Summary
Dette værk indeholder en metode til fremstilling af droplet-baserede mikrofluid platforme og anvendelsen af polyacrylamid mikrokugler for microsphere-PCR-amplifikation. Microsphere-PCR-metoden gør det muligt at opnå enkeltstrenget DNA amplikoner uden adskillelse dobbelt-strenget DNA.
Abstract
Droplet-baserede mikrofluidik aktiverer pålidelig produktion af homogene mikrokugler i den mikrofluid kanal, giver kontrolleret størrelse og morfologi af den opnåede microsphere. En copolymeriseret med et acrydite-DNA-sonder microsphere blev fabrikeret. Forskellige metoder som asymmetriske PCR, exonuclease fordøjelse og isolation på streptavidin-belagt magnetiske perler kan bruges til at syntetisere enkeltstrenget DNA (ssDNA). Disse metoder kan ikke effektivt bruger store mængder af højt oprenset ssDNA. Her, beskriver vi en microsphere-PCR-protokol beskriver hvordan ssDNA kan være effektivt forstærkes og adskilt fra dsDNA simpelthen af pipettering fra en PCR reaktion tube. Forstærkning af ssDNA kan anvendes som potentielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk udvikling af ligander af eksponentielle berigelse) processer.
Introduction
Enkeltstrenget DNA (ssDNA) er blevet grundigt overvejet som en molekylær anerkendelse element (MRE) på grund af dets iboende egenskaber for DNA-DNA hybridisering1,2. Udviklingen af ssDNA syntetisk systemer kan føre til biologiske applikationer såsom DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostik og integreret Molekylær sensing baseret på supplerende interaktioner4,5.
Til dato, har mikrometer skala polymer partikler med held påvist ved hjælp af mikrofluid enheder. Flere mikrofluid teknikker har vist sig for at være effektive til at producere meget homogen mikrokugler på kontinuerlig flow i microchannel miljø6,7.
I studiet af Lee et al. 8, en droplet-baserede mikrofluid platform for mikrofluid syntese af copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forstærkning blev rapporteret. Mikrofluid platform består af to PDMS (Polydimethylsiloxan) lag: en øvre del med en mikrofluid kanal netværk til at generere microsphere og en bunden flad del. Disse består af tre slags PDMS fluidic kanaler: 1) en flow med fokus kanal for slipværktøj generation, 2) en serpentine kanal til at blande to løsninger og 3) en sekventiel polymerisering kanal for microsphere størkning. Når to ikke-blandbare strømme er indført i en enkelt PDMS fluidic kanal, kan strømme tvinges gennem den smalle åbning struktur. Strømmen adfærd som kanal geometri, strømningshastighed og viskositet påvirke størrelse og morfologi af microsphere. Derfor, den største flydende strøm kan opdeles i mikroskala monospheres9,10.
Her er en detaljeret microsphere-PCR-protokol fastsatte forstærkning af ssDNA. Først, en droplet-baserede mikrofluid enhed designproces er beskrevet. Derefter, den måde, i hvilke polyacrylamid mikrokugler kan være functionalized med tilfældig DNA skabelon i en supplerende måde er forklaret. Endelig er en microsphere-PCR-protokol for uddybning af ssDNA vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation af en PDMS mikrofluid Platform
- Forberede 20 mL flydende PDMS prepolymer ved at blande base polymer og katalysator i en volumen-forholdet på 10:1. Hæld 10 mL væske PDMS på en rede SU-8 mug på en silicium wafer for den øvre del af mikrofluid netværk. Den nederste flade del, hæld flydende PDMS samme rumfang på silicium wafer uden en skimmel struktur.
Bemærk: Mikrofluid netværk er designet i et CAD-program og derefter konverteres til et photomask for at fabrikere en master ved hjælp af typiske fotolitografi proces (Se Supplerende tal). Denne master består af negative photoresist SU-8 mug på silicium wafer11. - Placer to silicium wafers belagt med flydende PDMS prepolymer på varmeplade og helbredelse ved 75 ° C i 30 min.
- Manuelt skrælle den hærdede PDMS lag fra formen SU-8. Justere en 1,5 mm diameter runde hul stansning værktøj til oliehavn på replikerede mikrofluid netværk for linkforbundne micron-skala flow kanaler med makro flydende prøver. Punch ud gennem hullet manuelt.
