Summary
本工作为液滴基微流体平台的制备和聚丙烯酰胺微球在微球 pcr 扩增中的应用提供了一种方法。微球 pcr 方法可以在不分离双链 dna 的情况下获得单链 dna 扩增器。
Abstract
液滴基微流体能够在微流体通道中可靠地生产均匀的微球, 从而提供所获得的微球的控制大小和形态。成功地制备了一种与丙烯酸-dna 探针共聚的微球。不同的方法, 如不对称 pcr, 外切酶消化, 和隔离条纹包覆磁珠可以用来合成单链 dna (ssdna)。然而, 这些方法不能有效地使用大量高度纯化的 ssdna。在这里, 我们描述了一个微球 pcr 协议, 详细介绍了如何通过从 pcr 反应管中移液来有效地扩增和分离 ssdna。ssdna 的扩增可作为 dna 微阵列和 dna-selex (通过指数富集的配体系统演化) 过程的潜在试剂。
Introduction
单链 dna (ssdna) 由于其 dna-dna 杂交 1,2 的固有特性, 被广泛认为是一种分子识别元素(mre)。ssdna 合成系统的发展可导致生物应用, 如 dna 微阵列3、寡糖学、诊断和基于互补相互作用4,5的综合分子传感。
迄今为止, 微尺度聚合物颗粒已成功地使用微流体器件进行了演示。在微通道环境6、7中, 几种微流体技术已被证明是在连续流动上产生高度均匀微球的强大技术。
在李等人的研究中.8、基于液滴的微流体平台, 用于共聚寡微球的微流体合成和 ssdna 扩增。微流体平台由两个 pdms (聚二甲基硅氧烷) 层组成: 一个上部具有用于产生微球的微流体通道网络和一个底部平面部分。其中包括三种 pdms 流体通道: 1) 用于液滴生成的流聚焦通道, 2) 混合两个溶液的蛇形通道, 以及 3) 用于微球凝固的连续聚合通道。一旦两个不混溶的流被引入到一个单一的 pdms 流体通道中, 这些流就可以通过狭窄的孔口结构来强制。通道几何形状、流速和粘度等流动行为影响微球的大小和形态。因此, 主流可分为微尺度单圈9、10.
本文提供了一种详细的微球 pcr 扩增方法。首先, 介绍了一种基于液滴的微流体器件的设计过程。然后, 阐述了用随机 dna 模板互补化聚丙烯酰胺微球的方法。最后, 给出了一种扩增 ssdna 的微球 pcr 协议。
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Protocol
1. pdms 微流体平台的制作
- 采用体积比为10:1 的基础聚合物和催化剂制备20毫升液体 pdms 预聚物。将液体 pdms 的10毫升倒在微流体网络上部的硅片上制备的 su-8 模具上。对于底部扁平部分, 在没有模具结构的硅片上倒入相同体积的液体 pdms。
注: 微流体网络是在 cad 程序中设计的, 然后转换为光刻机, 以便使用典型的光刻工艺制造母版 (参见补充数字)。这位大师是由硅片11上的负光刻胶 su-8 模具组成的. - 将涂有液体 pdms 预聚物的两个硅片放在热板上, 在75°c 下固化30分钟。
- 从 su-8 模具中手动剥离固化的 pdms 层。将直径 1.5 mm 的圆孔冲孔工具与复制的微流体网络上的油口对齐, 以便将微米级流动通道与宏观流体样品连接在一起。手动打孔。
- 重复此冲孔过程三次, 形成两个解决方案和出口端口。
- 使用手持电晕处理器12对上、下的 pdms 层进行亲水性表面处理, 每个样品可持续数秒。
- 使用热板进行 pdms-pdms 粘接过程, 在90°c 下堆叠两个经过等离子体处理的 pdms 层并加热30分钟。使用注射器泵将加压水供应到三个入口端口, 用于制造设备的结构粘接和泄漏测试。
2. 聚丙烯酰胺低聚微球的生产
- 准备表1中详述的珠混合物。
- 涡旋和短暂离心标准 ssdna 丙烯酸酯标记探针 (app, 100μm) 和丙烯酰胺: 之二 (19:1) 库存溶液。
