Summary
Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.
Abstract
Tröpfchen-basierte Mikrofluidik ermöglichen die zuverlässige Herstellung von homogenen Mikrosphären in den mikrofluidischen Kanal, Bereitstellung von kontrollierten Größe und Morphologie der erhaltenen Mikrosphären. Eine Mikrosphären copolymerisiert mit einer Acrydite-DNA-Sonde wurde erfolgreich hergestellt. Verschiedene Methoden wie asymmetrische PCR Exonuclease Verdauung und Isolation auf magnetische Beads Streptavidin beschichteten einsetzbar, einzelsträngiger DNA (SsDNA) zu synthetisieren. Jedoch verwenden nicht diese Methoden effizient große Mengen an hochgereinigtes SsDNA. Hier beschreiben wir eine Mikrosphären-PCR-Protokoll Details wie SsDNA effizient verstärkt und einfach durch Pipettieren von einer PCR-Reaktion-Röhre von DsDNA getrennt werden kann. Die Verstärkung der SsDNA kann als potenzielle Reagenzien für die DNA-Microarray und DNA-SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Prozesse angewendet werden.
Introduction
Einzelsträngiger DNA (SsDNA) wurde ausgiebig als molekulare Erkennung Element (MRE) aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften für DNA-DNA Hybridisierung1,2berücksichtigt. Die Entwicklung von SsDNA synthetischer Systeme führt zu biologischen Anwendungen wie DNA-Microarrays3, Oligotherapeutics, Diagnostik und integrierte molekulare Erkennung basiert auf komplementäre Interaktionen4,5.
Bisher wurden erfolgreich Mikrometer-Skala Polymerpartikel mit mikrofluidischen Geräten demonstriert. Verschiedene Techniken der mikrofluidischen nachweislich um zu mächtig für die Herstellung von sehr homogene Mikrosphären auf kontinuierlichen Flow in der Microchannel Umwelt6,7.
In der Studie von Lee Et al. 8, eine Tröpfchen-basierte Mikrofluidik Plattform für Mikrofluidik-Synthese von copolymerizable Oligo-Mikrosphären und SsDNA Verstärkung wurde berichtet. Die mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei PDMS (Polydimethylsiloxan) Schichten: einem oberen Teil mit einem Mikrofluidik-Channel-Netzwerk zur Erzeugung von Mikrosphären und einem unteren flachen Teil. Diese bestehen aus drei Arten von PDMS fluidische Kanäle: 1) einen Fluss mit Schwerpunkt Kanal für Tröpfchen Generation, (2) eine serpentine Kanal für das Mischen von zwei Lösungen und (3) eine sequenzielle Polymerisation Kanal für Mikrosphären Erstarrung. Sobald zwei nicht mischbare fließt in einen einzigen PDMS fluidische Kanal eingeführt werden, können die Ströme durch die schmale Öffnung Struktur erzwungen werden. Die Strömung Verhaltensweisen wie Kanalgeometrie, Durchfluss und Viskosität beeinflussen die Größe und Morphologie der Mikrosphären. Daher kann Microscale Monospheres9,10der Hauptstrom flüssigen unterteilt werden.
Hier ist eine detaillierte Mikrosphären-PCR-Protokoll für die Verstärkung der SsDNA zur Verfügung gestellt. Zunächst wird ein Droplet-basierte Mikrofluidik-Gerät-Design-Prozess beschrieben. Dann wird die Art und Weise, in welcher, die Polyacrylamid Mikrosphären mit zufälligen DNA Schablone komplementär funktionalisiert werden können, erklärt. Schließlich ist ein Mikrosphären-PCR-Protokoll zur Verstärkung SsDNA gezeigt.
