Summary
Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.
Abstract
Druppel gebaseerde microfluidics inschakelen de betrouwbare productie van homogene microbolletjes in het kanaal van de microfluidic, die gecontroleerde grootte en morfologie van de verkregen microsfeer. Een copolymerized met een acrydite-DNA-sonde microsfeer werd met succes vervaardigd. Verschillende methoden zoals asymmetrische PCR exonuclease spijsvertering en isolatie op daar beklede magnetische kralen kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van single-stranded DNA (ssDNA). Echter, deze methoden niet efficiënt gebruiken grote hoeveelheden van hoogst gezuiverde ssDNA. Hier beschrijven we een microsfeer-PCR protocol detailleren hoe ssDNA kunnen worden efficiënt versterkt en gescheiden van dsDNA gewoon door pipetteren van een PCR reactiebuis. De amplificatie van ssDNA kan worden toegepast als potentiële reagentia voor de microarray DNA en DNA-SELEX (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) processen.
Introduction
Single-stranded DNA (ssDNA) heeft uitgebreid beschouwd als een element van de moleculaire erkenning (MRE) als gevolg van zijn intrinsieke eigenschappen voor DNA-DNA hybridisatie1,2. De ontwikkeling van ssDNA synthetische systemen kan leiden tot biologische toepassingen zoals DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostiek en geïntegreerde moleculaire detectie op basis van aanvullende interacties4,5.
Tot op heden zijn micrometer-schaal polymeer deeltjes met succes aangetoond met behulp van microfluidic-apparaten. Verschillende technieken van de microfluidic hebben bewezen te krachtig voor het produceren van zeer homogene microsferen op continue stroom in de microchannel milieu6,7.
In de studie van Lee et al. 8, een druppel gebaseerde microfluidic platform voor de microfluidic synthese van copolymerizable oligo-microsfeer en ssDNA versterking werd gemeld. Het microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Polydimethylsiloxaan): een bovenste deel met een microfluidic channel-netwerk voor het genereren van de microsfeer en een bodem plat deel. Deze bestaan uit drie soorten PDMS fluidic kanalen: 1) een stroom focussering kanaal voor druppel-generatie, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van twee oplossingen, en 3) een sequentiële polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. Zodra twee onmengbare stromen in een PDMS fluidic enkellijns worden binnengebracht, kunnen de stromen worden gedwongen door de smalle opening structuur. De stroom gedrag zoals kanaal geometrie, debiet en viscositeit van invloed op de grootte en morfologie van de microsfeer. Daarom is de belangrijkste vloeibare stroom kan worden onderverdeeld in microscale monospheres9,10.
Hier vindt u een gedetailleerde microsfeer-PCR protocol voor de amplificatie van ssDNA. Ten eerste wordt een druppel gebaseerde microfluidic apparaat ontwerpproces beschreven. Dan, de manier waarop in welke polyacrylamide microbolletjes met willekeurige DNA sjabloon kan worden matiemaatschappij op een complementaire manier wordt uitgelegd. Tot slot wordt een microsfeer-PCR protocol voor het versterken van de ssDNA weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van een PDMS Microfluidic Platform
- Bereid 20 mL vloeibare PDMS prepolymeren door het mengen van de basis polymeer en katalysator in een volumeverhouding van 10:1. Giet 10 mL van de vloeistof PDMS op een schimmel SU-8 bereid op een silicium wafer voor het bovenste deel van het microfluidic netwerk. Voor het onderste gedeelte plat, giet u dezelfde hoeveelheid vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder de structuur van een schimmel.
Opmerking: Het microfluidic-netwerk is ontworpen in een CAD-programma en vervolgens omgezet in een photomask om het fabriceren van een model met behulp van de typische fotolithografie proces (Zie Aanvullende cijfers). Dit model bestaat uit de negatieve fotoresist SU-8 schimmel op de silicium wafer11. - Plaats twee silicium wafers bekleed met vloeibare PDMS prepolymeren op de hete plaat en uitharding bij 75 ° C gedurende 30 minuten.
