Summary
Bu eser mikrosıvısal damlacık tabanlı platformlar imalatı ve polyacrylamide mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için uygulanması için bir yöntem sağlar. Microsphere-PCR yöntemi, Çift iplikçikli DNA ayıran olmadan tek iplikçikli DNA amplicons elde olanak verir.
Abstract
Damlacık tabanlı Havacilik sağlayan kontrollü boyutu ve elde edilen microsphere morfoloji mikrosıvısal kanaldaki homojen mikroküreler güvenilir üretim etkinleştirin. Bir acrydite-DNA prob ile copolymerized bir microsphere başarıyla fabrikasyon. Asimetrik PCR, eksonükleaz sindirim ve manyetik boncuklar streptavidin kaplı üzerinde yalıtım gibi farklı yöntemler tek iplikçikli DNA (ssDNA) sentezlemek için kullanılabilir. Ancak, bu yöntemleri verimli bir şekilde yüksek oranda saflaştırılmış ssDNA büyük miktarda kullanamazsınız. Burada, biz nasıl ssDNA olabilir etkili bir şekilde güçlendirilmiş ve dsDNA sadece bir PCR reaksiyon tüpünden pipetting tarafından ayrılmış ayrıntılı bir microsphere-PCR protokolü tanımlamak. SsDNA amplifikasyon DNA Mikroarray ve DNA-SELEX (sistematik evrimi ligandlar üstel zenginleştirme tarafından) işlemler potansiyel Kimyasalları olarak uygulanabilir.
Introduction
Tek iplikçikli DNA (ssDNA) kapsamlı bir moleküler tanıma öğesi (MRE) olarak içsel özelliklerini DNA-DNA hibridizasyon1,2için nedeniyle kabul edilmiştir. SsDNA sentetik sistemlerinin geliştirilmesi DNA microarrays3, oligotherapeutics, tanılama ve tamamlayıcı etkileşimleri4,5dayalı entegre moleküler algılama gibi biyolojik uygulamalar yol açabilir.
Bugüne kadar mikrometre ölçekli polimer parçacıkları başarıyla mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak gösterilmiştir. Birkaç mikrosıvısal teknikleri son derece homojen mikroküreler microchannel çevre6,7sürekli akışı üretmek için güçlü olduğu kanıtlanmış.
Lee ve ark. çalışmada 8, copolymerizable oligo-microsphere ve ssDNA amplifikasyon mikrosıvısal sentezi için bir mikrosıvısal damlacık tabanlı platform bildirildi. Mikrosıvısal platform iki PDMS (polydimethylsiloxane) katmandan oluşur: microsphere ve bir alt düz bölüm oluşturmak için bir mikrosıvısal kanal ağı ile bir üst kısmı. Bunlar PDMS sıvı kanallarını üç çeşit oluşur: Kanal damlacık üretimi için iki çözüm karıştırma için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere katılaşma için 3) bir sıralı polimerizasyon kanal odaklanarak 1) bir akış. Bir kez iki immiscible akar tek PDMS sıvı kanalı tanıttı, akar dar delik yapısı içerisinde zorlanacak. Kanal geometri, akış hızı ve viskozite gibi akışı davranışlar microsphere Morfoloji ve boyutu etkiler. Bu nedenle, ana sıvı akışı microscale monospheres9,10ayrılabilir.
Burada, detaylı microsphere-PCR Protokolü ssDNA güçlendirme için sağlanır. İlk olarak, bir damlacık tabanlı mikrosıvısal aygıt tasarım işlemi açıklanmıştır. Sonra hangi polyacrylamide mikroküreler rasgele DNA şablonuyla tamamlayıcı bir şekilde functionalized yolu açıkladı. Son olarak, ssDNA yükseltecek bir microsphere-PCR Protokolü gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bir PDMS mikrosıvısal Platform imalatı
- 20 mL sıvı PDMS prepolymer temel polimer ve katalizör 10:1 bir hacim oranı karıştırarak hazırlayın. Silikon gofret için üst kısmındaki mikrosıvısal ağ üzerinde 10 mL sıvı PDMS hazırlanmış bir SU-8 kalıp üzerine dökün. Alt düz bölümü için bir kalıp yapısı olmadan silikon gofret sıvı PDMS aynı hacmi dökmek.