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Protocol
(1) Herstellung einer PDMS mikrofluidischen Plattform
- Bereiten Sie 20 mL flüssige PDMS Prepolymer durch Mischen Basispolymer und Katalysator in einem Volumen-Verhältnis von 10:1. Gießen Sie 10 mL Flüssigkeit PDMS auf eine vorbereitete SU-8-Form auf einem Silizium-Wafer für den oberen Teil des Netzes mikrofluidischen. Gießen Sie für den unteren flachen Teil die gleiche Menge an flüssigem PDMS auf dem Siliziumwafer ohne Schimmel Struktur.
Hinweis: Das mikrofluidischen Netzwerk ist in einem CAD-Programm entwickelt und dann in einer Fotomaske umgewandelt, um ein Meister mit dem typischen Photolithographie-Prozess (siehe Ergänzende Zahlen) zu fabrizieren. Dieser Meister besteht aus den negativen Photoresist SU-8 Schimmel auf der Silizium-Wafer-11. - Legen Sie zwei Silizium-Wafern, beschichtet mit flüssigen PDMS-Prepolymer auf der heißen Platte und Heilung bei 75 ° C für 30 Minuten.
- Manuell die gehärtete PDMS-Schicht aus der SU-8 Form abziehen. Richten Sie einen Durchmesser von 1,5 mm Runde Loch Stanzwerkzeug um den Ölhafen im replizierten mikrofluidischen Netzwerk für die Anbindung von Mikron-Skala Strömungskanäle mit der Makro-Flüssigkeitsproben. Die Durchgangsbohrung manuell ausstanzen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die Bildung der beiden Lösungen und die Auslassöffnung Stanzen.
- Durchführen Sie hydrophile Oberflächenbehandlung in der oberen und unteren PDMS Schichten mit einer handgeführten Corona Treater12 für mehrere Sekunden pro Probe.
- Stapeln Sie zwei plasmabehandelte PDMS Schichten und Hitze bei 90 ° C für 30 Minuten mit einer Heizplatte für PDMS-PDMS-Bonding-Verfahren. Das Druckwasser mit der Spritzenpumpe in drei Einlass-Ports für die strukturellen Klebens und Dichtigkeitsprüfung des gefertigten Gerätes zu liefern.
2. Herstellung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären
- Bereiten Sie in Tabelle 1beschriebenen Wulst-Mischung zu.
- Wirbel und kurz Zentrifuge standard SsDNA Acrydite mit der Bezeichnung Sonde (Ap, 100 μM) und Acrylamide:bis (19:1) Stammlösung.
- Bereiten Sie Lösung ich durch das Mischen von 25 μL von 40 % Acrylamid BIZ Lösung, 10 μL SsDNA (Acrydite-Sonde), 10 μL der 5 X TBE-Puffer (1,1 M Tris, Borat 900 mM, 25 mM EDTA) und 5 μL des Wassers. Bereiten Sie Lösung II mit 50 μL der 20 % Ammonium bleichen.
- Bereiten Sie zwei Spritzen individuell gefüllt mit Lösung I und Lösung II und klebe sie auf die Pumpe Lösung fließt in mikrofluidischen Plattform einzuführen. Bereiten Sie Mineralöl vermischt mit 0,4 % TEMED für Oberfläche erstarren die Mikrosphären.
Hinweis: TEMED ist bekannt als freie Radikale Stabilisator. Freie Radikale können die Polymerbildung mit Ammonium Bleichen (APS) beschleunigen um Acrylamid Polymerisation zu katalysieren. - Füllen Sie eine Glasflasche mit 4 mL des Mineralöls zu einen kontinuierlichen Strom zu erzeugen.
- Legen Sie zwei Röhren mit zwei Ports in die Kappe der Glasflasche als mikrofluidischen Reservoir: der pneumatischen Anschluss für die Anwendung der Druckluft in die Glasflasche von Kompressor und dem flüssigen Hafen für die Versorgung das Drucköl, micro Channel-Netzwerk aus der Glasflasche. Schläuche zwischen der Glasflasche und Ölhafen in mikrofluidischen Gerät anschließen.