- 通过混合25μl 的40% 丙烯酰胺二度溶液、10μl 的 ssdna (丙烯酸矿探针)、10μl 的 5x tbe 缓冲液 (1.1 m tris; 900mm 硼酸盐; 25mm edta) 和5μl 的水制备溶液 i。用50μl 的20% 过硫酸铵制备溶液 ii。
- 准备两个单独填充了溶液 i 和溶液 ii 的注射器, 并将它们安装在泵上, 将溶液流引入微流体平台。制备与 0.4% temed 混合的矿物油, 用于微球的表面凝固。
注: temed 是众所周知的自由基稳定剂。自由基可以加速过硫酸铵 (aps) 形成聚合物的速度, 从而催化丙烯酰胺的聚合。 - 在玻璃瓶中加入4毫升矿物油, 形成连续流动。
- 将两个管子插入玻璃瓶盖中的两个端口作为微流体储罐: 用于将压缩空气从空气压缩机应用到玻璃瓶中的气动端口和用于向微通道网络供应加压油的流体端口从玻璃瓶。在微流体装置中的玻璃瓶和油口之间连接管道。
- 将管道连接到微流体设备中的两个溶液端口, 以便从注射器泵中提供两个溶液。将管道插入出口端口, 以便将生成的微球转移到烧杯中。
- 将注射器泵的流速设置为 0.4-0.7 mlh, 使用调节器 (82-116 kpa) 调整压缩机的压缩空气压力。将玻璃烧杯中的磁搅拌器杆的转速 (500 转/分) 设置在热板上。操作注射器泵, 并使用电磁阀13的 onsoff 控制将外部压缩机产生的压缩空气供应到玻璃瓶中.
- 用数字显微镜观察玻璃烧杯中产生的微球在流动聚焦几何中的形成和凝固情况。
注: 微球的大小和生产速度取决于溶液的流量和矿物油流动所施加的压力(表 2).
3. 执行聚丙烯酰胺低微球计数
- 对于血细胞计的定量, 取少量 (约 100μl) 的聚丙烯酰胺低微球水溶液, 放在玻璃血细胞计上, 轻轻地将微球悬浮液填充到计数室的井上。
注意: 有关详细信息, 请参阅 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer。 - 使用显微镜和手理计数器在16个正方形的一组中计数微球。然后, 将血细胞仪移动到下一组腔内, 并进行计数, 直到所有四组16个角都被计算在内。
- 确定平均微球计数, 并计算原珠子悬浮液中微球的数量。
- 将100μl 微球转移到 1.5 ml 微离心管中。通过温和的离心 (400 x g) 和移液去除上清液。
4. 在聚丙烯酰胺低微球表面进行 dna 杂交
注: 在溶液 i 中加入一个具有 5 '-nh2组而不是 5 '-丙烯酸酯修饰的相同 dna 探针, 并同时对含有 ap-fnas 的微球进行了测试。dna 杂交结果如图 2所示。在黑暗的房间里, 应放置在一个黑暗的房间里, 用 cy3 标记的互补寡核苷酸探针 (cAp) 溶液。
- 使用100μl 的1xte 缓冲液 (te 缓冲液:10 mm tris 和 1xTE edta, ph 8.0) 重新使用 cy3-capp, 以达到100μm 的最终浓度。例如, 在 te 缓冲液100毫升中重新悬浮 1 pmol 的 cop, 并转移到覆盖着铝箔的微离心管中。
注: 有关链序列, 请参见表 3。 - 在含有 ap-co-co-col 微球的无菌 1.5 ml 微离心管中加入100μm 的 cy3-capp。
- 轻拍管几次, 在室温下在黑暗中混合孵育1小时。
- 丢弃上清液, 通过移液去除残留缓冲液。
- 用500μl 的 te 缓冲液冲洗三次。
- 通过轻轻敲击微离心管来重新填充微球。然后, 重复步骤4.4。
- 在成像前, 将微球放在玻璃滑块 (75 毫米 x 50 毫米) 上, 并用铝箔覆盖。
5. 扩增 ssdna 的 pcr 不对称
- 制备用于扩增 ssdna 的非对称 pcr 试剂混合物进行分析。在冰上解冻表 4中的试剂。不要将 taq 聚合酶 (50 ueμl) 保存在冰上, 而是将其保存在-20°c, 直到需要。
- 轻轻涡旋所有试剂, 然后短暂离心管在 10, 000 x g 的10秒。
- 按照表4中的说明组合所有试剂.
