Summary
यह काम छोटी बूंद के निर्माण के लिए एक विधि-आधारित microfluidic प्लेटफार्मों और microsphere-पीसीआर प्रवर्धन के लिए polyacrylamide microspheres के आवेदन प्रदान करता है । microsphere-पीसीआर विधि दोहरे-असहाय डीएनए को अलग किए बिना एकल-असहाय डीएनए amplicons प्राप्त करने के लिए संभव बनाता है ।
Abstract
छोटी बूंद-आधारित microfluidics microfluidic चैनल में सजातीय microspheres के विश्वसनीय उत्पादन सक्षम, नियंत्रित आकार और प्राप्त microsphere की आकृति विज्ञान प्रदान करते हैं । एक acrydite-डीएनए जांच के साथ एक microsphere copolymerized सफलतापूर्वक गढ़े । ऐसे असममित पीसीआर, exonuclease पाचन, और streptavidin पर अलगाव-लेपित चुंबकीय मोतियों के रूप में विभिंन तरीकों को एकल-असहाय डीएनए संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (ssDNA) । हालांकि, इन विधियों कुशलतापूर्वक अत्यधिक शुद्ध ssDNA की बड़ी मात्रा का उपयोग नहीं कर सकते । यहां, हम एक microsphere-पीसीआर विवरण कैसे ssDNA कुशलता से परिलक्षित किया जा सकता है और एक पीसीआर रिएक्शन ट्यूब से pipetting द्वारा बस dsDNA से अलग प्रोटोकॉल का वर्णन । ssDNA के प्रवर्धन डीएनए microarray और डीएनए के लिए संभावित रिएजेंट के रूप में लागू किया जा सकता है-SELEX (घातीय संवर्धन द्वारा लाइगैंडों के व्यवस्थित विकास) प्रक्रियाओं ।
Introduction
एकल-कतरा डीएनए (ssDNA) को बड़े पैमाने पर एक आणविक मान्यता तत्व के रूप में माना गया है (MRE) डीएनए के लिए अपनी आंतरिक संपत्तियों के कारण-डीएनए संकरण1,2. ssDNA सिंथेटिक प्रणालियों के विकास जैसे डीएनए microarrays3, oligotherapeutics, निदान के रूप में जैविक अनुप्रयोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और एकीकृत आणविक संवेदन पूरक बातचीत के आधार पर4,5.
तिथि करने के लिए, माइक्रोमीटर पैमाने बहुलक कणों सफलतापूर्वक microfluidic उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है । कई microfluidic तकनीक microchannel पर्यावरण6,7में निरंतर प्रवाह पर अत्यधिक समरूप microspheres उत्पादन के लिए शक्तिशाली साबित किया गया है ।
के अध्ययन में ली एट अल. 8, copolymerizable oligo के microfluidic संश्लेषण के लिए एक छोटी बूंद-आधारित microfluidic मंच-microsphere और ssDNA वर्धन की सूचना दी गई । microfluidic मंच दो PDMS (polydimethylsiloxane) परतों के होते हैं: microsphere और एक नीचे फ्लैट हिस्सा पैदा करने के लिए एक microfluidic चैनल नेटवर्क के साथ एक ऊपरी हिस्सा । ये PDMS द्रवित चैनलों के तीन प्रकार से मिलकर बनता है: 1) एक छोटी बूंद पीढ़ी के लिए चैनल ध्यान केंद्रित प्रवाह, 2) दो समाधान मिश्रण के लिए एक र्ें चैनल, और 3) microsphere solidification के लिए एक अनुक्रमिक बहुलकीकरण चैनल । एक बार दो immiscible प्रवाह एक एकल PDMS द्रवित चैनल में पेश कर रहे हैं, प्रवाह संकीर्ण छिद्र संरचना के माध्यम से मजबूर किया जा सकता है । इस तरह के चैनल ज्यामिति के रूप में प्रवाह व्यवहार, प्रवाह दर, और चिपचिपापन microsphere के आकार और आकृति विज्ञान को प्रभावित । इसलिए, मुख्य लिक्विड स्ट्रीम अतिसूक्ष्म monospheres9,10में विभाजित किया जा सकता है ।