- Handmatig naar de uitgeharde laag van het PDMS van de SU-8 mal afschilferen. Hiermee lijnt u een diameter van 1,5 mm ronde hole punching gereedschap op de poort van de olie van de gerepliceerde microfluidic netwerk voor interfacing micron-schaal stroom kanalen met de macro vloeistof monsters. Punch handmatig uit het via-gat.
- Herhaal dit proces drie keer voor de vorming van de twee oplossingen en de retourzijde ponsen.
- Hydrofiele oppervlaktebehandeling uitvoeren op zowel de bovenste en de onderste PDMS lagen met behulp van een hand-held corona treater12 gedurende enkele seconden per monster.
- Stapel twee plasma-behandelde PDMS lagen en warmte bij 90 ° C gedurende 30 minuten met behulp van een warmhoudplaat voor het PDMS-naar-PDMS hechting proces. De hydrofoor watervoorziening met behulp van de spuitpomp op drie inlaat poorten voor de structurele lijmen en lekken testen van het gefabriceerde apparaat.
2. productie van Polyacrylamide Oligo-microsferen
- Bereiden kraal-mengsel gedetailleerd in tabel 1.
- Vortex en kort centrifuge de standaard ssDNA acrydite label sonde (Ap, 100 μM) en acrylamide:bis (19:1) stamoplossing.
- Bereid oplossing ik door het mengen van 25 μL van 40% acrylamide bis oplossing, 10 μL van ssDNA (acrydite sonde), 10 μL van 5 x TBE buffer (900 mM boraat, 1.1 M Tris; 25 mM EDTA) en 5 μL van water. Bereid met 50 μl van 20% ammoniumnitraat persulfate-oplossing II.
- Twee opstellen spuiten individueel gevuld met oplossing ik en oplossing II, en mount ze op de pomp in te voeren oplossing stromen in het microfluidic platform. Bereiden van minerale olie gemengd met 0,4% TEMED voor oppervlakte stollen van de microsfeer.
Opmerking: TEMED is bekend als een vrije radicalen stabilisator. Vrije radicalen kunnen versnellen het tempo van de polymeer formatie met ammonium persulfate (APS) om te katalyseren acrylamide polymerisatie. - Vul een glazen fles met 4 mL van de minerale olie voor het genereren van een continue stroom.
- Invoegen van twee buizen naar twee poorten in de dop van de fles als een reservoir van de microfluidic: de pneumatische poort voor de toepassing van de samengeperste lucht in de fles van de luchtcompressor en de vloeistof haven voor de aardolievoorziening van de onder druk staande aan de micro channel-netwerk uit de fles. Verbinding buizen tussen de fles en de poort van de olie in het microfluidic-apparaat.
- De buizen verbinden met de oplossing van de twee havens in het microfluidic-apparaat om de twee oplossingen van de injectiespuit pompen. Invoegen buizen naar de retourzijde wilt overbrengen, moet de gegenereerde microsfeer af in het bekerglas.
- Stel het debiet van de spuitpomp op 0,4 - 0,7 mL/h. aanpassen samengeperste luchtdruk van de compressor met een regulator (82-116 kPa). Stel de draaisnelheid (500 rpm) van de magneetroerder bar in het bekerglas van het glas op een hete plaat. De spuitpomp bedienen en leveren de samengeperste lucht gegenereerd door een externe compressor in de glazen fles met behulp van de ON/OFF controle van een elektromagnetische klep13.
- Observeer de vorming van microbolletjes in de stroom-focusing geometrie en stollen van gegenereerde microbolletjes in het bekerglas van glas met een digitale Microscoop.
Opmerking: De snelheid van het formaat en de productie van de microsfeer hangt het debiet van oplossingen en de druk toegepast voor de minerale olie-stroom (tabel 2).
3. uitvoeren van Polyacrylamide Oligo-microsferen telt
- Voor hemocytometer de kwantificering, nemen een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μl) van waterige oplossing van polyacrylamide oligo-microsferen en plaats op de hemocytometer van het glas, en zachtjes Vul de opschorting van de microsfeer het goed van de tellen kamer.