- 将样品放入热环器中, 并在以下条件下启动非对称 pcr: 25个周期 (95°c 为 30秒, 52°c 为 30秒, 72°c 为 30秒), 85°c 为 5分钟, 保持在4°c。
6. 扩增 ssdna 的微球 pcr
注: 本节介绍 pcr 反应管中扩增 ssdna 的协议。在50μl 的反应体积下进行微球 pcr 反应。用于扩增 ssdna 的详细序列见表 5。在这种情况下, 微球表面的 app 可以以互补的方式退火到随机 dna 模板。这是产生互补 dna 链 (反义 dna 链,图 3) 的一个非常重要的步骤。扩展的 dna 被用作微球 pcr 扩增的模板。
- 制备微球 pcr 试剂混合物。在冰上解冻表 6中的试剂;但是, 不要将 taq 聚合酶保持在冰上。将其存放在-20°c, 直到需要。
- 轻轻涡旋所有试剂, 然后短暂离心管在 10, 000 x g 的10秒。
- 通过显微计数获得约 ~ 25个微球。
注: 一个反应管中的微球数量是使用40x 放大倍率的光学显微镜计算的。约25个微球用于微球 pcr 扩增。更多详细信息在步骤3中。 - 按照表6中的说明组合所有试剂.
- 将样品放入热环器中, 并在以下条件下启动非对称 pcr: 25个周期 (95°c 为 30秒, 52°c 为 30秒, 72°c 为 30秒), 85°c 为 5分钟, 保持在4°c。
- 扩增后, 加入6x 的负载缓冲液, 并将每个样品的15μl 加载到2% 琼脂糖凝胶中。然后, 在 1x tae (醋酸盐 edta, 40 mm 醋酸 tris, 1 mm edta, ph 8.2) 缓冲液中, 在 100 v 下进行电泳35分钟。
7. 共聚焦显微镜采集
注: 在共聚焦显微镜下对微球-dna 探针杂交的结果进行了成像。图像分析是使用 imagej 执行的。
- 将杂交微球固定在支架的显微镜阶段。
- 选择激光 (helium/neon 激光器, 543 nm 线), 并在激光控制中打开它。
- 在显微镜控制中选择物镜。
- 在配置控制中为 cy3 和通道选择所需的筛选器。
- 开始实验并观察样品。表 7汇总了共聚焦显微镜的设置。
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Representative Results
基于聚合物液滴的微流体平台由两个 pdms 层组成 (图 1a)。三种微流体通道网络用于产生微球: 1) 流动聚焦几何, 如图 1b所示, 2) 用于混合溶液 i 和溶液 ii 的蛇形通道, 3) 微球聚合通道凝固。所有通道的高度为60微米。混合和聚合的通道长度分别为74.35 毫米和94.45 毫米。两个不混溶流体流动的微通道宽度和矿物油流动的微通道宽度分别为100μm 和200μm。用于微球形成的孔体结构为50微米长和25μm 宽。扩散器结构的角度为37°。采用了基于实验室的矿物油连续流动气动控制系统和两个溶液流注射器泵 (图 1c) 在微流体平台上产生微球 (图 1c)。当溶液流量和施加压力分别为 0.6 mlh 和 108 kpa 时, 微球的生产速度约为每秒30个微球 (表 2)。其在微通道中的直径为788.7±2.5 米。利用微流体装置可以成功地操作微球的流动合成。在膨胀后测量珠子尺寸。得到的微球的平均直径为150.4±12.8 米。尺寸变化约为8.5%。微球在水中膨胀, 导致尺寸增大。
微球的共聚性能可以变化。我们在微球溶液中加入了 5 '-丙烯酸-dna 探针 (溶液一, 见表 1)。在共聚后, 用荧光染料 cy3 标记一个互补的 dna 探针, 在室温下标记 1小时. 共聚焦显微镜可以用来证明共聚寡微球的合成以及功能杂交。微球表面。微球的荧光图像如图 2所示。如果微球与 5 '-丙烯酸-dna 探针功能正确化, 它们应该导致在杂交实验中覆盖表面的荧光活性。如果共聚不正确, 光学微球图像将在微球内部显示内部污染。如图 2所示, 不存在随机内部方向的干扰。这一结果使我们能够在三维 (三维) 排列和微球 pcr 中进行 dna 探针的呈现。需要注意的是, 在微球8的流动合成过程中, 具有5 '-nh 2 组而不是 5 '-丙烯酸酯修饰的相同 dna 探针不会共聚。