यहां, ssDNA के प्रवर्धन के लिए एक विस्तृत microsphere-पीसीआर प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है । सबसे पहले, एक छोटी बूंद-आधारित microfluidic डिवाइस डिजाइन प्रक्रिया वर्णित है । फिर, जिस तरह से polyacrylamide microspheres यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट के साथ एक पूरक तरीके में कार्यात्मक किया जा सकता है समझाया है । अंत में, ssDNA बढ़ाना के लिए एक microsphere-पीसीआर प्रोटोकॉल दिखाया गया है ।
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Protocol
1. एक PDMS Microfluidic मंच का निर्माण
- 10:1 की मात्रा अनुपात में आधार बहुलक और उत्प्रेरक मिश्रण द्वारा तरल PDMS के 20 मिलीलीटर तैयार करें । microfluidic नेटवर्क के ऊपरी भाग के लिए एक सिलिकॉन वेफर पर एक तैयार एसयू-8 मोल्ड पर तरल PDMS के 10 मिलीलीटर डालो । नीचे फ्लैट भाग के लिए, एक मोल्ड संरचना के बिना सिलिकॉन वेफर पर तरल PDMS की एक ही मात्रा डालना ।
नोट: microfluidic नेटवर्क एक सीएडी कार्यक्रम में बनाया गया है और फिर एक photomask में परिवर्तित क्रम में एक ठेठ photolithography प्रक्रिया का उपयोग कर मास्टर बनाना ( पूरक आंकड़ेदेखें) । इस मास्टर सिलिकॉन वेफर11पर नकारात्मक photoresist SU-8 मोल्ड के शामिल है । - दो सिलिकॉन गर्म थाली और इलाज पर 30 मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर तरल PDMS के साथ लेपित वेफर्स प्लेस ।
- मैन्युअल रूप से एसयू-8 मोल्ड से ठीक PDMS लेयर को छील लें । स्थूल द्रव के नमूनों के साथ माइक्रोन पैमाने पर प्रवाह चैनलों का सामना करना पड़ के लिए प्रतिरूपित microfluidic नेटवर्क पर तेल बंदरगाह के लिए एक १.५ मिमी व्यास दौर छेद छिद्रण उपकरण संरेखित करें । के माध्यम से छेद मैंयुअल रूप से बाहर पंच ।
- इस छिद्रण प्रक्रिया दो समाधान और आउटलेट बंदरगाह के गठन के लिए तीन बार दोहराएं ।
- नमूना प्रति कई सेकंड के लिए एक हाथ से आयोजित कोरोना का इलाज12 का उपयोग कर दोनों ऊपरी और निचले PDMS परतों पर हाइड्रोफिलिक सतह उपचार प्रदर्शन ।
- PDMS-to-PDMS बांडिंग प्रक्रिया के लिए एक गर्म थाली का उपयोग कर 30 मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर दो प्लाज्मा इलाज PDMS परतों और गर्मी ढेर । आपूर्ति दबाव पानी के संरचनात्मक संबंध और गढ़े उपकरण के रिसाव के परीक्षण के लिए तीन प्रवेश बंदरगाहों में सिरिंज पंप का उपयोग कर ।
2. Polyacrylamide Oligo का उत्पादन-Microspheres
- तैयार मनका- 1 तालिकामें विस्तृत मिश्रण ।
- भंवर और संक्षेप में मानक ssDNA acrydite लेबल जांच (एपी, १०० माइक्रोन) और acrylamide: बीआईएस (19:1) स्टॉक समाधान केंद्रापसारक ।