- Verbinden Sie die Rohre mit den zwei Lösung Anschlüssen in mikrofluidischen Gerät um die beiden Lösungen aus der Spritzenpumpen liefern. Legen Sie Röhren in die Auslassöffnung um die generierten Mikrosphären in das Becherglas zu übertragen.
- Legen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 0,4 - 0,7 mL/h. Adjust Druckluft Druck des Kompressors mit einem Regler (82-116 kPa). Legen Sie die Drehzahl (500 u/min) der Magnetrührer Bar in das Becherglas auf einer heißen Platte. Betrieben Sie die Spritzenpumpe und liefern Sie die komprimierte Luft in die Glasflasche mit dem ON/OFF Control ein elektromagnetisches Ventil13von einem externen Kompressor erzeugt.
- Die Bildung von Mikrosphären in der Strömung mit Schwerpunkt Geometrie und Verfestigung der generierten Mikrosphären in das Glasgefäß mit einem digitalen Mikroskop zu beobachten.
Hinweis: Die Größe und Geschwindigkeit der Mikrosphären hängen der Durchfluß von Lösungen und der Druck für die Mineralöl-Fluss (Tabelle 2).
3. Durchführung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären zählt
- Zur Quantifizierung der Hemocytometer nehmen Sie eine kleine Menge (ca. 100 μL) wässrige Lösung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären und Platz auf der Glas-Hemocytometer, und füllen Sie sanft die Mikrosphären Suspension gut von der Zählkammer.
Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Verwenden Sie ein Mikroskop und Hand Stückzähler Mikrosphären in einem Satz von 16 Quadrate zu zählen. Dann verschieben Sie die Hemocytometer zum nächsten Satz der Kammer und weitermachen Sie zählen, bis alle vier Sätze von 16 Ecken gezählt werden.
- Bestimmen Sie die Anzahl der durchschnittlichen Mikrosphären und berechnen Sie die Anzahl der Mikrosphären in der ursprünglichen Wulst-Suspension.
- Übertragen Sie 100 μL der Mikrosphären auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen des Überstands durch sanftes Zentrifugieren (400 X g) und pipettieren.
4. Durchführung von DNA-Hybridisierung auf der Oberfläche der Polyacrylamid-Oligomicrosphere
Hinweis: Eine identische DNA-Sonde mit einer 5'-NH2-Gruppe statt 5'-Acrytide-Modifikation wird in Lösung ich hinzugefügt und für Ap-haltigen Mikrosphären parallel getestet. DNA-Hybridisierung Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Die Cy3 beschriftet ergänzende Oligonukleotid Sonden (GAP) Lösung sollte in einem dunklen Raum platziert werden.
- Aufschwemmen Cy3-cAp mit 100 μl 1xTE-Puffer (TE-Puffer: 10 mM Tris und 1μM EDTA, pH 8,0) um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. Z. B. Aufschwemmen Sie 1 Pmol GAP in 100 mL TE-Puffer und Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch mit Aluminiumfolie abgedeckt.
Hinweis: Für Strang-Sequenzen, siehe Tabelle 3. - Fügen Sie 100 μM Cy3-cAp zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Ap copolymerisiert Mikrosphären.
- Tippen Sie auf das Rohr ein paar Mal zu mischen und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 h.
- Den Überstand verwerfen und verbleibende Puffer durch Pipettieren zu entfernen.
- Spülen Sie drei Mal mit 500 μl TE-Puffer.
- Aufzuwirbeln Sie Mikrosphären durch leichtes Klopfen Microcentrifuge Schlauch. Wiederholen Sie Schritt 4.4.
- Die Objektträger (75 x 50 mm) und die Abdeckung mit Alu-Folie vor Bildgebung Mikrosphären aufsetzen.
(5) asymmetrische PCR zur Verstärkung ssDNA
- Bereiten Sie eine asymmetrische PCR-Reagenz-Mischung zur Verstärkung SsDNA analysiert werden. Die Reagenzien in Tabelle 4 auf Eis auftauen. Halten Sie nicht das Enzym Taq Polymerase (50 U/µL) auf dem Eis, sondern eher speichern sie bei-20 ° C bis benötigt.
- Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.
- Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 4.
- Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten
6. Mikrosphären-PCR zur Verstärkung ssDNA
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll zur Verstärkung SsDNA in einer PCR-Reaktion-Röhre. Mikrosphären-PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die detaillierte Sequenzen verwendet, um SsDNA verstärken sind in Tabelle 5aufgeführt. In diesem Fall kann Ap auf der Oberfläche der Mikrosphären an zufälligen DNA Vorlagen ergänzend Tempern. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt für die Herstellung von komplementären DNA-Stränge (antisense DNA-Strang, Abbildung 3). Die DNA erweitert dient als Kopiervorlage für Mikrosphären-PCR Verstärkung.
- Bereiten Sie Mikrosphären-PCR-Reagenz Mixes. Die Reagenzien in Tabelle 6 auf Eis auftauen; Denken Sie jedoch nicht das Taq Polymerase Enzym auf Eis. Bewahren Sie es bei-20 ° C bis benötigt.
- Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.
- Erhalten Sie ca. ~ 25 Mikrosphären durch mikroskopische zählen.
Hinweis: Die Anzahl der Mikrosphären in einem Reaktionsgefäß werden mit einem Lichtmikroskop mit 40 X Vergrößerung berechnet. Etwa 25 ~ Mikrosphären werden Mikrosphären-PCR Verstärkung. Detailliertere Informationen sind in Schritt 3. - Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 6.
- Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten
- Folgende Verstärkung 8 μl 6 x Ladepuffer hinzufügen und laden 15 μl jeder Probe in 2 % Agarose-Gel. Führen Sie dann die Elektrophorese bei 100 V 35 min in 1 X TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris Acetat, 1 mM EDTA pH 8,2) Puffer.
(7) konfokalen Mikroskopie Erwerb
Hinweis: Die Ergebnisse der Mikrosphären-DNA-Sonde Hybridisierung werden unter einem confocal Mikroskop abgebildet. Bildanalyse erfolgt mittels ImageJ.
- Befestigen Sie hybridisierte Mikrosphären auf die Bühne des Mikroskops in einer Halterung.
- Wählen Sie den Laser (Helium/Neon Laser, 543 nm-Linie) und schalten Sie ihn ein in Lasersteuerung.
- Wählen Sie die Objektivlinse in Mikroskopkontrolle.
- Wählen Sie den gewünschten Filter für Cy3 und Kanal in Konfigurationskontrolle.
- Starten Sie das Experiment zu und beobachten Sie die Probe. Einstellungen für das konfokale Mikroskop sind in Tabelle 7zusammengefasst.
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Representative Results
Die vorgefertigten Polymeren Droplet-basierte mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei Schichten in PDMS (Abbildung 1a). Drei Arten von mikrofluidischen Channel-Netzwerke sind für die Erzeugung von Mikrosphären verwendet: (1) Flow-mit Schwerpunkt Geometrie wie in Abbildung 1 b, 2) eine serpentine Kanal für mixing-Lösung I und Lösung II und (3) eine Polymerisation Kanal für Mikrosphären gezeigt Erstarrung. Die Höhe aller Kanäle war 60 μm. Die Kanal-Länge für Misch- und Polymerisation waren 74,35 und 94,45 mm, beziehungsweise. Die Breite der Microchannel für zwei nicht mischbaren Flüssigkeit fließt und das für Mineralöl-Fluss waren 100 μm und 200 μm. Die Blende-Struktur verwendet für Mikrosphären Bildung wurde von 50 µm Länge und 25 μm Breite. Der Winkel der Diffusor Struktur war 37°. Ein Labor-basierte pneumatische Steuerung für kontinuierlichen Fluss des Mineralöls und zwei Spritzenpumpen für die Lösungsfluss (Abbildung 1 c) dienten zur Erzeugung von Mikrosphären in mikrofluidischen Plattform (Abbildung 1-d). Die Produktionsgeschwindigkeit von Mikrosphären wurde etwa 30 Mikrosphären pro Sekunde als die Durchflussmenge von Lösungen und Anpressdruck waren bei 0,6 mL/h und 108 kPa bzw. (Tabelle 2). Sein Durchmesser im Mikro-Kanal beträgt 78,7 ± 2,5 m. Die am Fluss Synthese von Mikrosphären kann erfolgreich mit mikrofluidischen Gerät manipuliert werden. Perlen Größen wurden nach Schwellung gemessen. Der mittlere Durchmesser der daraus resultierenden Mikrosphären wurde 150.4 ± 12,8 m. Die Größenunterschiede waren ca. 8,5 %. Die Mikrosphären unterziehen Schwellung im Wasser, was zu einem Anstieg von enormer Größe.