Opmerking: Voor nadere bijzonderheden, zie http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Gebruik een microscoop en hand tally teller wilt tellen microbolletjes in één set van 16 vierkantjes. Vervolgens plaatst u de hemocytometer met de volgende reeks van de kamer en voort tellen totdat alle vier sets van 16 hoeken worden geteld.
- Bepalen van de gemiddelde microsfeer telling en bereken het aantal microbolletjes in de originele kraal suspensie.
- 100 μl van microsferen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder het supernatant via zachte centrifugeren (400 x g) en pipetteren.
4. het uitvoeren van DNA hybridisatie op het oppervlak van Polyacrylamide Oligomicrosphere
Opmerking: Een identiek DNA sonde met een 5'-NH2-groep in plaats van 5'-acrytide wijziging wordt toegevoegd in de oplossing die ik en getest voor Ap-bevattende microbolletjes in parallel. DNA hybridisatie resultaten worden weergegeven in Figuur 2. De oplossing van Cy3-geëtiketteerden complementaire oligonucleotide sondes (GLB) moet worden geplaatst in een donkere kamer.
- Resuspendeer Cy3-cAp met 100 μl van 1xTE buffer (TE buffer: 10 mM Tris en 1μM EDTA, pH 8,0) met het oog op een eindconcentratie van 100 μM. Bijvoorbeeld resuspendeer 1 pmol van GLB in 100 mL TE buffer en overdracht aan een microcentrifuge buis bedekt met aluminiumfolie.
Opmerking: Voor strand sequenties, Zie tabel 3. - 100 μM van Cy3-cAp aan een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met microsferen Ap-copolymerized toevoegen.
- Tik op de buis een paar keer om te mengen en Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
- Verwijder het supernatant en verwijder residuele buffer via pipetteren.
- Spoel driemaal met 500 μL van TE buffer.
- Resuspendeer microsferen door zachtjes te tikken op de microcentrifuge buis. Herhaal vervolgens stap 4.4.
- Plaats microsferen op het glasplaatje (75 x 50 mm) en bedek met de aluminiumfolie voorafgaand aan de beeldvorming.
5. asymmetrische PCR voor het versterken van de ssDNA
- Voorbereiden op een asymmetrische PCR reagens mix sturen ssDNA te analyseren. Ontdooi de reagentia in tabel 4 op het ijs. Houd niet het Taq polymerase enzym (50 U/µL) op het ijs, maar eerder opgeslagen bij-20 ° C totdat het nodig is.
- Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.
- Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 4.
- Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.
6. microsfeer-PCR voor het versterken van de ssDNA
Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor het versterken van de ssDNA in een PCR reactiebuis. Microsfeer-PCR reacties werden uitgevoerd in 50 μl van reactie volume. De gedetailleerde sequenties gebruikt om te vergroten van ssDNA zijn vermeld in tabel 5. In dit geval, kan Ap op het oppervlak van de microsferen ontharden aan willekeurige DNA sjablonen complementair. Dit is een zeer belangrijke stap voor de productie van complementaire DNA-strengen (antisense bundel van DNA, Figuur 3). Het DNA uitgebreid wordt gebruikt als een sjabloon voor microsfeer-PCR versterking.
- Bereiden microsfeer-PCR reagens mix. Ontdooi de reagentia in tabel 6 op het ijs; echter houd niet het enzym Taq polymerase op ijs. Bewaar het bij-20 ° C totdat het nodig is.
- Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.
- Verkrijgen door middel van microscopische tellen ongeveer ~ 25 microsferen.
Opmerking: Het aantal microbolletjes in één reactiebuis worden berekend met behulp van een lichte Microscoop met 40 X vergroting. Ongeveer 25 ~ microsferen worden gebruikt voor microsfeer-PCR versterking. Meer gedetailleerde informatie is in stap 3. - Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 6.
- Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.