- समाधान तैयार करें I ४०% acrylamide बीआईएस सॉल्यूशन के 25 μL को मिलाकर, ssDNA के 10 μL (acrydite जांच), 5x μL के 10 TBE बफ़र (१.१ M Tris; ९०० mM बोराटे; 25 mm EDTA), और 5 μL का पानी । समाधान II को 20% अमोनियम persulfate के ५० μL के साथ तैयार करें ।
- दो सीरिंज व्यक्तिगत समाधान मैं और समाधान द्वितीय से भर तैयार है, और उंहें पंप पर microfluidic मंच में समाधान प्रवाह शुरू करने के लिए माउंट । तैयार खनिज तेल microsphere की सतह solidification के लिए ०.४% TEMED के साथ मिश्रित ।
नोट: TEMED एक मुक्त कट्टरपंथी स्थिरता के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है । मुक्त कण अमोनियम persulfate (एपीएस) के साथ बहुलक गठन की दर में तेजी लाने के क्रम में acrylamide बहुलकीकरण उत्प्रेरित कर सकते हैं । - एक सतत प्रवाह उत्पंन करने के लिए खनिज तेल की 4 मिलीलीटर के साथ एक गिलास बोतल भरें ।
- एक microfluidic जलाशय के रूप में कांच की बोतल की टोपी में दो बंदरगाहों के लिए दो ट्यूबों डालें: हवा कंप्रेसर और माइक्रो चैनल नेटवर्क के लिए दबाव तेल की आपूर्ति के लिए द्रव बंदरगाह से कांच की बोतल में संपीड़ित हवा लगाने के लिए वायवीय बंदरगाह शीशे की बोतल से. कांच की बोतल और microfluidic डिवाइस में तेल बंदरगाह के बीच ट्यूबों कनेक्ट ।
- सिरिंज पंप से दो समाधान की आपूर्ति करने के क्रम में microfluidic डिवाइस में दो समाधान बंदरगाहों के लिए ट्यूबों कनेक्ट. डालने के लिए आउटलेट बंदरगाह के लिए ट्यूब के क्रम में चोंच में उत्पंन microsphere हस्तांतरण ।
- सिरिंज पम्प की प्रवाह दर को ०.४-०.७ एमएल/एच. एक नियामक (८२-११६ केपीए) का उपयोग कर कंप्रेसर के संकुचित हवा के दबाव को समायोजित करें । एक गर्म थाली पर ग्लास चोंच में चुंबकीय सरगर्मी पट्टी के रोटेशन की गति (५०० rpm) सेट करें । सिरिंज पंप संचालित और संपीड़ित हवा एक विद्युत चुंबकीय वाल्व13के ऑन कंट्रोल का उपयोग कर कांच की बोतल में एक बाहरी कंप्रेसर द्वारा उत्पंन की आपूर्ति ।
- एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ ग्लास चोंच में प्रवाह-केंद्रित ज्यामिति और उत्पन्न microspheres के solidification में microspheres के गठन का निरीक्षण करें ।
नोट: आकार और microsphere के उत्पादन की गति समाधान के flowrate और खनिज तेल प्रवाह (तालिका 2) के लिए लागू दबाव पर निर्भर करते हैं ।
3. परफॉर्मिंग Polyacrylamide Oligo-Microspheres काउंट्स
- hemocytometer ठहराव के लिए, एक छोटी राशि ले लो (लगभग १०० μL) polyacrylamide oligo के जलीय समाधान की-microspheres और जगह कांच hemocytometer पर, और धीरे से microsphere निलंबन भरने के लिए गिनती कक्ष के चहेतों ।
नोट: अधिक जानकारी के लिए, http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer देखें. - 16 चौकों में से एक सेट में microspheres गिनती करने के लिए एक माइक्रोस्कोप और हाथ टैली काउंटर का उपयोग करें । फिर, hemocytometer कक्ष के अगले सेट करने के लिए ले जाएँ और 16 कोनों के सभी चार सेट गिना जाता है जब तक गिनती पर ले जाएँ.