Not: Mikrosıvısal ağ CAD programında tasarlanmış ve bir photomask tipik fotolitografi işlem (bkz: Tamamlayıcı rakamlar) kullanarak bir ana imal için dönüştürülür. Bu ana negatif fotorezist SU-8 kalıp silikon gofret11oluşur. - Sıcak plaka ve tedavi için 30 dk. 75 ° C'de sıvı PDMS prepolymer ile kaplı iki silikon gofret yerleştirin.
- El ile SU-8 kalıp tedavi PDMS katmandan akasındaki. 1.5 mm çapında yuvarlak delik delme aracı mikron çaplı akış kanalları makro sıvı örnekleri ile arabirim için çoğaltılmış mikrosıvısal ağ üzerindeki yağ noktasına hizalayın. Üzerinden-el ile delik.
- Bu işlem üç kez iki çözüm ve çıkış bağlantı noktası oluşumu için delme işlemi yineleyin.
- Hem üst hem de alt PDMS katmanları birkaç saniye örnek başına bir el corona treater12 kullanarak hidrofilik yüzey işleme gerçekleştirin.
- 30 dakika sıcak bir tabak PDMS PDMS yapıştırma işlemi için kullanma iki plazma tedavi PDMS katmanları ve 90 ° C ısıda yığını. Yapısal bağ ve sızıntı fabrikasyon cihazın test için üç giriş liman şırınga pompa kullanarak basınçlı su.
2. Polyacrylamide Oligo-mikroküreler imalatı
- Tablo 1' de ayrıntılı boncuk karışımı hazırlayın.
- Girdap ve kısaca santrifüj standart ssDNA acrydite sonda (Ap, 100 mikron) ve acrylamide:bis (19:1) hisse senedi çözüm etiketli.
- Çözüm hazırlamak ben % 40 akrilamid 25 μL bis çözüm, ssDNA (acrydite sonda) 10 μL, 5 x TBE arabelleği (1.1 M Tris; 900 mM bor; 25 mM EDTA) 10 μL ve su 5 μL karıştırma tarafından. Çözüm II ile % 20 amonyum Persülfat 50 μL hazırlayın.
- İki hazırlamak şırıngalar tek tek ben ve çözüm II çözüm ile doldurulmuş ve çözüm akar mikrosıvısal platformu tanıtmak için pompa üzerine mount. Mineral yağ ile % 0,4 karışık hazırlamak TEMED microsphere yüzey katılaşma için.
Not: TEMED iyi bir serbest radikal sabitleyici bilinir. Serbest radikallerin polimer oluşumu ile amonyum Persülfat (APS) oranı akrilamid polimerizasyonu katalizler için hızlandırabilir. - Bir cam şişe sürekli bir akış oluşturmak için mineral yağ 4 mL ile doldurulması.
- Bir mikrosıvısal rezervuar olarak cam şişe kapağı iki tüp iki bağlantı noktalarına ekleyin: hava kompresörü ve mikro kanal ağa basınçlı petrol temini için sıvı limana cam şişe içine sıkıştırılmış hava uygulamak için pnömatik bağlantı noktası Cam şişeden. Tüplerin arasında cam şişe ve mikrosıvısal aygıt petrol limanda bağlayın.
- Tüpler şırınga pompalar iki çözüm sağlamak amacıyla mikrosıvısal cihazın iki çözüm bağlantı noktalarına bağlayın. Oluşturulan microsphere kabı aktarmak için tüpler çıkış bağlantı noktasına takın.
- Enjektör pompa debisi 0.4 - 0.7 mL/h. ayarlama basınçlı hava basınç regülatörü (82-116 kPa) kullanarak Kompresör için ayarlayın. Manyetik karıştırıcı çubuk dönüş hızı (500 rpm) cam kabı sıcak plaka üzerinde ayarlayın. Enjektör pompa çalıştırmak ve bir elektromanyetik valf13ON/OFF kontrolünü kullanarak cam şişe içine bir dış kompresör tarafından oluşturulan sıkıştırılmış hava tedarik.
- Mikroküreler akışı odaklanarak geometri oluşumu ve cam ölçek oluşturulan mikroküreler katılaşma dijital mikroskop gözlemlemek.
