Summary
Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.
Abstract
Orgel-naar-orgel communicatie door endocriene signalering, bijvoorbeeld is vanuit de periferie naar de hersenen, essentieel voor het behoud van homeostase. Als een dier model voor endocriene onderzoek, wordt Drosophila melanogaster, die heeft verfijnde genetische hulpmiddelen en genoominformatie, steeds meer ingezet. Dit artikel beschrijft een methode voor de calcium-beeldvorming van Drosophila hersenen explantaten. Deze methode kan de detectie van de directe signalering van een hormoon aan de hersenen. Het is algemeen bekend dat vele peptide hormonen via de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs) handelen, wiens activering een verhoging van de intracellulaire Ca2 +concentratie veroorzaakt. Neurale activering verheft ook intracellulaire Ca2 + niveaus, variërend van zowel Ca2 + toestroom en de vrijlating van Ca2 + opgeslagen in het endoplasmatisch reticulum (ER). Een calcium-sensor, GCaMP, kan deze Ca2 + wijzigingen controleren. Bij deze methode GCaMP wordt uitgedrukt in de neuronen van belang, en de GCaMP-uiten larvale hersenen is ontleed en gekweekte ex vivo. De test-peptide wordt vervolgens toegepast op de hersenen explant, en de fluorescerende wijzigingen in GCaMP worden gedetecteerd met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop uitgerust met een CCD-camera. Met behulp van deze methode, een in water oplosbare molecuul kan worden getest, en verschillende cellulaire gebeurtenissen die zijn gekoppeld aan de neurale activering kunnen worden beeld met behulp van de passende fluorescerende indicatoren. Bovendien, door aanpassing van de beeldvorming kamer, deze methode kan worden gebruikt om het imago van de organen van andere Drosophila of de organen van andere dieren.
Introduction
Mededeling van de orgel-naar-orgel is een evolutionair geconserveerde strategie voor het behoud van de homeostase om te gaan met veranderingen in het milieu. Bij de mens, een scala aan hormonen arereleased van de endocriene klieren in de circulatie. Veel van deze hormonen richten de hypothalamus van de hersenen, die regelt metabole processen en fundamentele gedrag zoals het voederen van1,2. Veel hormonen hebben ontdekt met behulp van zoogdieren modellen. Nochtans, de mechanismen van hun optreden, met name de interorgan netwerken waaraan zij deelnemen, grotendeels onduidelijk blijven.
Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een nuttig model voor het bestuderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel. Bij insecten, worden veel fysiologische processen gecontroleerd door hormonen. Vroege studies gericht op groei en metamorfose gebruikt grote insecten. In deze studies voorspelde de verwijdering of transplantatie van specifieke organen het bestaan van Inter orgel signalering moleculen; later, waren Juvenile hormoon (JH), Prothoracicotropic hormoon (PTTH) en Ecdysone biochemically gezuiverde3,4,5. Een grote familie van intercellulaire signalering peptiden wordt gedacht te worden betrokken bij diverse fysiologische evenementen tijdens de levenscyclus van de insecten6,7. De meeste van deze peptides handelen op de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs), hoewel de specifieke GPCRs in eerste instantie moeilijk waren te identificeren met behulp van conventionele benaderingen. De publicatie van de Drosophila hele genoom reeks8 was de doorbraak die de identificatie van Drosophila bioactieve peptiden op basis van hun homologie met die gevonden in andere insecten ingeschakeld. Daarnaast werden de receptoren voor verschillende peptides geïdentificeerd van GPCRs voorspeld in het genoom met behulp van cel-cultuur-gebaseerde GPCR-ligand bindende analyses. Vervolgens voorspelde expressie analyses de orgel-naar-orgel trajecten ontlokte door deze peptiden en de receptoren. Met name worden veel van de vermeende peptide receptoren uitgedrukt in de hersenen, wat suggereert dat de hersenen een belangrijk doelwit van peptide hormonen9 is. Bovendien hebben de geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila