer. I denne metode, GCaMP er udtrykt i neuroner i interesse, og at udtrykke GCaMP larve hjernen er dissekeret og kulturperler ex vivo. Test peptid anvendes derefter til hjernen eksplantat, og de fluorescerende ændringer i GCaMP er fundet ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop udstyret med en CCD kamera. Du bruger denne metode, enhver vandopløselige molekyle kan testes, og forskellige cellulære hændelser i forbindelse med neurale aktivering kan være afbildet ved hjælp af de relevante fluorescerende indikatorer. Derudover ved at ændre den billeddiagnostiske afdeling, kan denne metode bruges til at afbilde andre Drosophila organer eller organer fra andre dyr.
Introduction
Orgel til orgel kommunikation er en evolutionært bevarede strategi for at opretholde homeostase for at klare miljøforandringer. Hos mennesker, en række hormoner arereleased fra de endokrine kirtler i omløb. Mange af disse hormoner målrette hypothalamus i hjernen, som regulerer metaboliske processer og grundlæggende adfærd såsom fodring1,2. Mange hormoner er opdaget ved hjælp af pattedyr modeller. Mekanismer for deres indsats, især de absorptionsprocesser netværk, som de deltager i, er dog stadig i vid udstrækning uklart.
Drosophila melanogaster fremstod som en nyttig model for at studere orgel til orgel kommunikation. I insekter, er mange fysiologiske processer kontrolleret af hormoner. Tidlige studier med fokus på vækst og metamorfose bruges store insekter. I disse undersøgelser forudsagt fjernelse eller transplantation af specifikke organer eksistensen af Inter orgel signaling molekyler; senere, var Juvenile hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) og Ecdysone biokemisk renset3,4,5. En stor familie af intercellulære signaling peptider menes at være involveret i forskellige fysiologiske begivenheder under insekt livscyklus6,7. De fleste af disse peptider handle på G-protein-koblede receptorer (GPCRs), selv om de specifikke GPCRs var i første omgang vanskeligt at identificere ved hjælp af konventionelle metoder. Offentliggørelse af Drosophila hele genomet sekvens8 var det gennembrud, der aktiverede identifikation af Drosophila bioaktive peptider baseret på deres homologi til dem, der findes i andre insekter. Derudover identificeredes receptorer for flere peptider fra GPCRs forudsagt i genomet ved hjælp af celle-kultur-baserede GPCR-ligand bindende assays. Næste, udtryk analyser forudsagde den orgel at orgel veje fremkaldes ved disse peptider og receptorer. Især udtrykkes mange af de formodede peptid receptorer i hjernen, hvilket tyder på, at hjernen er et større mål af peptid hormoner9. Desuden, de avancerede genetiske værktøjer i Drosophila har bidraget til identifikationen af fysiologiske roller af peptid-GPCR kombinationer. For eksempel, aktiverer GAL4 og LexA-baserede binære transcriptional systemer gen knockdown eller overekspression i et rumligt og tidsligt kontrolleret måde. GAL4, en transkriptionsfaktor, der er identificeret i gær, binder sig til en bestemt cis-regulerende sekvens kaldet opstrøms aktivering sekvens (UAS). I ordningen for GAL4/UAS linjen driver giver væv-specifikke eller fase-specifik GAL4 udtryk og linjen responder bærer UAS opstrøms af gen interesse eller konstruktion til at drive shRNA udtryk. LexA/LexAop system er baseret på en lignende mekanisme. Fænotypiske analyser af væv-specifikke peptid-knockdown og væv-specifikke GPCR-knockdown dyr kan afsløre oplysninger om peptid-GPCR signalering tilstand og sted i aktion. De konklusioner, der kan opnås udelukkende af genetiske data er dog begrænset. På den anden side, når den formodede mål for en bestemt peptid hormon er indsnævret til en vævs- eller type, kan ex vivo calcium imaging i orgel explants bruges til at belyse den orgel til orgel kommunikation medieret af peptid-GPCR signalering. Ved aktivering af en Gq-kombineret GPCR, er intracellulære Ca2 + koncentrationen øget på grund af frigivelsen af Ca2 + fra ER10. I hjernen hæver neurale aktivering også de intracellulære Ca2 + niveauer. Sådan Ca2 + stigninger kan påvises ved en calcium sensor, GCaMP, som gennemgår konformationelle ændringer i overværelse af Ca2 + resulterer i fluorescens emission11.