Die copolymerizable-Eigenschaft des Microsphere kann variiert werden. Wir eine 5'-Acrydite-DNA-Sonde in die Mikrosphären-Lösung integriert (Lösung ich, siehe Tabelle 1). Nach Co-Polymerisation, eine komplementäre DNA-Sonde ist beschriftet mit fluoreszierenden Farbstoff, Cy3, bei Raumtemperatur 1 h. Confocal Mikroskopie kann verwendet werden, um die Synthese von copolymerizable Oligomicrospheres sowie Funktions-Hybridisierung auf beweisen die Oberfläche der Mikrosphären. Fluoreszierende Bilder von den Mikrosphären sind in Abbildung 2dargestellt. Wenn Mikrosphären korrekt mit der 5'-Acrydite-DNA-Sonde funktionalisiert werden, sollten sie während des Experiments Hybridisierung Berichterstattung über fluoreszierende Aktivität auf der Oberfläche führen. Copolymerisation nicht richtig auftreten, würde das optische Mikrosphären Bild innere Kontamination innerhalb der Mikrosphären aufweisen. Wie in Abbildung 2dargestellt, gibt es keine Einmischung von zufälligen innere Orientierung. Dieses Ergebnis konnten wir eine 3-dimensionale (3D) Anordnung und Mikrosphären-PCR DNA-Sonde Präsentation durchführen. Es sei darauf hingewiesen, dass eine identische DNA probe mit einer 5'-NH2-Gruppe anstelle einer 5'-Acrytide-Änderung nicht bei auf-Flow Synthese von Mikrosphären8copolymerize.
Beim Arbeiten mit Mikrosphären ist Manipulation der 3-d-Oberfläche mit einer DNA-Oligo-Sonde eine viel schnellere Prozess14. Daher kann eine auf-Flow Mikrosphären Synthese Plattform ein Werkzeug für SsDNA Verstärkung und Reinigung, bieten, wie in Abbildung 3dargestellt. Der Gegenstrang DNA-Vorlage (-, ergänzende Vorlage) kann durch das Hinzufügen einer zufälligen DNA-Vorlage (+ Vorlage) verlängert werden. In diesem Fall die ursprünglich einpolymerisierten 5'-Ap bietet eine 3'-OH-Ende für DNA-Polymerisation nach Glühen in seinen ergänzenden Vorlage (76 nt). Mikrosphären-PCR kann in einem einzigen PCR Reaktionscup mit funktionalisierten Mikrosphären, eine zufällige DNA-Vorlage und ein Tag-Forward Primer durchgeführt werden. Um die daraus resultierenden SsDNA Amplifikate von zufälligen DNA Schablone zu unterscheiden (+ Vorlage, 76 nt), der forward Primer ist ein zusätzliches 24 Nukleotid-Tag. Wenn der forward Primer eine zusätzliche Tag-Sequenz nicht kennt, ist es sehr schwer, zwischen SsDNA Amplifikate und der ersten zufälligen DNA-Vorlage zu erkennen.