bijgedragen tot de identificatie van fysiologische functies van peptide-GPCR combinaties. Bijvoorbeeld, inschakelen de GAL4 en de LexA gebaseerde binaire transcriptionele systemen gene knockdown of overexpressie in een ruimtelijk en tijd gecontroleerde manier. GAL4, een transcriptiefactor geïdentificeerd in gist, bindt aan een specifieke cis-regulerende opeenvolging Upstream activering sequentie (UAS) genoemd. In de GAL4/UAS-systeem, de driver regel biedt weefsel-specifieke of expressie van fase-specifieke GAL4 en de responder-lijn draagt UAS stroomopwaarts van het gen van belang of de constructie op station shRNA expressie. LexA/LexAop systeem is gebaseerd op een soortgelijk mechanisme. Fenotypische analyse van weefsel-specifieke peptide-knockdown en weefsel-specifieke GPCR-knockdown dieren kunnen onthullen informatie over de peptide-GPCR signalering modus en werkplek waar de activiteiten. De conclusies die bereikbaar uitsluitend per genetische gegevens zijn echter beperkt. Aan de andere kant, zodra het vermeende doelwit van een bepaalde peptide hormonen is teruggebracht tot een type weefsels of cellen, kan ex vivo calcium beeldvorming in orgel explantaten worden gebruikt voor het ophelderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel gemedieerd door peptide-GPCR signalering. Bij het activeren van een GPCR Gq-combinatie, wordt de intracellulaire Ca2 + concentratie verhoogd door de vrijval van Ca2 + van de ER10. In de hersenen verheft de neurale activering ook de intracellulaire Ca2 + niveaus. Dergelijke Ca2 + verhogingen kunnen worden gedetecteerd door een calcium-sensor, GCaMP, die conformationele veranderingen in aanwezigheid van Ca2 + resulterend in fluorescentie emissie11ondergaat.
In dit artikel wordt een calcium beeldvorming methode met behulp van Drosophila hersenen explants beschreven. Om te testen op het vermogen van een peptide te activeren van specifieke neuronen, een test-peptide wordt toegepast op de GCaMP-uiten hersenen explant, en fluorescentie wijzigingen worden gecontroleerd door confocale microscopie. De betrokkenheid van de GPCR wordt vervolgens bevestigd door het uitvoeren van de dezelfde bepaling met behulp van een mutant hersenen ontbreekt de GPCR. Deze combinatie van beeldvorming en genetica biedt nauwkeurige informatie over de mededeling van de orgel-naar-orgel door peptiden-GPCRs. mogelijke modificaties en toepassingen van dit protocol worden ook besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van larvale hersenen explantaten
- Het maken van een imaging kamer.
Opmerking: Stabiele opname vereist dat de hersenen explantaten worden aangebonden. Hier, een goedkope, handgemaakte imaging expositiekamer gebruik wordt gemaakt in de Ca2 + imaging systeem.- Met behulp van Tang, kras midden onder in een schotel van kunststof cultuur (35 x 10 mm) te maken van een deuk voor het ventrale ganglion van de larvale hersenen waardoor montage eenvoudiger (stap 1.3, Figuur 1).
- Met een tandenstoker, plaats een kleine daling van superlijm aan weerszijden van de deuk en een staaf van wolfraam (0,125 mm diameter, 6 tot 7 mm lang) hechten aan de lijm.
- Met behulp van een klein stukje van putty-achtige herbruikbare lijm, rondom Maak een circulaire muur (10 mm in diameter en 3 mm hoge) de deuk (Figuur 1).
Opmerking: De ruimte binnen de muur zal worden later gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 bij 25 ° C).
- Dierlijke voorbereiding
Opmerking: Voor calcium beeldvorming, is een calcium-indicator, GCaMP6s, uitgedrukt in het celtype van belang, dat gebeurt meestal door middel van combinaties van weefsel-specifieke GAL4 en UAS-GCaMP6s. Om ervoor te zorgen dat het signaal wordt gemedieerd door de kandidaat-receptor, wordt GCaMP6s ook uitgedrukt in een mutant met gebreken in de receptor.- Wanneer experimentele vergelijkingen voor verschillende genotypen zoals wild type en mutanten vereist zijn, niveau leeftijd de larven van de test van de wedstrijd om te voorkomen dat GCaMP6 expressie variaties en fysiologische verschillen als gevolg van de ontwikkelingsstadia.