- Volgende versterking, voeg 8 l 6 x laden buffer en laadt 15 μL van elk monster in 2% agarose gel. Voer de Elektroforese bij 100 V gedurende 35 min. in 1 x TAE (Tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.
7. confocale microscopie overname
Opmerking: De resultaten van de microsfeer-DNA sonde hybridisatie zijn beeld onder een confocal microscoop. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ.
- Corrigeer gehybridiseerde microsferen tot het stadium van de Microscoop in een houder.
- Selecteer de laser (laser Helium/Neon, 543 nm lijn) en zet hem aan in laser controle.
- Selecteer het objectief in Microscoop controle.
- Selecteer het gewenste filter voor Cy3 en kanaal in configuratiecontrole.
- Start van het experiment en observeren van het monster. Instellingen voor de confocal microscoop zijn samengevat in tabel 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het verzonnen polymere druppel gebaseerde microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Figuur 1a). Drie soorten microfluidic kanaal netwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen: 1) Flow-focusing geometrie zoals weergegeven in Figuur 1b, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van oplossing ik en oplossing II en 3) een polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. De hoogte van alle kanalen was 60 μm. De lengte van het kanaal voor mixen en polymerisatie waren 74.35 mm en 94.45 mm, respectievelijk. De breedte van de microchannel voor twee onmengbare vloeistof stroomt en de één voor minerale olie flow waren 100 μm en 200 μm, respectievelijk. De structuur van de opening gebruikt voor de vorming van de microsfeer was van 50 μm lengte en breedte van 25 μm. De hoek van de diffusor structuur was 37°. Een pneumatische lab-gebaseerd controlesysteem voor continue stroom van de minerale olie en twee spuit-pompen voor de stroom van de oplossing (Figuur 1 c) werden gebruikt voor het genereren van microbolletjes in het microfluidic platform (Figuur 1 d). De productiesnelheid van microsferen was ongeveer 30 microsferen per seconde wanneer het debiet van de oplossingen en de toegepaste druk waren bij 0,6 mL/h en 108 kPa, respectievelijk (tabel 2). De diameter in de micro kanaal is 78.7 ± 2.5 m. De op-flow synthese van microsferen kan met succes worden gemanipuleerd met behulp van het microfluidic-apparaat. Kraal maten werden gemeten na de zwelling. De gemiddelde diameter van de resulterende microsferen was 150.4 ± 12,8 m. De grootte variaties waren ongeveer 8,5%. De microsferen ondergaan zwelling in water, resulterend in een verhoging van enorme omvang.
De copolymerizable eigenschap van de microsfeer kan worden gevarieerd. We opgenomen een 5'-acrydite-DNA-sonde in de oplossing van de microsfeer (oplossing ik, Zie tabel 1). Na co polymerisatie, een complementaire DNA-sonde wordt gelabeld met de fluorescerende kleurstof, Cy3, bij kamertemperatuur voor 1 h. Confocal Microscopie kan worden gebruikt om te bewijzen de synthese van copolymerizable oligomicrospheres ook zo functioneel kruising op de oppervlak van microsferen. Fluorescerende beelden van de microsfeer zijn afgebeeld in Figuur 2. Als microbolletjes zijn correct matiemaatschappij met de 5'-acrydite-DNA-sonde, zij moeten leiden tot dekking van fluorescerende activiteit op het oppervlak tijdens het experiment van hybridisatie. Als copolymerization niet correct optreedt, zou de optische microsfeer afbeelding inwendige-besmetting binnen de microsferen vertonen. Zoals afgebeeld in Figuur 2, is er geen inmenging van willekeurige-interieur oriëntatie. Hierdoor konden we de DNA sonde presentatie uitvoeren in een 3-dimensionale (3-D) regeling en microsfeer-PCR. Opgemerkt moet worden dat een identiek DNA sonde met een 5'-NH2-groep in plaats van een 5'-acrytide-wijziging deed niet copolymerize tijdens aan-flow synthese van de microsfeer8.