- औसत microsphere गिनती निर्धारित करें और मूल मनका निलंबन में microspheres की संख्या की गणना ।
- microspheres के १०० μL को एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरित करें । कोमल केंद्रापसारक (४०० x g) और pipetting के माध्यम से supernatant निकालें ।
4. Polyacrylamide Oligomicrosphere की सतह पर डीएनए संकरण प्रदर्शन
नोट: एक समान डीएनए जांच के साथ एक 5 '-एनएच2-समूह के बजाय 5 '-acrytide संशोधन समाधान मैं और एपी के लिए परीक्षण में जोड़ा जाता है समानांतर में microspheres युक्त । डीएनए संकरण परिणाम चित्रा 2में दिखाया गया है । Cy3-लेबल पूरक oligonucleotide जांच (कैप) समाधान एक अंधेरे कमरे में रखा जाना चाहिए ।
- 1xTE बफर के १०० μL का उपयोग Cy3 टोपी resuspend (ते बफर: 10 मिमी Tris और 1μM EDTA, पीएच ८.०) १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. उदाहरण के लिए, ते बफर और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण के १०० मिलीलीटर में टोपी के 1 pmol resuspend ।
नोट: कतरा दृश्यों के लिए, तालिका 3देखें । - एपी-copolymerized microspheres युक्त एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए Cy3-टोपी की १०० माइक्रोन जोड़ें ।
- ट्यूब कुछ ही बार मिश्रण करने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर गर्मी 1 एच के लिए टैप करें ।
- supernatant छोड़ें और pipetting के माध्यम से अवशिष्ट बफ़र निकालें ।
- कुल्ला करने के लिए ५०० μL ते बफर के साथ तीन बार ।
- धीरे microcentrifuge ट्यूब दोहन द्वारा microspheres resuspend । उसके बाद, चरण ४.४ दोहराएँ ।
- ग्लास स्लाइड पर microspheres प्लेस (७५ mm x ५० mm) और इमेजिंग करने से पहले एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर ।
5. ssDNA बढ़ाना के लिए असममित पीसीआर
- ssDNA बढ़ाना के लिए एक असममित पीसीआर एजेंट मिश्रण तैयार विश्लेषण किया जाना है । बर्फ पर टेबल 4 में रिएजेंट्स गल जाते हैं । बर्फ पर Taq पोलीमरेज़ एंजाइम (५० U/µ l) रखने के लिए नहीं है, बल्कि यह दुकान पर-20 ° c जब तक की जरूरत है ।
- धीरे भंवर सभी एजेंट और फिर संक्षेप में १०,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक 10 एस के लिए ।
- सभी एजेंट तालिका 4 में वर्णित के रूप में संयोजित ।
- एक thermocycler में नमूने प्लेस और निंनलिखित शर्तों के तहत असममित पीसीआर शुरू: 25 चक्र (30 एस के लिए ९५ ° c, 30 एस के लिए ५२ डिग्री सेल्सियस, और ७२ ° c 30 s के लिए), ८५ ° c 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
6. Microsphere-ssDNA बढ़ाना के लिए पीसीआर
नोट: यह खंड एक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में ssDNA बढ़ाना के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है । Microsphere-पीसीआर प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया मात्रा के ५० μL में प्रदर्शन किया गया । विस्तृत अनुक्रम ssDNA बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया गया तालिका 5में सूचीबद्ध हैं । इस मामले में, microspheres की सतह पर एपी एक पूरक तरीके से यादृच्छिक डीएनए टेम्पलेट्स को ऐनी कर सकते हैं. यह पूरक डीएनए किस्में (antisense डीएनए किनारा, चित्रा 3) के उत्पादन के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । डीएनए विस्तारित microsphere-पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
- microsphere-पीसीआर रिएजेंट मिक्स तैयार करें । बर्फ पर तालिका 6 में रिएजेंट्स गल; हालांकि, बर्फ पर Taq पोलीमरेज़ एंजाइम न रखें । इसे स्टोर-20 ° c जब तक की जरूरत है ।