- Houd ouderlijke vliegen (30 vliegen voor elk geslacht) in een flesje van de cultuur met standaard vliegen voedsel voor 8 h tot het leggen van eieren toestaan op het oppervlak van het voedsel. De larven van de cultuur in massa onder een 12-h licht-donker cyclus bij 25 ° C en 60-70% relatieve vochtigheid.
- Van larvale hersendissectie
- 90-120 uur na ei leggen (AEL), verzamelen van larven en was ze ten minste 3 keer met gedestilleerd water te verwijderen van aanhangend voedsel puin.
- Plaats een larve op een horlogeglas vierkant 1.5-inch gevuld met ijs koud PBS.
Opmerking: De volgende twee stappen worden uitgevoerd in deze horlogeglas onder de Microscoop ontleden. - Gebruik pincet voorzichtig grijpen het middengedeelte van de larve. Gebruik een ander pincet te grijpen de mond haken en trek de mond haken zachtjes te scheiden van het voorste deel van de larve met de hersenen van de rest van het lichaam.
Opmerking: U kunt ook chirurgische schaar kan worden gebruikt. - Houd het voorste puntje door pincet en draai de larve binnenstebuiten. Verwijderen van vreemde weefsel gehecht aan de hersenen, zoals imaginaire schijven, vet organen en ring klier. Voorzichtig het scheiden van de hersenen van de monddelen.
- Breng 200 µL van PBS aan de binnenkant van de ring gemaakt van de putty-achtige herbruikbare lijm in de beeldvorming zaal. Zachtjes zuigen de ontleed hersenen met PBS in een pipet van Pasteur, en breng het in de beeldvorming kamer.
- Instellen van de hersenen in de beeldvorming kamer
- Gebruik pincet te grijpen van spiervezels die zich uitstrekt van de ventrale ganglia. Plaats de hersenen zachtjes in de deuk onder de draad wolfraam.
- Een ander pincet, trek de draad wolfraam licht tot plaats met de hersenen op de juiste positie voor imaging (Figuur 1).
2. verwerving van Ca2 + fluorescentie beelden
Opmerking: Hersenen explantaten ondergedompeld in PBS zijn beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop uitgerust met een 20 X water-immersie objectief (N.A. = 0,5). PBS worden cellen in de hersenen niet geactiveerd. Als z-as beelden nodig zijn, is het objectief met een piëzo-elektrische-geactiveerde lens mover gemonteerd. Een draaiende schijf confocal hoofd wordt gebruikt voor het verbeteren van de resolutie van de tijd. Voor weinig licht imaging, is een elektron te vermenigvuldigen charge - coupled apparaat camera gemonteerd op de Microscoop. De beeldvorming van GCaMP6s fluorescentie (excitatie/emissie: 488/509 nm) vereist een 488-nm laser voor excitatie met een dichroïde balk splitter en een uitstoot-filter (bv., 528 ± 38 nm band bandfilter filter).
- Plaats de imaging cupje met de explant hersenen onder de Microscoop.
- Lager het objectief totdat het raakt de PBS. Onder heldere-veld de verlichting, de hersenen plaats en brengen het in beeld. Ga naar tl-licht en de focus op de cellen van GCaMP6s-label aanpassen.
Opmerking: De basale groene fluorescentie van de GCaMP6s zichtbaar moet zijn. - Start acquisitie bij 250 ms/frame met een resolutie van 512 x 512 pixels in watergekoelde modus met behulp van de juiste acquisitie software (bijv., µManager). Pas de belichtingstijd te verkrijgen van de fluorescentie waarden binnen het dynamisch bereik van de CCD-camera, maar niet lager dan 1000 (willekeurige eenheden), met 16-bits afbeeldingen (dynamisch bereik 0-65.535).