Bij het werken met microsferen, is manipuleren van het 3D-oppervlak met een DNA oligo-sonde een veel snellere proces14. Daarom bieden een op-flow microsfeer synthese platform een hulpmiddel voor ssDNA versterking en zuivering, zoals beschreven in Figuur 3. De anti-zin DNA sjabloon (-, complementaire sjabloon) kan worden uitgebreid door de toevoeging van een willekeurig DNA-sjabloon (+, sjabloon). In dit geval de aanvankelijk copolymerized 5'-Ap voorziet in een 3'-OH einde DNA polymerisatie na gloeien aan haar complementaire sjabloon (76 nt). Microsfeer-PCR kan worden uitgevoerd in een enkele PCR microtube met matiemaatschappij microsferen, een willekeurig DNA-sjabloon en een Tag-forward-primer. Teneinde te onderscheiden van de resulterende ssDNA waarbij van willekeurige DNA-sjabloon (+ template, 76 nt), de voorwaartse primer heeft een aanvullende 24 nucleotide-tag. Als de voorwaartse primer niet over een reeks extra tag beschikt, is het zeer moeilijk te herkennen tussen ssDNA waarbij en de eerste sjabloon voor willekeurige DNA.
Een asymmetrische PCR-experiment werd uitgevoerd. Wij hebben kunnen observeren dsDNA contaminanten zoals weergegeven in Figuur 4. In de meeste gevallen is het noodzakelijk om te isoleren van de ssDNA met behulp van magnetische kralen daar beklede en exonuclease spijsvertering. Echter maakt microsfeer-PCR efficiënt gebruik van een enkele primer (Tag-forward primer) te accumuleren ssDNA in de waterige fase. Verwacht wordt dat dsDNA contaminanten aan het oppervlak van de microsferen hechten zal. Daarom, ssDNA waarbij verkregen kan worden door pipetteren zonder de noodzaak van centrifugeren. De resulterende ssDNA werd aangetoond door te vergelijken met de synthetische grootte markers (76 nt ssDNA en 100 nt ssDNA) door middel van gel elektroforese analyse.
Figuur 1: het platform microfluidic. (a) gefabriceerde microfluidic platform, (b) uitgebreide weergave van de stroom-focusing geometrie, (c) experimentele opstelling, en (d) veroverde afbeeldingen tonen continu generatie microsferen. 1: micro channel structuur voor stroom gericht geometrie, 2: voor het mengen van oplossingen, 3: voor microsfeer stollen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: TL uitlezing van DNA hybridisatie op het oppervlak van de microsferen. 5' Acrydite-gemodificeerde DNA-sondes (Ap) konden kwekers met complementaire Cy3 label DNA-sondes (GLB). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: illustratie van de microsfeer-PCR protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vergelijking tussen conventionele asymmetrische PCR en microsfeer-PCR. M; ssDNA markering (76mer en 100mer), Lane 1; Asymmetrische PCR, Lane 2; Microbeads-PCR. Overgenomen met toestemming van eerdere werk8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Volume in mix (μL) | Eindconcentratie | |
| Oplossing ik | 40% Acrylamide:bis-oplossing (19:1) | 25 | 10% |
| 100 μM Acrydite sonde (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, linker volgorde) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x TBE buffer (Tris-base-EDTA) | 10 | 0,5 X | |
| Water | 5 | - | |
| Oplossing II | 20% ammoniumnitraat persulfate | 50 | 10% |
| Oplossing III | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0,40% |
| Minerale olie | 1000 | - | |
Tabel 1. Reagens mix onderdelen voor op-flow polyacrylamide microsfeer synthese.
| Operationele toestand | Microsfeer Productiesnelheden |
|
| Oplossing debiet | Oliedruk | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ sec) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0.6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tabel 2. Samenvatting van de operationele omstandigheden en geproduceerde microsfeer.
| DNA sonde | Sequenties |
| Cy3 label complementaire oligonucleotide sonde (GLB) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Label (eerste 24 nt)-toekomen primer | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' |
Tabel 3. De opeenvolgingsinformatie van DNA-sondes.