- धीरे भंवर सभी एजेंट और फिर संक्षेप में १०,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक 10 एस के लिए ।
- सूक्ष्म गिनती के माध्यम से लगभग ~ 25 microspheres प्राप्त करें ।
नोट: एक प्रतिक्रिया ट्यूब में microspheres की संख्या 40X आवर्धन के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं. के बारे में ~ 25 microspheres microsphere-पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है । अधिक विस्तृत जानकारी चरण 3 में है । - तालिका 6 में वर्णित के रूप में सभी एजेंट संयोजित ।
- एक thermocycler में नमूने प्लेस और निंनलिखित शर्तों के तहत असममित पीसीआर शुरू: 25 चक्र (30 एस के लिए ९५ ° c, 30 एस के लिए ५२ डिग्री सेल्सियस, और ७२ ° c 30 s के लिए), ८५ ° c 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
- निम्न प्रवर्धन, 6x लोड करने वाले बफ़र की 8 μL जोड़ें और प्रत्येक नमूने के 15 μL को 2% agarose जेल में लोड करें । उसके बाद, ट्रो पर १०० V के लिए ३५ मिनट में 1x ताे (Tris-एसीटेट-EDTA, ४० mm Tris एसीटेट, 1 mm EDTA, pH ८.२) बफ़र निष्पादित करें ।
7. फोकल माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण
नोट: microsphere-डीएनए जांच संकरण के परिणाम एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत imaged कर रहे हैं । छवि विश्लेषण ImageJ का उपयोग किया जाता है ।
- एक धारक में माइक्रोस्कोप के मंच के लिए संकर microspheres फिक्स ।
- लेजर का चयन करें (हीलियम/नियॉन लेजर, ५४३ एनएम लाइन) और लेजर नियंत्रण में चालू है ।
- माइक्रोस्कोप नियंत्रण में उद्देश्य लेंस का चयन करें ।
- कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण में Cy3 और चैनल के लिए इच्छित फ़िल्टर का चयन करें ।
- प्रयोग शुरू करें और नमूना का निरीक्षण । फोकल माइक्रोस्कोप के लिए सेटिंग्स 7 तालिकामें संक्षेप हैं ।
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Representative Results
गढ़े पॉलिमर छोटी बूंद आधारित microfluidic मंच दो PDMS परतों (आंकड़ा 1a) के होते हैं । microfluidic चैनल नेटवर्क के तीन प्रकार के microspheres पैदा करने के लिए उपयोग किया जाता है: 1) फ्लो-फोकस ज्यामिति के रूप में चित्र 1bमें दिखाया गया, 2) समाधान मैं और समाधान द्वितीय मिश्रण के लिए एक र्ें चैनल, और 3) microsphere के लिए एक बहुलकीकरण चैनल solidification. सभी चैनलों की ऊंचाई ६० माइक्रोन थी । मिश्रण और बहुलकीकरण के लिए चैनल लंबाई ७४.३५ मिमी और ९४.४५ मिमी, क्रमशः थे । दो immiscible द्रव प्रवाह के लिए microchannel की चौड़ाई और खनिज तेल के प्रवाह के लिए एक १०० माइक्रोन और २०० माइक्रोन, क्रमशः थे । छिद्र संरचना microsphere गठन के लिए इस्तेमाल किया ५० माइक्रोन लंबाई और 25 माइक्रोन चौड़ाई का था । विसारक संरचना के कोण ३७ ° था । एक प्रयोगशाला आधारित खनिज तेल और दो सिरिंज-समाधान प्रवाह (चित्रा 1c) के लिए पंपों के सतत प्रवाह के लिए वायवीय नियंत्रण प्रणाली microfluidic मंच (चित्रा 1 डी) में microspheres पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया गया । microspheres के उत्पादन की गति के बारे में 30 microspheres प्रति सेकंड था जब समाधान और लागू दबाव की प्रवाह दर ०.६ एमएल/एच और १०८ केपीए में थे, क्रमशः (तालिका 2) । माइक्रो चैनल में इसका व्यास ७८.७ ± २.५ मी. microspheres के पर प्रवाह संश्लेषण सफलतापूर्वक microfluidic डिवाइस का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है । मनका आकार सूजन के बाद मापा गया । परिणामी microspheres का औसत व्यास १५०.४ ± १२.८ मी. आकार रूपांतरों के बारे में ८.५% थे । microspheres पानी में सूजन से गुजरना, एक विशाल आकार में वृद्धि के परिणामस्वरूप ।