Opmerking: Er is een geringe blootstellingstijd dient te minimaliseren foto-bleken van de GCaMP6s. Blootstellingstijd moet worden geoptimaliseerd in elk experiment, aangezien het afhangt van de niveaus van de expressie van de GCaMP6 en de gevoeligheid van het detectiesysteem. Het was 100 ms bij het gebruik van onze experiment dilp2 > GCaMP6s. Wanneer z-profielen nodig om een bepaalde imaging diepte zijn, kunnen verschillende z-sectie beelden afhankelijk van de blootstelling tijd en frame intervallen worden verworven. Als de camera genoeg ruimtelijke resolutie heeft, worden de binning grootte (aantal registers op de chip, die zal worden weggegooid in een digitale pixel) opgevoerd ter vermindering van de blootstellingstijd. - Zodra de imaging parameters worden bepaald, nemen beelden voor 1 min vóór peptide administratie te detecteren basislijn signaal intensiteit (F0).
- Toepassing van de test-peptide; hiervoor los 100 µL van peptide oplossing in PBS en Pipetteer het rechtstreeks in het larvale bad een optimale concentratie opleveren.
Opmerking: De peptide-oplossing langzaam moet worden geïnjecteerd (b.v., stroom tarief 20 µL/s) in de oplossing van de bad met behulp van een precisiepipet. Niet-verwante synthetische peptide opgelost in PBS wordt gebruikt als een negatieve controle. - Het opnemen van de uitstoot van de GCaMP6s voor een paar minuten.
3. de gegevensanalyse
Opmerking: Imaging gegevens worden geanalyseerd off line met de ImageJ. Tijdens de time-lapse beeldvorming, pipetting zorgt ervoor dat de larvale hersenen om te gaan. Daarom moeten de positionele aberraties van de seriële beelden vóór de analyse worden gecorrigeerd. De correctie kan worden uitgevoerd met behulp van een plug-in, ImageJ TurboReg als volgt.
- Open de software van de analyse en het gebruik van het eerste frame (vóór de toepassing van de peptide) als een referentiebeeld.
- Selecteer Plugins | Registratie | TurboReg.
- Kies het seriële afbeeldingsbestand als de bron en het referentiebeeld als het doel.
- Controleer Vastlichaam (parallelle verschuiving en draaiing van beelden) en Accurate ("Snelle" is grof maar snelle analyse in plaats daarvan) voor de verwerkingsmethode en kwaliteit, respectievelijk.
- Klik op de partij om te beginnen de beeldverwerking.
- Selecteer meerdere regio's van belang (ROIs) met behulp van de Analyze | Tools | ROI Manager in ImageJ.
- Meten van de intensiteit van de pixel door te klikken op meer | Multi maatregel | OK in het venster van de Manager van de ROI.
- Berekenen van ΔF/F0 = (F - F0) / f0, waar F is de intensiteit van de ROI op het moment van de stimulus, en F0 is de intensiteit op een tijd-venster onmiddellijk voordat een bepaalde experimentele gebeurtenis (bijvoorbeeld 30 frames voorafgaande aan de stimulans begin).
- Herhaal het experiment met behulp van meerdere hersenen monsters, het uitvoeren van statistische verwerking om te verkrijgen van het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) op elk tijdstip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol, werd de activering van de insuline-producerende hersencellen (IPCs) door de peptide hormonen, CCHa2, onderzocht. IPCs van de wild-type hersenen waren gelabeld met GCaMP6s met behulp van een combinatie van dilp2 -GAL412 (een geschenk van Dr. Rulifson) en UAS-GCaMP6s13 (een geschenk van Dr. Kim). Larvale hersenen explantaten werden behandeld met een synthetisch CCHa2 peptide, en de fluorescentie van GCaMP6s werd opgenomen in real-time. In dit experiment, zijn afbeeldingen afkomstig van een enkele brandvlak. Elk IPC-cluster bevat ongeveer 14 cellen14en signalen van 3 naar 6 cellen werden ontdekt. De signaalsterkte van de GCaMP6s was sterk toegenomen bij het beheer van de CCHa2 (Figuur 2A, film 1). De hersenen van de wild-type niet tonen een duidelijk antwoord op ghreline of Nociceptin (Movie 2 en 3, respectievelijk), die zijn zoogdieren peptide hormonen zonder een homologe Drosophila . Deze resultaten wijzen erop dat de waargenomen activering van IPCs door CCHa2 een specifiek antwoord op CCHa2 is. Om te verduidelijken of CCHa2 door CCHa2-R optreedt, werd dezelfde analyse uitgevoerd met behulp van CCHa2-R mutant hersenen. Geen dergelijke verhoging van de signaalsterkte werd waargenomen na toediening van de CCHa2 in de mutant hersenen (film 4). Statistische analyse toonde aan dat het verschil in intensiteit van het signaal tussen de wild-type en CCHa2-R mutant hersenen werd aanzienlijke binnen 2 min na toepassing van de CCHa2 en werd gehandhaafd gedurende ten minste 7 min. (Figuur 2B). Deze resultaten wijzen erop dat de IPCs specifiek worden geactiveerd door CCHa2 door CCHa2-R. Alle peptiden gebruikt in deze studie werden verdund door PBS opleveren een eindconcentratie van 10-9 M.