I denne artikel beskrives en calcium billedbehandling metode ved hjælp af Drosophila hjernen explants. For at teste en peptid evne til at aktivere bestemte neuroner, påføres en test peptid GCaMP-udtrykker hjerne eksplantat, og fluorescens ændringer overvåges af Konfokal mikroskopi. Inddragelse af GPCR er derefter bekræftet ved at udføre den samme analyse ved hjælp af en mutant hjernen mangler GPCR. Denne kombination af billedbehandling og Genetik giver nøjagtige oplysninger om orgel til orgel meddelelse af peptider-GPCRs. mulige ændringer og applikationer i denne protokol er også drøftet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af larve hjerne Explants
- Gøre en billeddiagnostiske afdeling.
Bemærk: Stabil optagelse kræver, at hjernen explants bindes. Her, bliver en billig, håndlavede imaging kammeret brugt i den Ca2 + imaging system.- Brug af pincet, scratch nederst i midten af en plast kultur parabol (35 mm x 10 mm) til at oprette en bule for den ventrale ganglion af larve hjernen at gøre montering nemmere (trin 1.3, figur 1).
- Med en tandstikker, placere en lille dråbe superglue på begge sider af bule og tillægger lim en wolfram stang (0,125 mm diameter, 6 til 7 mm længde).
- Ved hjælp af et lille stykke kit-lignende genanvendelige lim, omkring gør et cirkulære væg (10 mm i diameter og 3 mm høj) bule (figur 1).
Bemærk: Pladsen inde i væggen vil være senere fyldt med fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 0,14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 ved 25 ° C).
- Animalske forberedelse
Bemærk: For calcium imaging, er en indikator for calcium, GCaMP6s, udtrykt i celletype af interesse, som er almindeligt opnås ved hjælp af kombinationer af væv-specifikke GAL4 og UAS-GCaMP6s. For at sikre, at signalet er medieret gennem kandidatlande receptor, GCaMP6s kommer også til udtryk i en mutant defekt i receptor.- Når eksperimentelle sammenligninger til forskellige genotyper som vildtype og mutanter er påkrævet, alder match test larver for at undgå GCaMP6 udtryk niveau variationer og fysiologiske forskelle på grund af udviklingsstadier.
- Holde forældreorlov fluer (30 fluer for hvert køn) i en kultur hætteglas indeholdende standard flyve mad til 8 h at tillade æglægning på overfladen af maden. Kultur larver i massen under en 12-h lys-mørke cyklus på 25 ° C og 60-70% relativ luftfugtighed.
- Dissektion af larve hjernen
- På 90-120 h efter æglægning (AEL), Saml larver og vask dem mindst 3 gange med destilleret vand for at fjerne vedhængende madrester.
- Sted en larve på en firkantet 1,5-tommer ur glas fyldt med is kold PBS.
Bemærk: De næste to trin udføres i denne urglas dissekere mikroskopet. - Bruge tang til at forsigtigt fat i den midterste del af larve. Bruge en anden pincet til at gribe mund kroge og trække munden kroge forsigtigt for at adskille den forreste del af larve indeholdende hjernen fra resten af kroppen.
Bemærk: Alternativt kirurgisk saks kan bruges. - Hold den forreste spids pincet og drej larve indefra og ud. Fjern fremmed væv knyttet til hjernen, såsom fantasiens diske, fedt organer og ring kirtel. Forsigtigt adskille hjernen fra mouthparts.
- Anvende 200 µL af PBS på indersiden af ringen lavet af kit-lignende genanvendelige limen i den billeddiagnostiske afdeling. Forsigtigt suge dissekeret hjernen med PBS i Pasteur pipette, og derefter overføre det til den billeddiagnostiske afdeling.
- Indstilling af hjernen i den billeddiagnostiske afdeling
- Brug pincet til at fange muskelfibre strækker sig fra de ventrale ganglier. Indsæt hjernen forsigtigt i bule under wolfram tråd.
- Ved hjælp af en anden pincet, pull wolfram tråd lidt op til placere hjernen på den korrekte position for imaging (figur 1).