Not: Microsphere boyut ve üretim hızına bağlıdır üzerinde debisi çözümleri ve mineral yağ akışı için uygulanan basınç (Tablo 2).
3. performans Polyacrylamide Oligo-mikroküreler sayar
- Hemasitometre miktar için bir az miktarda (yaklaşık 100 μL) sulu çözüm polyacrylamide oligo-mikroküreler ve yerde bulunan cam hemasitometre al ve yavaşça microsphere süspansiyon kadar sayım odası iyi doldurun.
Not: daha fazla ayrıntı için http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer bakın. - Mikroskop ve el taksitli sayaç kümesi 16 kareler mikroküreler kullanın. Sonra hemasitometre odası sonraki kümesini taşıma ve 16 köşeler tüm dört setleri sayılır kadar güveniyor taşırlar.
- Ortalama microsphere sayısı belirlemek ve özgün boncuk süspansiyon mikroküreler sayısını hesaplayın.
- Mikroküreler 100 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Nazik (400 x g) centrifuging ve pipetting aracılığıyla süpernatant kaldırın.
4. performans gösteren DNA hibridizasyon Polyacrylamide Oligomicrosphere yüzeyi
Not: Bir aynı DNA prob 5'-NH2-5'-acrytide değişiklik yerine çözüm ben eklenir ve Ap içeren mikroküreler paralel olarak test. DNA hibridizasyon sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Cy3 etiketli tamamlayıcı oligonükleotid problar (cAp) çözüm karanlık bir odada yer almalıdır.
- Cy3-kap 100 μL 1xTE arabellek kullanarak resuspend (TE arabellek: 10 mM Tris ve 1μM EDTA, pH 8.0) 100 mikron son bir konsantrasyon sağlamak için. Örneğin, TE arabellek ve alüminyum folyo ile kaplı bir microcentrifuge tüp transfer 100 ml kap 1 pmol resuspend.
Not: strand dizileri için Tablo 3' e bakın. - Cy3-kap 100 mikron mikroküreler Ap copolymerized içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp için ekleyin.
- Tüp birkaç kez dokunun karıştırmak ve 1 h için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Süpernatant atmak ve pipetting aracılığıyla kalan arabellek kaldırın.
- Üç kez TE arabellek 500 μL ile yıkayın.
- Mikroküreler microcentrifuge tüp hafifçe dokunarak resuspend. O zaman, 4.4 adımları yineleyin.
- Mikroküreler görüntüleme önce alüminyum folyo ile kapatın ve cam slayt (75 mm x 50 mm) yerleştirin.
5. asimetrik PCR ssDNA yükseltecek için
- Asimetrik bir PCR reaktif mix ssDNA çözümlenmesi için yükseltecek için hazırlayın. Reaktifler buz üzerinde Tablo 4 çözülme. Buz Taq polimeraz enzimi (50 U/µL) tutmak değil, ama oldukça-20 ° C de ihtiyaç kadar saklayın.
- Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.
- Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 4.
- Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun
6. Microsphere PCR ssDNA yükseltecek için
Not: Bu bölüm için ssDNA bir PCR reaksiyon tüp yükseltecek protokolünü açıklar. Microsphere-PCR reaksiyonları tepki birim 50 μL içinde gerçekleştirilmiştir. Detaylı dizileri ssDNA yükseltmek için kullanılan Tablo 5' te listelenen. Bu durumda, Ap mikroküreler yüzeyindeki rastgele DNA şablonları için tamamlayıcı bir şekilde tavlama. Bu tamamlayıcı DNA dizilerini (antianlamlı DNA dizisi, Şekil 3) üretimi için çok önemli bir adımdır. Genişletilmiş DNA microsphere-PCR güçlendirme için şablon olarak kullanılır.
- Microsphere-PCR reaktif karışımı hazırlayın. Reaktifler Tablo 6 buz çözme; Ancak, Taq polimeraz enzimi buz üzerinde tutmayın. -20 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.
- Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.
- Yaklaşık ~ 25 mikroküreler mikroskobik sayma yoluyla elde edilir.
Not: 40 X büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak bir tepki tüp mikroküreler sayısı hesaplanır. Yaklaşık 25 ~ mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için kullanılır. Daha ayrıntılı bilgi adım 3'de. - Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 6.
- Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun
- Aşağıdaki amplifikasyon, arabellek yükleme x 6 8 μL ekleyin ve her örneğinin 15 μL % 2 özel jel yükleyin. O zaman, 35 dk. 1 için 100 V Elektroforez gerçekleştirmek x TAE (Tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH 8.2) arabellek.
7. confocal mikroskobu edinme
Not: Microsphere-DNA prob hibridizasyon sonuçlarını confocal mikroskop altında görüntüsü. Görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.
- Mikroskop sahneye melezleşmiştir mikroküreler bir tutucu içinde düzeltmek.
- Lazer (helyum/Neon lazer, 543 nm hattı) seçin ve lazer denetiminde açın.
- Objektif lens mikroskop denetimi içinde seçin.
- Cy3 ve yapılandırma denetim kanalı için istediğiniz filtreyi seçin.
- Deneme başlatmak ve örnek gözlemlemek. Confocal mikroskop için ayarlar Tablo 7' de özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikasyon polimer mikrosıvısal damlacık tabanlı platform iki PDMS kat (Şekil 1a) oluşur. Üç tür mikrosıvısal kanal ağları mikroküreler oluşturmak için kullanılır: Şekil 1b, karıştırma çözüm ben ve çözüm II için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere için 3) bir polimerizasyon kanal gösterildiği gibi 1) akışı odaklanarak geometri Katılaşma. Tüm kanallar yüksekliği 60 mikron oldu. Karıştırma ve polimerizasyon için kanal uzunluğu 74.35 mm ve 94.45 mm, sırasıyla vardı. Microchannel iki immiscible sıvı akar ve mineral yağ akışı için bir için genişlikleri 100 mikron ve 200 mikron, sırasıyla idi. Microsphere oluşumu için kullanılan delik yapısı 50 mikron uzunluğunda ve 25 mikron genişliği oldu. Difüzör yapısı açısını 37 ° yapıldı. Mineral yağ, sürekli akış için bir laboratuar tabanlı pnömatik kontrol sistemi ve çözüm akışı (resim 1 c) için iki şırınga pompa mikroküreler mikrosıvısal platformu (Şekil 1 d) oluşturmak için kullanılmıştır. Mikroküreler üretim hızını saniyede çözümleri ve uygulanan basınç debi iken 0.6 mL/h ve 108 kPa, sırasıyla yaklaşık 30 mikroküreler yapıldı (Tablo 2). Çapına mikro kanal 78.7 ± 2,5 m olduğunu. Mikroküreler akışı üzerinde sentezi başarıyla mikrosıvısal aygıtı kullanarak manipüle edilebilir. Boncuk boyutlarda şişme sonra ölçüldü. Elde edilen mikroküreler ortalama çapı 150.4 ± 12.8 m oldu. Boyut varyasyonlarının yaklaşık %8,5 idi. Mikroküreler şişlik çok büyük boyutu artış kaynaklanan su, tabi.
Microsphere copolymerizable özelliği çeşitli olabilir. Bir 5'-acrydite-DNA araştırması microsphere çözümü haline dahil (çözüm gördüğüm Tablo 1). Co polimerizasyonu, tamamlayıcı DNA prob floresan boya, Cy3 etiketli, 1 h. Confocal için oda sıcaklığında mikroskopi copolymerizable oligomicrospheres sentezi üzerinde de fonksiyonel hibridizasyon kanıtlamak için kullanılabilir mikroküreler yüzeyine. Floresan microsphere görüntülerini Şekil 2' de gösterilmiştir. Mikroküreler doğru 5'-acrydite-DNA prob ile functionalized, onlar yüzeyi floresan faaliyet kapsamındaki hibridizasyon deneme sırasında neden. Kopolimerizasyona doğru değil oluşursa, optik microsphere görüntü iç bulaşma mikroküreler içinde sergi. Şekil 2' de gösterildiği gibi herhangi bir girişim iç rasgele yönünün vardır. Bu sonuç bize bir 3 boyutlu (3-D) düzenleme ve microsphere-PCR DNA prob sunu taşımak izin verdi. Aynı bir DNA prob ile 5'-NH2unutulmamalıdır-grup bir 5'-acrytide değişiklik yerine değil microsphere8-akış sentezi sırasında copolymerize.