- Gentag dette stansning proces tre gange for dannelsen af de to løsninger og udgangsporten.
- Udføre hydrofile overfladebehandling på øverste og nederste PDMS lag ved hjælp af en håndholdt corona treater12 i flere sekunder pr. prøve.
- Stable to plasma-behandlede PDMS lag og varme ved 90 ° C i 30 minutter ved hjælp af en varmeplade til PDMS til PDMS limning proces. Levere trykkamre vandet ved hjælp af sprøjten pumpe i tre indgangsporte til strukturelle limning og lækage test af de fabrikerede enhed.
2. produktion af polyacrylamid Oligo-mikrokugler
- Forbered perle-blanding udførligt beskrevet i tabel 1.
- Vortex og kortvarigt centrifuge standard ssDNA acrydite mærket sonde (Ap, 100 μM) og acrylamide:bis (19:1) stamopløsning.
- Forberede løsning jeg ved at blande 25 μL af 40% acrylamid bis løsning, 10 μL ssDNA (acrydite sonde), 10 μL af 5 x TBE buffer (1,1 M Tris, 900 mM Borat, 25 mM EDTA) og 5 μl vand. Forberede løsning II med 50 μL af 20% ammonium persulfat.
- Forbered to sprøjter individuelt fyldt med løsning løsning II og jeg, og montere dem på pumpen for at indføre løsning strømme ind i mikrofluid platformen. Forberede mineralsk olie blandet med 0,4% TEMED for overfladen solidificering af microsphere.
Bemærk: TEMED er kendt som en fri radikal stabilisator. Frie radikaler kan accelerere hastigheden af polymer dannelse med ammonium persulfat (APS) for at katalysere acrylamid polymerisering. - Fyld en glasflaske med 4 mL af mineralsk olie til at generere en kontinuerlig flow.
- Indsæt to rør til to havne i fælles landbrugspolitik i glasflaske som en mikrofluid reservoir: pneumatisk havnen for at anvende komprimeret luft ind i glasflaske fra luftkompressor og havnens væske for at levere trykkamre olie til micro channel-netværk fra glasflaske. Tilslut rør mellem glasflaske og oliehavn i mikrofluid enhed.
- Forbinde rørene til to løsning havne i mikrofluid enheden for at levere de to løsninger fra sprøjten pumper. Indsæt rør til udgangsporten for at overføre den genererede microsphere i bægerglasset.
- Indstil strømningshastigheden af sprøjten pumpe til 0,4 - 0,7 mL/h. Juster trykluft presset af kompressoren ved hjælp af en regulator (82-116 kPa). Sæt baren magnetomrører rotationshastighed (500 rpm) i glas bægerglas på en varm tallerken. Betjene sprøjten pumpe og levere trykluft genereret af en ekstern kompressor i glasflaske ved hjælp af ON/OFF kontrol af en elektromagnetisk ventil13.
- Observere dannelsen af mikrokugler i strøm-fokusere geometri og solidificering af genererede mikrokugler i glas bægerglas med en digital mikroskop.
Bemærk: Microsphere størrelse og produktion hastighed afhænger flowhastighed af løsninger og pres for mineralsk olie flow (tabel 2).
3. udføre polyacrylamid Oligo-mikrokugler tæller
- For hemocytometer kvantificering, tage en lille mængde (ca. 100 μl) vandig opløsning af polyacrylamid oligo-mikrokugler og sted på glas hemocytometer og forsigtigt fylde microsphere suspension sig godt tælle kammerets.
Bemærk: Yderligere oplysninger, se http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Bruge et mikroskop og hånd tally counter tælle mikrokugler i ét sæt af 16 pladser. Derefter, flytte hemocytometer til det næste sæt af kammeret og fortsætte med at tælle indtil alle fire sæt af 16 hjørner tælles.
- Bestemme den gennemsnitlige microsphere tælle og beregne antallet af mikrokugler i den oprindelige perle suspension.
- 100 μL af mikrokugler overføres til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Fjern supernatanten gennem skånsom centrifugering (400 x g) og pipettering.
4. udfører DNA hybridisering på overfladen af polyacrylamid Oligomicrosphere
Bemærk: En identisk DNA sonde med en 5'-NH2-gruppen i stedet for 5'-acrytide ændring er tilføjet i løsning jeg og testet for Ap-holdige mikrokugler parallelt. DNA hybridisering resultater er vist i figur 2. Cy3-mærket supplerende oligonukleotid sonder (cAp) løsning bør være placeret i et mørkt rum.