microsphere के copolymerizable गुण विविध हो सकते हैं । हम एक 5 '-acrydite-डीएनए जांच microsphere समाधान में शामिल (समाधान मैं, 1 तालिकादेखें) । सह बहुलकीकरण के बाद, एक पूरक डीएनए जांच फ्लोरोसेंट डाई, Cy3 के साथ लेबल है, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में अच्छी तरह से copolymerizable oligomicrospheres के संश्लेषण को साबित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर कार्यात्मक संकरण microspheres की सतह । microsphere की फ्लोरोसेंट छवियों चित्रा 2में दिखाया गया है । यदि microspheres सही ढंग से 5 '-acrydite-डीएनए जांच के साथ कार्यात्मक रहे हैं, वे सतह पर फ्लोरोसेंट गतिविधि के कवरेज में संकरण प्रयोग के दौरान परिणाम चाहिए । यदि copolymerization सही ढंग से नहीं हुआ, ऑप्टिकल microsphere छवि microspheres के अंदर आंतरिक संदूषण प्रदर्शित करेगा । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, वहां यादृच्छिक आंतरिक अभिविंयास का कोई हस्तक्षेप नहीं है । इस परिणाम ने हमें डीएनए जांच प्रस्तुति को 3-आयामी (3-डी) व्यवस्था और microsphere-पीसीआर में ले जाने की अनुमति दी । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक समान डीएनए जांच के साथ एक 5 '-NH2-समूह के बजाय एक 5 '-acrytide संशोधन microsphere8के प्रवाह संश्लेषण के दौरान copolymerize नहीं किया ।
जब microspheres के साथ काम करना, एक डीएनए oligo के साथ 3-डी सतह जोड़ तोड़-जांच एक बहुत तेजी से14प्रक्रिया है । इसलिए, एक पर प्रवाह microsphere संश्लेषण मंच ssDNA प्रवर्धन और शुद्धि के लिए एक उपकरण प्रदान कर सकते हैं, के रूप में चित्र 3में उल्लिखित । विरोधी नब्ज डीएनए टेंपलेट (-, पूरक टेंपलेट) एक यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट जोड़कर बढ़ाया जा सकता है (+, टेंपलेट) । इस मामले में, शुरू में copolymerized 5 '-एपी अपने पूरक टेंपलेट (७६ nt) के लिए एनीलिंग के बाद डीएनए बहुलकीकरण के लिए एक 3 '-ओह अंत प्रदान करता है । Microsphere-पीसीआर एक एकल पीसीआर में प्रदर्शन किया जा सकता है microtube कार्यात्मक microspheres, एक यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट का उपयोग कर, और एक टैग आगे प्राइमर । आदेश में यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट (+ टेंपलेट, ७६ nt) से परिणामी ssDNA amplicons भेद करने के लिए, आगे प्राइमर एक अतिरिक्त 24 न्यूक्लियोटाइड टैग है । यदि आगे प्राइमर एक अतिरिक्त टैग अनुक्रम नहीं है, यह बहुत ssDNA amplicons और प्रारंभिक यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट के बीच पहचान मुश्किल है ।
एक असममित पीसीआर प्रयोग किया गया । हम चित्रा 4में दिखाया गया के रूप में dsDNA संदूषणों का निरीक्षण करने में सक्षम थे । ज्यादातर मामलों में, यह streptavidin-लेपित चुंबकीय मोती और exonuclease पाचन का उपयोग कर ssDNA को अलग करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, microsphere-पीसीआर एक भी प्राइमर (टैग आगे प्राइमर) के कुशल उपयोग के लिए जलीय चरण में ssDNA जमा करता है । यह आशा की जाती है कि dsDNA संदूषण microspheres की सतह पर संलग्न होंगे । इसलिए, ssDNA amplicons pipetting के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है के लिए आवश्यकता के बिना केंद्रापसारक । परिणामी ssDNA जेल ट्रो विश्लेषण के माध्यम से सिंथेटिक आकार मार्करों (७६ nt ssDNA और १०० nt ssDNA) की तुलना करके प्रदर्शन किया गया ।