Figuur 1 . Imaging-kamer
(A) cultuur schotel (35 x 10 mm) met een kleine deuk en binden staaf. (B) ringvormige muur gemaakt van putty-achtige herbruikbare lijmen. (C) A larvale hersenen explant ingevoegd in de beeldvorming zaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Calcium beeldvorming van de hersenen van de larvale explant
Wild-type (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) hersenen werd blootgesteld aan CCHa2, ghreline en Nociceptin. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) hersenen werd blootgesteld aan CCHa2. GCaMP6s signalen in IPCs werden ontdekt door confocale microscopie bij 250 ms/frame. Nog steeds staan beelden van geselecteerde tijdstippen in (A). De beelden waren pseudocolored om verschillende signaal intensiteit beter te visualiseren. ΔF/F0 op elk tijdstip was uitgezet in (B). ΔF/F0 was berekend op basis van 5 naar 10 verschillende preparaten. ROIs zijn ingesteld voor cel organen die in een zelfde brandvlak werden aangetroffen. De doorgetrokken lijnen geven het gemiddelde van 5 tot en met 10 monsters en de dotted strafregels Markeer boven- en ondergrenzen van de standaardfout van het gemiddelde. De gearceerde gebieden geven de variatie van de signalen in de experimenten. Schaal balk geeft 50 µm. De figuur wordt aangepast van Sano et al. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1. Wild-type IPCs blootgesteld aan CCHa215 gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 2. Wild-type IPCs blootgesteld aan ghreline15 gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 3. Wild-type IPCs blootgesteld aan Nociceptin15 gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 4. CCHa2-R Mutant IPCs blootgesteld aan CCHa2 15 Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Ca2 + beeldvorming van de hier beschreven methode is een nuttig systeem voor het testen van de functie van hormonen in de hersenen. In vivo, de hersenen ontvangt hormonen van verschillende endocriene organen. Daarnaast ziet de hersenen voortdurend oplopende zintuiglijke informatie, waardoor spontane neuronale activering. Dit systeem ex vivo elimineert deze ruis en levert een betere signaal/ruis-verhouding dan in vivo imaging. In dit systeem, kunnen de moleculen worden getest afzonderlijk of in combinatie. Naast peptide hormonen, kunnen eventuele wateroplosbare moleculen, met inbegrip van natuurlijke of synthetische verbindingen, worden toegepast op de hersenen explant.
Voor Ca2 + imaging moeten hersenen explantaten worden aangebonden. Voor dit doel, een gel-matrix gemaakt van lage-melting point agarose of fibrine is eerder gebruikte16,17. Deze gel matrices kunnen het monster stabiel te houden, echter de weefsels worden verhit tot boven 30 ° C. Deze temperatuur zorgt ervoor dat de reactie van een warmte-schok in poikilothermic dieren zoals insecten. Voorkom hittestress, kon de hersenen fysiek worden aangebonden. De hersenen verbonden aan de cuticle zijn vastgemaakt met insect pins18. Onze methode met behulp van een draad wolfraam biedt eenvoudige en stabiel houden van het monster. Dit systeem is makkelijk te bereiden en herbruikbaar, en stimulerende middelen te bereiken de doelcellen gemakkelijker in vergelijking met de gel methode insluiten toestaat. Dus, zulks zal zitten nuttig voor ligand screening.