Mikroküreler ile çalışırken, bir DNA oligo-sonda ile 3-b yüzey işleme bir çok daha hızlı işlem14yaşında. Bu nedenle, bir akış üzerinde microsphere sentez platformu bir araç ssDNA güçlendirme ve arıtma, Şekil 3' te belirtildiği gibi sağlayabilir. Anti-anlamda DNA şablonu (-, tamamlayıcı şablon) rastgele DNA şablonu (+ şablon) ekleyerek uzatılabilir. Bu durumda, başlangıçta copolymerized 5'-Ap 3'-OH sonunda onun tamamlayıcı şablonuna tavlama sonra DNA polimerizasyon sağlar (76 nt). Microsphere-PCR functionalized mikroküreler, rasgele bir DNA şablonu ve bir etiket ileri astar kullanarak tek bir PCR microtube içinde gerçekleştirilebilir. Sonuç ssDNA amplicons rasgele DNA şablonundan ayırmak için (+ şablon, 76 nt), ileri astar bir ek 24 nükleotit etiketi vardır. İleri astar bir ek etiket sıra varsa, ssDNA amplicons ve ilk rastgele DNA şablonu arasında tanımak çok zordur.
Asimetrik PCR deney gerçekleştirildi. Olduğumuzu dsDNA kirletici Şekil 4' te gösterildiği gibi gözlemlemek mümkün. Çoğu durumda, manyetik boncuklar streptavidin kaplı ve eksonükleaz sindirim kullanarak ssDNA izole etmek gereklidir. Ancak, microsphere-PCR sulu faz ssDNA toplamaya tek bir astar (etiket ileri astar) verimli kullanılmasını sağlar. Bu dsDNA kirletici mikroküreler yüzeye atamanız da bekleniyor. Bu nedenle, ssDNA amplicons Santrifüjü gerek kalmadan pipetting yoluyla elde edilebilir. Sonuç ssDNA jel elektroforez analizi ile sentetik boyutu işaretleri (76 nt ssDNA ve 100 nt ssDNA) karşılaştırarak gösterilmiştir.
Şekil 1: mikrosıvısal platformu. (a) fabrikasyon mikrosıvısal platformu, (b) görünümü akışı odaklanarak geometri, (c) deneysel kurulumu, genişlemiş ve (d) sürekli mikroküreler nesil gösterilen imge esir alma. 1: mikro kanal yapısı geometri, 2 odaklanarak akışı için: çözümleri, 3 karıştırma için: microsphere katılaşma için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: DNA hibridizasyon yüzeyi mikroküreler floresan okuma. DNA prob (Ap) 5'-Acrydite-modified tamamlayıcı Cy3 DNA prob (cAp) etiketli hybridizing yeteneğine sahip olduğu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: örnek microsphere-PCR protokolü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: geleneksel asimetrik PCR ve microsphere-PCR arasında karşılaştırma. M; ssDNA işaretçisi (76mer ve 100mer), 1 yolu; Asimetrik PCR, Lane 2; Lastikteki-PCR. Önceki çalışma8izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | Birim Mix (μL) | Son konsantrasyonu | |
| Çözüm ben | % 40 Acrylamide:bis çözüm (19:1) | 25 | % 10 |
| 100 μm kalınlığında Acrydite sonda (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, bağlayıcı sırası) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 MİKRON | |
| 5 x TBE tampon (Tris-base-EDTA) | 10 | 0.5 X | |
| Su | 5 | - | |
| Çözüm II | % 20 amonyum Persülfat | 50 | % 10 |
| Çözüm III | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | %0.40 |
| Mineral yağ | 1000 | - | |
Tablo 1. Reaktif mix bileşenler için üzerinde polyacrylamide microsphere sentez akış.
| Operasyonel durum | Microsphere üretim hızı |
|
| Çözüm debisi | Yağ basıncı | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ sn) |
| 0,4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13,3 |
| 0,6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tablo 2. Özet çalışma koşullarda ve üretilen microsphere.
| DNA prob | Dizileri |
| Tamamlayıcı oligonükleotid sonda (cAp) etiketli Cy3 | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Etiket (ilk 24 nt)-ileri astar | 5'-GGT AAT ACG YASASI CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' |
Tablo 3. DNA probları sırası bilgi.