2. opnåelse af Ca2 + fluorescens billeder
Bemærk: Hjernen explants nedsænket i PBS er afbildet ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med en 20 X vand-fordybelse mål linse (N.A. = 0,5). PBS ikke aktivere celler i hjernen. Hvis z-aksen billeder er nødvendigt, er mål objektivet monteret med en piezoelektrisk-aktiveret linse mover. En roterende disk Konfokal hoved bruges til at forbedre tidsopløsning. For lav-light imaging monteret en elektron at multiplicere charge - sammen enhedens kamera på mikroskopet. Billeddannelse af GCaMP6s fluorescens (excitation/udslip: 488/509 nm) kræver en 488 nm laser for excitation med en dichroic stråledeler og en emission filter (fx., 528 ± 38 nm band bandpass filter).
- Sted imaging salen indeholdende hjernen eksplantat under mikroskop.
- Lavere mål objektivet, indtil det rører PBS. Under lysfelt belysning, Placer hjernen og bringe den i fokus. Skift til lysstofrør og justere fokus på GCaMP6s-mærket celler.
Bemærk: Den basale grønne fluorescens af GCaMP6s skal være synlige. - Start erhvervelse på 250 ms/ramme med en opløsning på 512 × 512 pixel i vandkølet tilstand ved hjælp af passende erhvervelse software (fx., µManager). Justere eksponeringstiden at få fluorescens værdier inden for det dynamiske område af CCD-kamera, men ikke lavere end 1000 (arbitrære enheder), med 16-bit billeder (dynamisk området 0-65.535).
Bemærk: En lav eksponeringstid bør bruges til at minimere foto-blegning af GCaMP6s. Eksponeringstiden bør optimeret i hvert forsøg, da det afhænger af udtryk i GCaMP6 og følsomheden af detektionssystemets. Det var 100 ms i vores eksperiment ved hjælp af dilp2 > GCaMP6s. Når z-sektioner er nødvendige for en given imaging dybde, kan flere z-afsnittet billeder erhverves afhængigt af eksponering tid og ramme intervaller. Hvis kameraet har nok rumlige opløsning, bør binning størrelse (antal registre på den jeton, som vil blive arkiveret lodret i en digital pixel) forhøjes for at reducere eksponeringstiden. - Når imaging parametre bestemmes, tage billeder i 1 minut før peptid administration at opdage baseline signal intensitet (F0).
- Anvende test peptid; for dette, opløse 100 µL af peptid løsning i PBS og afpipetteres det direkte ind i larver badet til at give en optimal koncentration.
Bemærk: Peptid løsning bør være injiceres langsomt (fx, flow hastighed 20 µL/s) i Bad løsning ved hjælp af en pipette. Ikke-forretningsmæssigt forbundne syntetiske peptid opløst i PBS bruges som en negativ kontrol. - Optage GCaMP6s emission i et par minutter.
3. dataanalyse
Bemærk: Imaging data er analyseret offline med ImageJ. Under den time-lapse imaging forårsager pipettering larve hjernen til at flytte. Positionelle aberrationer af en serie billeder bør derfor korrigeres før analyse. Korrektionen kan udføres ved hjælp af en ImageJ plug-in, TurboReg som følger.
- Åbn analyse software og bruge det første billede (før peptid ansøgning) som en henvisning image.
- Vælg Plugins | Registrering | TurboReg.
- Vælg den serielle billedfil som kilde og referenceafbildning som mål.
- Tjek Kroppen stiv (parallel forskydning og rotation af billeder) og nøjagtig ("hurtig" er groft men hurtig analyse i stedet) for den forarbejdningsmetode og kvalitet.
- Klik på Batch for at starte billedbehandling.
- Vælg flere regioner af interesse (ROIs) ved hjælp af analyser | Værktøjer | ROI Manager i ImageJ.
- Måle pixel intensitet ved at klikke på mere | Multi foranstaltning | OK i ROI Manager-vinduet.
- Beregn ΔF/F0 = (F - F0) f0, hvor F er ROI intensitet på tidspunktet for stimulien, og F0 er intensiteten på et tidsvindue umiddelbart før en bestemt eksperimentelle begivenhed (f.eks. 30 frames forud den stimulus debut).