- Resuspend Cy3-cAp med 100 μL 1xTE buffer (TE buffer: 10 mM Tris og 1μM EDTA, pH 8,0) for at opnå en endelig koncentration på 100 μM. For eksempel resuspend 1 pmol af cAp i 100 mL TE buffer og overførsel til et microcentrifuge rør dækket med aluminiumsfolie.
Bemærk: For strand sekvenser, se tabel 3. - Tilføjes en sterile 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende Ap-copolymeriseret mikrokugler 100 μM af Cy3-cAp.
- Tryk røret et par gange at blandes og inkuberes ved stuetemperatur i mørke for 1 h.
- Supernatanten fjernes og ophæve resterende buffer gennem pipettering.
- Skylles tre gange med 500 μL TE buffer.
- Resuspend mikrokugler ved forsigtigt at trykke microcentrifuge rør. Gentag derefter trin 4.4.
- Placer mikrokugler på glas dias (75 mm x 50 mm) og tildækkes med aluminiumsfolie før billeddannelse.
5. asymmetriske PCR for uddybning af ssDNA
- Forberede en asymmetrisk PCR reagens mix forstærke ssDNA der skal analyseres. Tø reagenser i tabel 4 på is. Opbevar ikke Taq-polymerase enzym (50 U/µL) på is, men hellere gemme det på-20 ° C indtil det skal bruges.
- Forsigtigt vortex alle reagenser og derefter centrifugeres kort rør på 10.000 x g i 10 s.
- Kombinere alle reagenser som beskrevet i tabel 4.
- Placer prøver i en thermocycler og starte den asymmetriske PCR på følgende betingelser: 25 cykler (95 ° C til 30 s, 52 ° C til 30 s og 72 ° C i 30 s), 85 ° C i 5 min, holde ved 4 ° C.
6. Microsphere-PCR for uddybning af ssDNA
Bemærk: Dette afsnit beskriver protokollen for uddybning af ssDNA i en PCR reaktion tube. Microsphere-PCR-reaktionerne blev udført i 50 μL af reaktion volumen. De detaljerede sekvenser brugt til at forstærke ssDNA er angivet i tabel 5. I dette tilfælde kan Ap på overfladen af mikrokugler anneal til tilfældige DNA skabeloner på en måde, der supplerer hinanden. Dette er et meget vigtigt skridt for at udarbejde supplerende DNA-strenge (antisense. DNA strand, figur 3). DNA udvidet bruges som skabelon for microsphere-PCR-amplifikation.
- Forberede microsphere-PCR reagens mix. Tø reagenser i tabel 6 på isen; dog hold ikke Taq-polymerase enzym på is. Det opbevares ved-20 ° C indtil det skal bruges.
- Forsigtigt vortex alle reagenser og derefter centrifugeres kort rør på 10.000 x g i 10 s.
- Opnå ca ~ 25 mikrokugler gennem mikroskopiske optælling.
Bemærk: Antallet af mikrokugler i én reaktion tube beregnes ved hjælp af et lysmikroskop med 40 X forstørrelse. Omkring ~ 25 mikrokugler bruges til microsphere-PCR-amplifikation. Nærmere oplysninger kan i trin 3. - Kombinere alle reagenser som beskrevet i tabel 6.
- Placer prøver i en thermocycler og starte den asymmetriske PCR på følgende betingelser: 25 cykler (95 ° C til 30 s, 52 ° C til 30 s og 72 ° C i 30 s), 85 ° C i 5 min, holde ved 4 ° C.
- Følgende forstærkning, tilføje 8 μL af 6 x loading bufferen og indlæse 15 μl af hver prøve på 2%-agarosegel. Derefter udføre elektroforese på 100 V i 35 min. i 1 x TAE (Tris-acetat-EDTA, 40 mM Tris acetat, 1 mM EDTA, pH 8,2) buffer.
7. konfokalmikroskopi erhvervelse
Bemærk: Resultaterne af microsphere-DNA sonde hybridisering er afbildet under en Konfokal mikroskop. Billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ.
- Fix hybridiserede mikrokugler til fase af mikroskop i en holder.
- Vælg laser (Helium/Neon laser, 543 nm linje) og slå det i laser kontrol.