在使用微球时, 使用 dna 寡核苷酸探针操作三维表面是一个更快的过程14。因此, 流动微球合成平台可以为 ssdna 扩增和纯化提供一个工具, 如图 3所示。反义 dna 模板 (-, 互补模板) 可以通过添加随机 dna 模板 (+, 模板) 来扩展。在这种情况下, 最初共聚的 5 '-app 在退火后对其互补模板 (76 nt) 进行 dna 聚合提供了 3 '-oh 端。微球 pcr 可在单个 pcr 微管中使用功能化的微球、随机 dna 模板和标签转发引物进行。为了区分生成的 ssdna 放大器和随机 dna 模板 (+ 模板, 76 nt), 正向引物有另外24个核苷酸标记。如果正向引物没有额外的标记序列, 则很难识别 ssdna 放大器和初始随机 dna 模板之间的标记序列。
进行了不对称 pcr 实验。我们能够观察到 dsdna 污染物, 如图 4所示。在大多数情况下, 有必要使用链状包覆磁珠和外切酶消化分离 ssdna。然而, 微球 pcr 有效地利用单个引物 (标记正向引物) 在水相中积累 ssdna。预计 dsdna 污染物会附着在微球表面。因此, ssdna 放大器可以通过移液获得, 而无需离心。通过凝胶电泳分析, 将其与合成尺寸标记 (76 nssdna 和 100 tsdna) 进行比较, 证明了所产生的 ssdna。
图 1: 微流体平台.(a) 制作微流体平台, (b) 扩大流聚焦几何的视野, (c) 实验设置, (d) 显示微球连续生成的捕获图像。1: 微通道结构为流动聚焦几何, 2: 用于混合溶液, 3: 用于微球凝固。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 微球表面 dna 杂交的荧光读数.5 '-丙烯酸修饰 dna 探针 (app) 能够与互补的 cy3 标记 dna 探针 (cAp) 杂交。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 微球 pcr 协议的示意图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 传统的不对称 pcr 与微球 pcr 的比较.m;ssdna 标记 (76 mer 和 100 mer), 车道 1;不对称 pcr, 2 车道;微珠 pcr。在以前的作品8的许可下重新打印。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 混合体积 (μl) | 最终浓度 | |
| 解决方案 i | 40% 丙烯酰胺: 之二溶液 (19:1) | 25 | 10% |
| 100μm 丙烯酸矿探头 (app, 5 '-丙烯酸酯-(ttttt, 链接器序列) aga ttg cac tta tta cttt-3 ') | 10 | 10μm | |
| 5倍 tbe 缓冲器 (Tris-base-EDTA) | 10 | 0.5 x | |
| 水 | 5 | - | |
| 解决方案二 | 20% 过硫酸铵 | 50 | 10% |
| 解决方案三 | temed (n,n,n',n'-四甲基乙二胺) | 8 | 0.40 |
| 矿物油 | 1000元 | - | |
表1。用于流动聚丙烯酰胺微球合成的试剂混合组分。
| 操作条件 | 微 球 生产速度 |
|
| 溶液流量 | 油压 | |
| (mlh) | (千帕) | (秒) |
| 0。4 | 82 | 7。1 |
| 0。5 | 94 | 13。3 |
| 0。6 | 108 | 28。9 |
| 0。7 | 116 | 36。5 |
表2。操作条件和生产的微球概述。
| 脱氧核糖核酸探针 | 序列 |
| cy3 标记互补寡核苷酸探针 (cAp) | 5 '-cy3-agattagtagcatt-3 ' |
| 标签 (前24分)-正向底漆 | 5 '-ggt aat acg cac tat agg agg ata gct tca att-3 ' |
表3。dna 探针的序列信息。
| 试剂 | 1x 反应的体积 (μl) | 最终浓度 |
| 随机 dna 模板 | 1 | 1 ngμl |
| 标签前置底漆 | 1 | 0.4μm |
| 反向底漆 | 1 | 0.02 微米 |
| 10倍 taq 缓冲区 | 5 | 1x |