चित्रा 1: microfluidic मंच । (क) गढ़े microfluidic मंच, (ख) प्रवाह को ध्यान में रखते हुए ज्यामिति के बढ़े हुए, (ग) प्रयोगात्मक सेट अप, और (घ) microspheres की सतत पीढ़ी दिखा छवियों पर कब्जा कर लिया । 1: प्रवाह के लिए माइक्रो चैनल संरचना ध्यान केंद्रित ज्यामिति, 2: मिश्रण समाधान के लिए, 3: microsphere solidification के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: microspheres की सतह पर डीएनए संकरण की फ्लोरोसेंट readout । 5 '-Acrydite-संशोधित डीएनए जांच (एपी) पूरक Cy3 लेबल डीएनए जांच (कैप) के साथ hybridizing करने में सक्षम थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: microsphere-पीसीआर प्रोटोकॉल का चित्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: पारंपरिक असममित पीसीआर और microsphere-पीसीआर के बीच तुलना. मी ssDNA मार्कर (76mer and 100mer), लेन 1; असममित पीसीआर, लेन 2; Microbeads-पीसीआर । पिछले काम8से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| अभिकर्मक | मिश्रण में मात्रा (μएल) | अंतिम एकाग्रता | |
| समाधान मैं | ४०% Acrylamide: भा ज प हल (19:1) | 25 | 10 |
| १०० माइक्रोन Acrydite जांच (एपी, 5 '-Acrydite-(TTTTTTT, linker अनुक्रम) आगा TTG CAC TTA CTA TCT-3 ') | 10 | 10 माइक्रोन | |
| 5x TBE बफर (Tris-base-EDTA) | 10 | 0.5 x | |
| पानी | 5 | - | |
| समाधान II | 20% अमोनियम persulfate | ५० | 10 |
| समाधान III | TEMED (एन,एन,एन′,एन′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | ०.४०% |
| खनिज तेल | १००० | - | |
तालिका 1. पर-फ्लो polyacrylamide microsphere संश्लेषण के लिए रिएजेंट मिक्स अवयव ।
| ऑपरेशनल कंडीशन | Microsphere उत्पादन की गति |
|
| समाधान flowrate | तेल दबाव | |
| (एमएल एच/ | केपीए | (/सेकंड) |
| ०.४ | ८२ | ७.१ |
| ०.५ | ९४ | १३.३ |
| ०.६ | १०८ | २८.९ |
| ०.७ | ११६ | ३६.५ |
तालिका 2. प्रचालनात्मक परिस्थितियां और उत्पादित microsphere का सारांश ।
| डीएनए जांच | दृश्यों |
| Cy3 त्यसपछि पूरक oligonucleotide जांच (cAp) | 5 '-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3 ' |
| टैग (पहले 24 nt)-आगे प्राइमर | 5 '-GGT AAT ACG कृत्य CAC ताट AGG ढकोसला अता सीसीए GCT ताट टीसीए ATT-3 ' |
तालिका 3. डीएनए जांच की सीक्वेंस की जानकारी ।
| अभिकर्मक | 1x प्रतिक्रिया के लिए मात्रा (μएल) | अंतिम एकाग्रता |
| यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट | 1 | 1 एनजी/μL |
| टैग-फॉरवर्ड प्राइमर | 1 | ०.४ माइक्रोन |
| रिवर्स प्राइमर | 1 | ०.०२ माइक्रोन |
| 10x Taq बफर | 5 | 1X |
| 10 एमएम की dNTP | 4 | २.५ एमएम |
| माजी taq (1000U) | ०.२ | 1 यू |
| पानी | ३७.८ | - |
| कुल | ५० | - |
तालिका 4. 20 एल प्रतिक्रिया में असममित पीसीआर रिएजेंट मिक्स घटकों ।
| टेम्पलेट | अनुक्रम | लंबाई (nt) |
| यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट | 5 '-अता सीसीए GCT ताट टीसीए ATT (यादृच्छिक अनुक्रम, ४० मेर) आगा तग ताा GTG CAA TCT-3 ' | ७६ |
| टैग-फॉरवर्ड प्राइमर (टैग-एफ) | 5 '-GGT AAT ACG कृत्य CAC ताट AGG ढकोसला अता सीसीए GCT ताट टीसीए ATT-3 ' | ४२ |
| रिवर्स प्राइमर | 5 '-आगा TTG CAC TTA CTA TCT-3 ' | 18 |
तालिका 5. Microsphere-पीसीआर के लिए अनुक्रम जानकारी ।
| अभिकर्मक | 1x प्रतिक्रिया के लिए मात्रा (μएल) | अंतिम एकाग्रता |
| एपी-Microspheres | ~ 25 microspheres | - |
| यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट | 1 | 1 एनजी/μL |