- Vælg mål linse i mikroskop kontrol.
- Vælg det ønskede filter for Cy3 og kanal konfiguration kontrol.
- Begynder eksperimentet og observere prøven. Indstillinger for Konfokal mikroskop er opsummeret i tabel 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opdigtet polymere droplet-baserede mikrofluid platform består af to PDMS lag (figur 1a). Tre slags mikrofluid kanal netværk bruges til at generere mikrokugler: 1) strøm-fokusere geometri som vist i figur 1b, 2) en serpentine kanal for blandingsopløsning og løsning II og 3) polymerisering kanal for microsphere størkning. Højden af alle kanaler var 60 μm. Kanal længde til at blande og polymerisation var 74.35 og 94.45 mm, henholdsvis. Bredder af microchannel til to ikke-blandbare væske strømme og en for mineralsk olie flow var 100 μm og 200 μm, henholdsvis. Blænde struktur bruges til microsphere dannelse var 50 μm længde og 25 μm bredde. Vinklen på diffuser struktur var 37°. En lab-baserede pneumatisk kontrolsystem for kontinuerlig flow af mineralsk olie og to sprøjte-pumper til løsning flow (figur 1 c) blev brugt til at generere mikrokugler i mikrofluid platform (fig. 1 d). Mikrokugler produktion hastighed var omkring 30 mikrokugler pr. sekund hvor strømningshastigheden af løsninger og anvendte tryk var på 0,6 mL/h og 108 kPa, henholdsvis (tabel 2). Dens diameter i mikro-kanal er 78.7 ± 2,5 m. På flow syntesen af mikrokugler kan manipuleres med held, ved hjælp af mikrofluid enhed. Perle størrelser blev målt efter hævelse. Den gennemsnitlige diameter af den resulterende mikrokugler var 150.4 ± 12,8 m. Størrelse variationer var omkring 8,5%. Mikrokugler gennemgå hævelse i vand, hvilket resulterer i en enorm størrelse stigning.
Egenskaben copolymerizable for microsphere kan varieres. Vi indarbejdet en 5'-acrydite-DNA-sonder i microsphere opklaring (løsning I, se tabel 1). Efter Co polymerisering, en supplerende DNA-sonder er mærket med fluorescerende farvestof, Cy3, ved stuetemperatur for 1 h. Confocal mikroskopi kan bruges til at bevise syntesen af copolymerizable oligomicrospheres såvel som funktionelle hybridisering på den overfladen af mikrokugler. Fluorescerende billeder af microsphere er vist i figur 2. Hvis mikrokugler er korrekt functionalized med 5'-acrydite-DNA-sonder, bør de føre dækning af fluorescerende aktivitet på overfladen under hybridisering eksperimentet. Hvis copolymerization ikke forekomme korrekt, ville optisk microsphere billedet udstille intern forurening inde mikrokugler. Som vist i figur 2, er der ingen indblanding af tilfældige-interiør orientering. Dette resultat tilladt os at udføre DNA sonde præsentation i en 3-dimensional (3-D) arrangement og microsphere-PCR. Det skal bemærkes, at en identisk DNA sonde med en 5'-NH2-gruppe i stedet for en 5'-acrytide ændring ikke copolymerize under-flow syntese af microsphere8.
Når du arbejder med mikrokugler, er manipulere de 3D-overflade med en DNA oligo-probe en meget hurtigere proces14. Derfor, en på flow microsphere syntese platform kan være et redskab for ssDNA forstærkning og rensning, som skitseret i figur 3. Skabelonen anti-sense DNA (-, komplementær skabelon) kan udvides ved at tilføje en tilfældig DNA skabelon (+,-skabelon). I dette tilfælde i første omgang copolymerized 5'-Ap giver en 3'-OH ende for DNA polymerisering efter udglødning til dets komplementære skabelon (76 nt). Microsphere-PCR kan udføres i en enkelt PCR microtube ved hjælp af functionalized mikrokugler, en tilfældig DNA-skabelon og et Tag-forward primer. For at skelne den resulterende ssDNA amplikoner fra tilfældige DNA skabelon (+ skabelon, 76 nt), den forreste primer har en yderligere 24 nukleotid tag. Hvis den fremskudte primer ikke har en ekstra tag sekvens, er det meget svært at genkende mellem ssDNA amplikoner og den oprindelige tilfældige DNA skabelon.