Eine asymmetrische PCR-Experiment wurde durchgeführt. Wir waren in der Lage, DsDNA Verunreinigungen zu beobachten, wie in Abbildung 4dargestellt. In den meisten Fällen ist es notwendig, SsDNA mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten und Exonuclease Verdauung zu isolieren. Allerdings macht die Mikrosphären-PCR effiziente Nutzung eines einzigen Primers (Tag-Forward Primer) SsDNA in wässrigen Phase ansammeln. Es wird erwartet, dass die Oberfläche der Mikrosphären DsDNA Verunreinigungen beimessen werden. Daher erhalten SsDNA Amplifikate durch Pipettieren ohne die Notwendigkeit einer Zentrifugation. Die daraus resultierende SsDNA zeigte sich im Vergleich zu den synthetischen Größe Marker (76 nt SsDNA und 100 nt SsDNA) durch Gel-Elektrophorese-Analyse.
Abbildung 1: die Plattform mikrofluidischen. (a) hergestellte mikrofluidischen Plattform, (b) vergrößerte Ansicht der Strömung mit Schwerpunkt Geometrie, (c) Versuchsaufbau und (d) aufgenommene Bilder zeigen kontinuierliche Erzeugung von Mikrosphären. 1: micro Kanalstruktur für Flow mit Schwerpunkt Geometrie, 2: für das Mischen von Lösungen, 3: für Mikrosphären Erstarrung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: fluoreszierende Auslesen der DNA-Hybridisierung auf der Oberfläche von Mikrosphären. 5'-Acrydite-modifizierte DNA-Sonden (Ap) waren in der Lage, die Hybridisierung mit ergänzenden Cy3 gekennzeichnet DNA-Sonden (GAP). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Darstellung der Mikrosphären-PCR-Protokoll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Vergleich zwischen herkömmlichen asymmetrischen PCR und Mikrosphären-PCR. M; SsDNA Marker (76mer und 100mer), Bahn 1; Asymmetrische PCR, Lane 2; Microbeads-PCR. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von früheren Arbeiten8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Reagenz | Volumen im Mix (μL) | Endkonzentration | |
| Lösung ich | 40 % Acrylamide:bis Lösung (19:1) | 25 | 10 % |
| 100 μM Acrydite Sonde (Ap, 5 "- Acrydite-(TTTTTTT, Linker Sequenz) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3") | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x TBE-Puffer (Tris-Base-EDTA) | 10 | 0,5 X | |
| Wasser | 5 | - | |
| Lösung II | 20 % Ammonium bleichen | 50 | 10 % |
| Lösung III | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0,40 % |
| Mineralöl | 1000 | - | |
Tabelle 1. Reagenz-Mix-Komponenten für auf-Flow Polyacrylamid Mikrosphären Synthese.
| Betriebszustand | Mikrosphären Produktionsgeschwindigkeit |
|
| Lösung Durchfluß | Öldruck | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ Sek.) |
| 0,4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0,6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tabelle 2. Zusammenfassung der Betriebsbedingungen und produzierten Mikrosphären.
| DNA-Sonde | Sequenzen |
| Cy3 beschriftet komplementären Oligonukleotids Sonde (GAP) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3 " |
| Tag (erste 24 nt)-Grundierung zu übermitteln | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3 " |
Tabelle 3. Sequenzinformation des DNA-Sonden.
| Reagenz | Volumen für 1 X Reaktion (μL) | Endkonzentration |
| Zufällige DNA Schablone | 1 | 1 ng/μl |
| Tag-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Rückwärts-primer | 1 | 0,02 ΜM |
| 10 x Taq Puffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex-Taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Wasser | 37,8 | - |
| Insgesamt | 50 | - |
Tabelle 4. Asymmetrische PCR-Reagenz mischen Komponenten in 20 L Reaktion.