| Reaktif | Volume 1 x tepki için (μL) | Son konsantrasyonu |
| Rasgele DNA şablonu | 1 | 1 ng/μL |
| Etiket ileri astar | 1 | 0.4 MİKRON |
| Ters astar | 1 | 0,02 MİKRON |
| 10 x Taq arabellek | 5 | 1 X |
| dNTP 10 mM | 4 | 2.5 mM |
| Taq ex (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Su | 37.8 | - |
| Toplam | 50 | - |
Tablo 4. Asimetrik PCR reaktif 20 L tepki bileşenlerinde karıştırın.
| Şablon | Sıra | Uzunluk (nt) |
| Rasgele DNA şablonu | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Random sıralaması, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Etiket ileri astar (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG YASASI CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Ters astar | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tablo 5. Bilgi Microsphere-PCR için sıra.
| Reaktif | Volume 1 x tepki için (μL) | Son konsantrasyonu |
| AP-mikroküreler | ~ 25 mikroküreler | - |
| Rasgele DNA şablonu | 1 | 1 ng/μL |
| Etiket ileri astar | 1 | 0.4 MİKRON |
| 10 x Taq arabellek | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Taq ex (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Su | 37.8 | - |
| Toplam | 50 | - |
Tablo 6. Microsphere-PCR reaktif 50 L tepki bileşenlerinde karıştırın.
| Tarama kipi | Uçak |
| Ölçekleme | X: 2,49 mikron, Y: 2.49 mikron |
| Yığın boyutu | X: 1272.79 mikron, Y: 1272.79 mikron |
| Yakınlaştırma inceden inceye gözden geçirmek | 0,7 |
| Amaç | EC planı-Neofluar 10 x / 0.3 M27 |
| Ortalama | 1 |
| İğne deliği | CH2: 104... |
| Filtreler | Ch3: LP 420 |
| Işın ayırıcılar | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: ayna, DBS2: NFT 515, FW1: hiçbiri |
| Dalga boyu | 543 nm %100,0 |
Tablo 7. Confocal mikroskop için ayarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DsDNA kirletici ssDNA amplifikasyon içinde büyük bir sorun vardır. DsDNA amplifikasyon geleneksel asimetrik PCR güçlendirme15en aza indirmek zor kalır. SsDNA oluşturmak için teknik gelişmeler bizi örnek üretilen iş verimliliğini artırmak etkin olması, Ayrıca, ssDNA yalıtım eksik arıtma verimi ve yüksek maliyetler nedeniyle hala sorunlu olsa da.
Asimetrik PCR ssDNA ile çalışırken kullanılan en zorlu yöntemlerinden biridir. Bu yöntem astar (Örneğin, 20: 1 oranı) ssDNA büyük miktarda oluşturmak için eşit miktarda geçerlidir. Ancak, ssDNA vermeye her amplifikasyon tepki optimize etmek çok zordur. Böylece, yan (dsDNA)4resultants ortadan kaldırılmalıdır.
SsDNA ek ayrılık adımları olmadan oluşturmak için biz acrydite kopolimerizasyona yöntemiyle alan DNA probları ortaya çıkarmak için polyacrylamide mikroküreler üretti. Bizim DNA ek yöntemi bir mikrosıvısal damlacık tabanlı platformu kullanarak kolayca uyarlanmıştır. Copolymerized oligomicrospheres Microscale çapları sahip başarıyla üretildi. Sonuç olarak, microsphere-PCR tek tüp tepki ssDNA yükseltmek için kullanıldı. Tabii ki, bu yordamı diğer PCR deneyler için uyarlamak için yaygın olarak gerekli ayarlamaları (sıcaklık ve şablon dizileri tavlama amplifikasyon döngüsü değişenÖrneğin,) gereklidir. Sonuç olarak, microsphere-PCR burada, bioassay geliştirme, DNA sıralama ve DNA Mikroarray analizi için kullanılabilir hale ayrıntılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışmada "kooperatif araştırma programı için tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No başlıklı bir proje tarafından desteklenmektedir PJ0011642) "Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilmektedir. Bu araştırma da kısmen bir hibe (NMK-2017R1A2B4012253) temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı (Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da bir grant (N0000717) tarafından eğitim programı yaratıcı ve Sanayi Ticaret Bakanlığı, sanayi ve enerji, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen yakınsama için destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