- Gentage forsøget ved hjælp af flere hjernen prøver, foretage statistiske behandling for at få middelværdien og standardafvigelsen på middelværdien (SEM) ved hvert tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol, blev aktivering af hjernens insulin-producerende celler (IPCs) af peptid hormon, CCHa2, undersøgt. IPCs vildtype hjerne var mærket med GCaMP6s ved hjælp af en kombination af dilp2 -GAL412 (en gave fra Dr. Rulifson) og UAS-GCaMP6s13 (en gave fra Dr. Kim). Larve hjernen explants blev behandlet med en syntetisk CCHa2 peptid, og fluorescens fra GCaMP6s blev indspillet i realtid. I dette eksperiment stammer billeder fra en enkelt fokalplan. Hver IPC klynge indeholder omkring 14 celler14, og signaler fra 3 til 6 celler blev opdaget. GCaMP6s signal intensitet øgedes dramatisk efter CCHa2 administration (figur 2A, film 1). Wild-type hjerner ikke udviste et klart svar på Ghrelin eller Nociceptin (Movie 2 og 3, henholdsvis), som er pattedyr peptid hormoner uden en Drosophila homolog. Disse resultater viser, at den observerede aktivering af IPCs af CCHa2 er et specifikt svar på CCHa2. For at afklare, om CCHa2 fungerer gennem CCHa2-R, blev den samme analyse foretaget ved hjælp af CCHa2-R mutant hjerner. Ingen sådanne forøgelse af signal intensitet blev observeret efter CCHa2 administration i mutant hjerner (Movie 4). Statistisk analyse viste, at forskellen i signal intensitet wild-type og CCHa2-R mutant hjerner blev betydelig indenfor 2 min efter CCHa2 ansøgning og blev opretholdt i mindst 7 min. (figur 2B). Disse resultater viser, at IPCs specifikt aktiveres af CCHa2 gennem CCHa2-R. Alle peptider anvendes i denne undersøgelse blev fortyndet med PBS til at give en slutkoncentration på 10-9 M.
Figur 1 . Imaging kammer
(A) kultur parabol (35 mm x 10 mm) med en lille bule og tethering stang. (B) Ring-formet væg lavet af kit-lignende genanvendelige klæbemidler. (C) en larve hjernen eksplantat indsat i den billeddiagnostiske afdeling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Calcium billeddannelse af larve hjernen eksplantat
Wild-type (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) hjerne var udsat for CCHa2, Ghrelin og Nociceptin. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) hjerne var udsat for CCHa2. GCaMP6s signaler i IPCs blev opdaget af konfokalmikroskopi på 250 ms/ramme. Stadig vises billeder af udvalgte tidspunkter i (A). Billederne var pseudocolored bedre visualisere forskellige signal intensiteter. ΔF/F0 på hvert tidspunkt var afbildet i (B). ΔF/F0 blev beregnet fra 5 til 10 forskellige præparater. ROIs var indstillet på celle organer, der blev fundet i en samme fokalplan. De ubrudte linjer angiver en middelværdi for 5-10 prøver, og de stiplede linjer markere øvre og nedre grænser for standardafvigelsen på middelværdien. De skyggelagte områder viser variationen af signaler i eksperimenter. Skalalinjen angiver 50 µm. Tallet er tilpasset fra Sano et al. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Wild-type IA'er udsat for CCHa215 venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2. Wild-type IA'er udsat for Ghrelin15 venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Film 3. Wild-type IA'er udsat for Nociceptin15 venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 4. CCHa2-R mutant IPCs udsat for CCHa2 15 Klik venligst her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Af Ca2 + imaging metode beskrevet her er en nyttig system for at teste funktionen af hormoner i hjernen. In vivo hjernen modtager hormoner fra forskellige endokrine organer. Derudover opfatter hjernen konstant stigende sensorisk information, som forårsager spontan neuronal aktivering. Denne ex vivo system eliminerer sådanne støj og giver et bedre signal/støj-forhold end i vivo billeddannelse. I dette system, kan molekyler testes enkeltvis eller i kombination. Ud over peptid hormoner, kan enhver vandopløselige molekyler, herunder naturlige eller syntetiske stoffer, anvendes til hjernen eksplantat.