| Vorlage | Sequenz | Länge (nt) |
| Zufällige DNA Schablone | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (zufällige Reihenfolge, 40 Mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3 " | 76 |
| Tag-Forward Primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3 " | 42 |
| Rückwärts-primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3 " | 18 |
Tabelle 5. Sequenzinformation für Mikrosphären-PCR.
| Reagenz | Volumen für 1 X Reaktion (μL) | Endkonzentration |
| AP-Mikrosphären | ~ 25 Mikrosphären | - |
| Zufällige DNA Schablone | 1 | 1 ng/μl |
| Tag-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| 10 x Taq Puffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex-Taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Wasser | 37,8 | - |
| Insgesamt | 50 | - |
Tabelle 6. Mikrosphären-PCR Reagenz mischen Komponenten in 50 L Reaktion.
| Scan-Modus | Flugzeug |
| Skalierung | X: 2,49 μm, Y: 2,49 μm |
| Stack-Größe | X: 1272.79 μm, Y: 1272.79 μm |
| Scan zoom | 0,7 |
| Ziel | EC Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 |
| Durchschnitt | 1 |
| Lochkamera | CH2: 104 Umm |
| Filter | CH3: LP 420 |
| Strahlteiler | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: Spiegel, DBS2: NFT 515, FW1: keiner |
| Wellenlänge | 543 nm 100,0 % |
Tabelle 7. Einstellungen für das konfokale Mikroskop.
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Discussion
Verunreinigungen der DsDNA sind ein wichtiges Thema in SsDNA Verstärkung. Es bleibt schwierig, DsDNA Verstärkung in herkömmlichen asymmetrischen PCR Verstärkung15zu minimieren. Obwohl technische Verbesserungen für die Erzeugung von SsDNA uns zur Steigerung der Effizienz der Probendurchsatz aktiviert haben, ist darüber hinaus SsDNA Isolation aufgrund seiner hohen Kosten und unvollständige Reinigung Erträge nach wie vor problematisch.
Asymmetrische PCR ist eine der anspruchsvollsten Methoden beim Arbeiten mit SsDNA verwendet. Diese Methode gilt ungleiche Mengen Grundierung (z.B. Verhältnis 20: 1) um große Mengen an SsDNA zu generieren. Allerdings ist es sehr schwierig, jede Verstärkung Reaktion um SsDNA Ertrag zu optimieren. So müssen die Nebenprodukte (DsDNA) aus dem resultierenden4beseitigt werden.
Um SsDNA ohne zusätzliche Trennung Schritte zu generieren, produzierten wir Polyacrylamid Mikrosphären um DNA-Sonden basierend auf der Acrydite Copolymerisation Methode verfügbar zu machen. Unsere DNA Befestigungsart wurde leicht von mit einem Tröpfchen-basierte Mikrofluidik-Plattform angepasst. Einpolymerisierten Oligomicrospheres mit Microscale Durchmesser wurden erfolgreich produziert. Infolgedessen wurde Mikrosphären-PCR zur SsDNA in einer einzigen Röhre Reaktion verstärken. Natürlich sind häufig zur Anpassung dieses Verfahren für andere PCR Experimente notwendige Anpassungen (z.B.Änderung des Verstärkung Zyklus, Glühen, Temperatur und Vorlage-Sequenzen) erforderlich. Zusammenfassend hat Mikrosphären-PCR hier Zugänglichmachung für Bioassay Entwicklung, DNA-Sequenzierung und DNA-Microarray Analyse detaillierte.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Studie stützt sich auf ein Projekt mit dem Titel "kooperatives Forschungsprogramm für Agrarwissenschaft und Technologieentwicklung (Projekt Nr. PJ0011642) "finanziert durch die ländliche Entwicklung Verwaltung, Republik Korea. Diese Forschung wurde auch zum Teil durch einen Zuschuss (NRF-2017R1A2B4012253) des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen, Republik Korea unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch einen Zuschuss (N0000717) des Bildungsprogramm für kreative und industrielle Konvergenz gefördert durch das Ministerium für Handel, Industrie und Energie, Republik Korea unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