De keuze van de TL indicator is afhankelijk van het soort doel neuronen, het soort receptoren uitgedrukt in het neuron, en de biologische vragen worden aangepakt. Een aantal GCaMP6-varianten geoptimaliseerd voor het opsporen van verschillende temporele Ca2 + dynamiek geweest gegenereerde13. In het bijzonder, GCaMP6 varianten verschillen in hun reactie-kinetiek: GCaMP6s (langzaam), GCaMP6m (medium), en GCaMP6f (snel). De tijden van verval voor de GCaMP6s en 6m zijn relatief traag (dwz., τ,1/2 na 10 actie potentieel in een preparaat hippocampal segment) terwijl dat voor GCaMP6f snel is (τ,1/2 na 1 actiepotentiaal). Andere vormen van beschikbare fluorescerende indicatoren voor neurale activiteit omvatten EPAC-cAMP (kamp), Synapto-pHluorin (synaptic release) en ArcLight (membraanpotentiaal)19,20,21. Deze genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren kunnen worden uitgedrukt in specifieke celtypes. Dus, de ex vivo imaging systeem kan verschillende reacties detecteren in gewenste neuronen.
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol. Eerste, vreemde weefsels moeten worden verwijderd uit de hersenen om een duidelijk beeld te krijgen. Het gebruik van aangescherpte pincet en chirurgische scharen vergemakkelijkt het fijne werk. Ten tweede moet de ontleed hersenen worden vastgesteld naar de gewenste positie. Af en toe, verplaatst het monster van de hersenen iets van pipetteren (het bereik ongeveer 5 µm). Om te verhinderen dat de hersenen bewegen, moet de hoogte van de wolfraam draad in de beeldvorming van de plenaire vergadering worden aangepast aan de grootte van de steekproef van de hersenen. U kunt ook kan een zwaartekracht-feed perfusie-systeem worden geïnstalleerd voor zachte stimulatie. Ten derde moeten de resultaten van de beeldvorming van de hersenen met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. De ligand toegepast naar de hersenen kan stimuleren onverwachte neuronen, die op zijn beurt de doelgroep neuronen kunnen activeren. Om te ontdekken de directe invloed van een hormoon op specifieke neuronen, de receptor moet worden gevloerd-down in de targetneurons. In dit geval, kan de uitdrukking van de TL-indicator worden gecombineerd met die van de receptor RNAi met behulp van de Gal4/UAS-systeem.
Een kleine beperking van dit protocol is dat de duur van imaging beperkt als gevolg van de eventuele schade van het monster van de hersenen. In onze handen, kan de hersenen van Drosophila worden beeld voor tot ongeveer 60 min. met behulp van dit protocol. Hemolymfe-achtige oplossing, zoals HL3.1 zoute22en laser intensiteiten kunnen op lange termijn imaging. Bovendien, is de huidige imaging setup niet geschikt voor repetitieve stimulatie van hetzelfde monster. Voor dergelijke experimenten, kon een perfusie-bad worden gebruikt.
Tot slot, dit protocol heeft diverse toepassingen. Door aanpassing van de beeldvorming kamer, kon de volwassen hersenen en andere Drosophila weefsels of de weefsels van andere dieren worden beeld. In niet-modelorganismen, heeft het gebrek aan genetische hulpmiddelen maakte het moeilijk om TL indicatoren in het genoom. Echter, onlangs ontwikkelde CRISPR/Cas9 genoom bewerkingstechnieken hebben opende de deur naar de genetische manipulatie in deze dieren. Dus, dit protocol kan worden gebruikt om te studeren Inter orgel signalering in een breed scala van dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (15K 07147, 17K 07419) van JSPS (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), een onderzoeksbeurs van Inamori Foundation (naar HI), en het programma van het gezamenlijke gebruik/Research Center for Developmental geneeskunde, op het Instituut voor moleculaire embryologie en genetica, Kumamoto Universiteit (HS). Wij bedanken Dr. Azusa Kamikouchi en Mr. Daichi Yamada voor hun hulp bij het gebruik van de imaging systeem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S.
- Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