| टैग-फॉरवर्ड प्राइमर | 1 | ०.४ माइक्रोन |
| 10x Taq बफर | 5 | 1X |
| 10 एमएम dNTP | 4 | २.५ एमएम |
| माजी taq (1000U) | ०.२ | 1 यू |
| पानी | ३७.८ | - |
| कुल | ५० | - |
तालिका 6. ५० एल रिएक्शन में Microsphere-पीसीआर रिएजेंट मिक्स अवयव ।
| स्कैन मोड | विमान |
| स्केलिंग | X: २.४९ माइक्रोन, वाई: २.४९ माइक्रोन |
| स्टैक आकार | X: १२७२.७९ माइक्रोन, वाई: १२७२.७९ माइक्रोन |
| ज़ूम स्कैन करें | ०.७ |
| उद्देश्य | ईसी योजना-Neofluar 10 x/०.३ M27 |
| औसत | 1 |
| Pinhole | Ch2:१०४ उम |
| फ़िल्टर | Ch3: एल. पी. ४२० |
| बीम बंटवारे | एमबीएस: HFT ४८८/५४३, DBS1: दर्पण, DBS2: NFT ५१५, FW1: कोई नहीं |
| तरंगदैर्ध्य | ५४३ एनएम १००.०% |
तालिका 7. फोकल माइक्रोस्कोप के लिए सेटिंग्स ।
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Discussion
dsDNA का संदूषण ssDNA प्रवर्धन में एक प्रमुख मुद्दा है. यह पारंपरिक असममित पीसीआर प्रवर्धन15में dsDNA वर्धन को कम करने के लिए मुश्किल रहता है । इसके अलावा, हालांकि ssDNA पैदा करने के लिए तकनीकी सुधार हमें नमूना प्रवाह की क्षमता बढ़ाने के लिए सक्षम है, ssDNA अलगाव अभी भी अपनी उच्च लागत और अपूर्ण शुद्धि पैदावार के कारण समस्याग्रस्त है ।
असममित पीसीआर सबसे चुनौतीपूर्ण इस्तेमाल किया जब ssDNA के साथ काम करने के तरीकों में से एक है । इस विधि ssDNA की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के क्रम में प्राइमर (जैसे, 20:1 अनुपात) की असमान मात्रा पर लागू होता है. हालांकि, यह उपज ssDNA करने के लिए हर प्रवर्धन प्रतिक्रिया का अनुकूलन करने के लिए बहुत मुश्किल है । इस प्रकार, शोधकार्य (dsDNA) को resultants4से समाप्त करना होगा ।
आदेश में अतिरिक्त जुदाई कदम के बिना ssDNA उत्पंन करने के लिए, हम polyacrylamide microspheres डीएनए जांच acrydite copolymerization विधि के आधार पर बेनकाब करने के लिए उत्पादन किया । हमारे डीएनए लगाव विधि आसानी से एक छोटी बूंद का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था आधारित microfluidic मंच । Copolymerized oligomicrospheres वाले अतिसूक्ष्म व्यास का सफलतापूर्वक उत्पादन किया गया. नतीजतन, microsphere-पीसीआर एक ट्यूब प्रतिक्रिया में ssDNA बढ़ाना इस्तेमाल किया गया था । बेशक, अन्य पीसीआर प्रयोगों के लिए इस प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए, सामान्यतः आवश्यक समायोजन (जैसे, प्रवर्धन चक्र, एनीलिंग तापमान, और टेम्पलेट दृश्यों को बदलने) की आवश्यकता है. अंत में, microsphere-पीसीआर यहां विस्तृत किया गया है, यह परख विकास, डीएनए अनुक्रमण, और डीएनए microarray विश्लेषण के लिए उपलब्ध बना ।
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Disclosures
लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन के हकदार एक परियोजना द्वारा समर्थित है "कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम (परियोजना सं. PJ0011642) "ग्रामीण विकास प्रशासन, कोरिया गणराज्य द्वारा वित्त पोषित । यह शोध भी आंशिक रूप से एक अनुदान (एनआरएफ-2017R1A2B4012253) बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना बना, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध भी व्यापार, उद्योग और ऊर्जा, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित रचनात्मक और औद्योगिक अभिसरण के लिए शिक्षा कार्यक्रम के एक अनुदान (N0000717) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
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