| Reagens | Volume voor 1 x reactie (μL) | Eindconcentratie |
| Willekeurige DNA sjabloon | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-forward primer | 1 | 0.4 ΜM |
| Omgekeerde primer | 1 | 0,02 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM van dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Water | 37,8 | - |
| Totaal | 50 | - |
Tabel 4. Asymmetrische PCR reagens mengen van componenten in 20 L reactie.
| Sjabloon | Volgorde | Lengte (nt) |
| Willekeurige DNA sjabloon | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Random volgorde, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Tag-Forward primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Omgekeerde primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabel 5. Opeenvolgingsinformatie voor microsfeer-PCR.
| Reagens | Volume voor 1 x reactie (μL) | Eindconcentratie |
| AP-microsferen | ~ 25 microsferen | - |
| Willekeurige DNA sjabloon | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward primer | 1 | 0.4 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Water | 37,8 | - |
| Totaal | 50 | - |
Tabel 6. Reagens van de microsfeer-PCR mengen van componenten in 50 L reactie.
| Scanmodus | Vliegtuig |
| Schalen | X: 2,49 μm, Y: 2,49 μm |
| Stackgrootte | X: 1272.79 μm, Y: 1272.79 μm |
| Scannen van zoom | 0,7 |
| doelstelling | EG Plan-Neofluar 10 x / 0.3 M27 |
| Gemiddelde | 1 |
| Pinhole | CH2: 104 um |
| Filters | H3: LP 420 |
| Beam splitters | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: mirror, DBS2: NFT 515, FW1: geen |
| Golflengte | 543 nm 100,0% |
Tabel 7. Instellingen voor de confocal microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verontreinigingen van dsDNA zijn een belangrijk thema in de versterking van de ssDNA. Blijft het moeilijk om te minimaliseren dsDNA versterking in conventionele asymmetrische PCR versterking15. Bovendien, hoewel technische verbeteringen voor het genereren van ssDNA we het verhogen van de efficiëntie van monsters worden verwerkt kunnen, is ssDNA isolatie nog steeds problematisch vanwege de hoge kosten en opbrengsten van de onvolledige zuivering.
Asymmetrische PCR is een van de meest uitdagende methoden die worden gebruikt bij het werken met ssDNA. Deze methode geldt ongelijke bedragen primer (b.v., verhouding 20: 1) om het genereren van grote hoeveelheden ssDNA. Het is echter zeer moeilijk voor het optimaliseren van elke reactie versterking om de opbrengst van de ssDNA. Aldus, moeten de bijproducten (dsDNA) worden geëlimineerd uit de resultants4.
Oog op het genereren van ssDNA zonder extra scheiding stappen, geproduceerd we polyacrylamide microsferen om DNA-sondes op basis van de methode acrydite copolymerization bloot te stellen. Onze DNA bijlage methode werd eenvoudig aangepast met behulp van een droplet gebaseerde microfluidic platform. Copolymerized oligomicrospheres met microscale diameters werden met succes geproduceerd. Bijgevolg werd microsfeer-PCR gebruikt voor het versterken van de ssDNA in de reactie van een single-buis. Natuurlijk, aan te passen deze procedure voor andere PCR-experimenten, zijn vaak noodzakelijke aanpassingen (bv, veranderen de versterking-cyclus, onthardende temperatuur en sjabloon sequenties) vereist. Kortom, heeft microsfeer-PCR zijn gedetailleerde hier beschikbaar voor ontwikkeling van de bioassay, DNA-sequentiebepaling en DNA microarray analyse te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Deze studie wordt ondersteund door een project getiteld "coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw Science & Technology Development (Project nr. PJ0011642) "gefinancierd door de landelijke ontwikkeling administratie, Republiek Korea. Dit onderzoek werd ook deels gesteund door een subsidie (NRF-2017R1A2B4012253) van de fundamentele wetenschap Research Program door de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & toekomst Planning, Republiek Korea. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie (N0000717) van het onderwijs-programma voor creatieve en industriële convergentie gefinancierd door het ministerie van handel, industrie en energie, Zuid-Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