For Ca2 + imaging skal hjernen explants bindes. Til dette formål, en gel matrix lavet af lav-smeltende punkt Agarosen eller fibrin har været anvendt tidligere16,17. Disse gel matricer kan holde prøven stabilt, men væv er opvarmet til over 30 ° C. Denne temperatur medfører en heat shock-responsen i koldblodede dyr som insekter. For at undgå varmestress, kan hjernen bindes fysisk. Hjernen knyttet til neglebånd er fastgjort med insekt pins18. Vores metode benytter en wolfram tråd giver enkel og stabil opbevaring af prøven. Dette system er let at tilberede og kan genbruges, og tillader stimulanser for at nå målet celler mere let sammenlignet med gel indlejring metode. Dette vil således nyttigt for ligand screening.
Valget af fluorescerende indikator afhænger af typen af target neuroner, receptorer udtrykt i neuron og de biologiske forespørgsler type. En serie af GCaMP6 varianter optimeret til påvisning af forskellige tidsmæssige Ca2 + dynamics er blevet genereret13. Især GCaMP6 varianter adskiller sig i deres svar kinetik: GCaMP6s (langsom), GCaMP6m (medium), og GCaMP6f (hurtig). Henfald gange for GCaMP6s og 6m er relativt langsom (dvs., τ1/2 efter 10 handling potentialer i en hippocampus skive forberedelse), mens der for GCaMP6f er hurtig (τ1/2 efter 1 aktionspotentialet). Andre typer af tilgængelige fluorescerende indikatorer for neurale aktivitet omfatter EPAC-cAMP (cAMP), Synapto-pHluorin (synaptic release) og ArcLight (membran potentiale)19,20,21. Disse genetisk kodet fluorescerende indikatorer kan udtrykkes i specifikke celletyper. Således, den ex vivo imaging system kan opdage forskellige svar i ønskede neuroner.
Der er flere vigtige skridt i denne protokol. Første, fremmed væv skal fjernes fra hjernen til at opnå et klart billede. Anvendelse af kirurgisk saks og skærpet pincet letter det delikate arbejde. For det andet bør dissekeret hjernen fastsættes i position. Lejlighedsvis, flytter hjernen prøve lidt fra pipettering (rækkevidde ca 5 µm). For at forhindre hjernen i bevægelse, bør være tilpasset højden af wolfram tråd i den billeddiagnostiske afdeling hjernen Stikprøvens størrelse. Alternativt kunne en gravity-feed perfusion system installeres for blid stimulation. For det tredje, resultaterne af brain imaging bør fortolkes med forsigtighed. Ligand anvendes til hjernen kan stimulere uventet neuroner, som til gengæld kunne aktivere target neuroner. For at påvise den direkte virkning af et hormon på specifikke neuroner, receptoren bør være slået ned i targetneurons. I dette tilfælde kan udtryk for den fluorescerende indikator kombineres med de receptor RNAi ved hjælp af Gal4/UAS system.
En mindre begrænsning i denne protokol er, at varigheden af imaging er begrænset på grund af eventuel beskadigelse af hjernen prøven. I vores hænder, kan være afbildet Drosophila -hjernen op til ca. 60 min. ved hjælp af denne protokol. Hemolymph-lignende løsning, som HL3.1 saltvand22, og laser intensiteter kan give langsigtede billeddannelse. Desuden, er den aktuelle imaging opsætning ikke egnet til gentagne stimulation af den samme prøve. For sådanne eksperimenter, kunne en perfusion bad bruges.
Endelig, denne protokol har forskellige applikationer. Ved at ændre den billeddiagnostiske afdeling, kan være afbildet i den voksne hjerne og andre Drosophila væv eller væv af andre dyr. I ikke-model organismer gjorde manglen genetiske værktøjer det vanskeligt at indføre fluorescerende indikatorer i genomet. Imidlertid har for nylig udviklede CRISPR/Cas9 genom redigering teknikker åbnet døren for genteknologi i disse dyr. Denne protokol kan således bruges til at studere Inter orgel signalering i en bred vifte af dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (15K 07147, 17K 07419) fra JSP'ER (til Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), en Inamori Foundation forskning tilskud (til HI), og programmet for det fælles forbrug/Research Center for udviklingsmæssige medicin, på Institut for Molekylær embryologi og genetik, Kumamoto Universitet (til HS). Vi takker Dr. Azusa Kamikouchi og Mr. Daichi Yamada for deres hjælp i ved hjælp af billedbehandling system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