| 10 mm 的 dntp | 4个 | 250万米 |
| ex taq (1000u) | 0。2 | 1 u |
| 水 | 37。8 | - |
| 总 | 50 | - |
表4。不对称 pcr 试剂混合组分在 20 l 反应。
| 模板 | 序列 | 长度 (非) |
| 随机 dna 模板 | 5 '-ata cca gct tca att att (随机序列, 40 mer) aga tag ggg caa tct-3 ' | 76 |
| 标记前置底漆 (标签 f) | 5 '-ggt aat acg cac tat agg agg ata gct tca att-3 ' | 42 |
| 反向底漆 | 5 '-aga ttg cac tta cta cttt-3 ' | 18 |
表5。微球 pcr 的序列信息。
| 试剂 | 1x 反应的体积 (μl) | 最终浓度 |
| ap-微球 | ~ 25个微球 | - |
| 随机 dna 模板 | 1 | 1 ngμl |
| 标签前置底漆 | 1 | 0.4μm |
| 10倍 taq 缓冲区 | 5 | 1x |
| 10 mm dntp | 4个 | 250万米 |
| ex taq (1000u) | 0。2 | 1 u |
| 水 | 37。8 | - |
| 总 | 50 | - |
表6。微球-pcr 试剂混合组分在 50 l 反应。
| 扫描模式 | 飞机 |
| 缩放 | x:2.49 微米, y:2.49 微米 |
| 堆栈大小 | x:1272.79 微米, y:1272.79 微米 |
| 扫描变焦 | 0。7 |
| 目的 | ec plan-neofluar 10 x/0.3 m27 |
| 平均 | 1 |
| 针孔 | ch2:104 微米 |
| 过滤 器 | ch3:p 420 |
| 分束器 | mbs:hft 488/543, dbs1:cobs2:nft 543, fw1: 无 |
| 波长 | 543海里100.0% |
表7。共聚焦显微镜的设置。
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Discussion
dsdna 的污染物是 ssdna 扩增中的一个主要问题。在传统的不对称 pcr 扩增中, 仍然很难将 dsdna 扩增降至最低。此外, 尽管生成 ssdna 的技术改进使我们能够提高样品吞吐量的效率, 但由于其成本高、纯化产量不完整, ssdna 分离仍然存在问题。
不对称 pcr 是处理 ssdna 时最具挑战性的方法之一。这种方法应用不等数量的引物 (例如, 20:1 比率), 以产生大量的 ssdna。然而, 要优化每一次扩增反应以产生 ssdna 是非常困难的。因此, 必须从产物4中消除副产品 (dsdna).
为了在不采取额外分离步骤的情况下产生 ssdna, 我们在丙烯酸矿共聚法的基础上, 研制了聚丙烯酰胺微球来暴露 dna 探针。我们的 dna 连接方法很容易通过使用基于液滴的微流体平台进行调整。成功地生产了具有微尺度直径的共聚寡微球。因此, 在单管反应中, 用微球 pcr 扩增了 ssdna。当然, 为了使此过程适应其他 pcr 实验, 通常需要进行必要的调整 (例如, 改变放大周期、退火温度和模板序列)。总之, 微球 pcr 在这里已经详细介绍, 使其可用于生物测定的发展, dna 测序, 和 dna 微阵列分析。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可供披露。
Acknowledgments
这项研究得到了题为 "农业科技发展合作研究方案" 的项目 (项目号) 的支持。pj0011642) "由大韩民国农村发展管理局提供资金。这项研究还得到了大韩民国科学、信息和通信技术和未来规划部资助的基础科学研究方案赠款 (nrf-2017ra2b4012253) 的部分支持。这项研究还得到了大韩民国贸易、工业和能源部资助的创意和工业融合教育方案赠款 (n0000717) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
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