En asymmetrisk PCR-eksperimentet blev udført. Vi har kunnet observere dsDNA forureninger, som vist i figur 4. I de fleste tilfælde er det nødvendigt at isolere ssDNA ved hjælp af streptavidin-belagt magnetiske perler og exonuclease fordøjelsen. Dog gør microsphere-PCR effektiv brug af en enkelt primer (Tag-forward primer) at akkumulere ssDNA i vandfasen. Det forventes, at dsDNA forurenende stoffer vil knytte til overfladen af mikrokugler. Derfor kan ssDNA amplikoner fås gennem pipettering uden behov for centrifugering. Den resulterende ssDNA blev demonstreret ved at sammenligne det med syntetisk størrelse markører (76 nt ssDNA og 100 nt ssDNA) gennem gel elektroforese analyse.
Figur 1: mikrofluid platform. (a) fabrikerede mikrofluid platform, (b) forstørret visning af strøm-fokusere geometri, (c) eksperimentelle set-up, og (d) fanget billeder viser løbende generation af mikrokugler. 1: micro channel struktur for flow med fokus geometri, 2: for blandingsopløsninger, 3: for microsphere størkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fluorescerende udlæsning af DNA hybridisering på overfladen af mikrokugler. 5' Acrydite-modificerede DNA-sonder (Ap) var i stand til at hybridizing med supplerende Cy3 mærket DNA-sonder (cAp). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Illustration af microsphere-PCR-protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4: sammenligning mellem konventionelle asymmetriske PCR og microsphere-PCR. M; ssDNA markør (76mer og 100mer), Lane 1; Asymmetriske PCR, Lane 2; Microbeads-PCR. Genoptrykt med tilladelse fra tidligere arbejdet8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Volumen i mix (μL) | Endelig koncentration | |
| Løsning jeg | 40% Acrylamide:bis løsning (19:1) | 25 | 10% |
| 100 μM Acrydite sonde (Ap, 5' - Acrydite-(MATERIALIST, linker sekvens) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x TBE-buffer (Tris-base-EDTA) | 10 | 0,5 X | |
| Vand | 5 | - | |
| Opløsning II | 20% ammonium persulfat | 50 | 10% |
| Løsning III | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0,40% |
| Mineralsk olie | 1000 | - | |
Tabel 1. Reagens mix komponenter til på flow polyacrylamid microsphere syntese.
| Operationel tilstand | Microsphere produktionen hastighed |
|
| Løsning flowhastighed | Olietryk | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ sek) |
| 0,4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0,6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tabel 2. Resumé af driftsforhold og producerede microsphere.
| DNA-sonder | Sekvenser |
| Cy3 mærket supplerende oligonukleotid sonde (cAp) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Tag (første 24 nt)-videresende primer | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' |
Tabel 3. Sekvens oplysninger af DNA-sonder.
| Reagens | Mængde for 1 x reaktion (μL) | Endelig koncentration |
| Tilfældige DNA skabelon | 1 | 1 ng/μl |
| Tag-forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Omvendt primer | 1 | 0,02 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM for dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vand | 37,8 | - |
| I alt | 50 | - |
Tabel 4. Asymmetriske PCR reagens blandes komponenter i 20 L reaktion.
| Skabelon | Sekvens | Længde (nt) |
| Tilfældige DNA skabelon | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (tilfældig rækkefølge, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Tag-Forward primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Omvendt primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabel 5. Sekvens information til Microsphere-PCR.
| Reagens | Mængde for 1 x reaktion (μL) | Endelig koncentration |
| AP-mikrokugler | ~ 25 mikrokugler | - |
| Tilfældige DNA skabelon | 1 | 1 ng/μl |
| Tag-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vand | 37,8 | - |
| I alt | 50 | - |
Tabel 6. Microsphere-PCR reagens blandes komponenter i 50 L reaktion.
| Skan tilstand | Fly |
| Skalering | X: 2,49 μm, Y: 2,49 μm |
| Stakstørrelse | X: 1272.79 μm, Y: 1272.79 μm |
| Skan zoom | 0,7 |
| mål | EF Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 |
| Gennemsnit | 1 |
| Pinhole | Ch2: 104 um |
| Filtre | Ch3: LP 420 |
| Beam splittere | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: spejl, DBS2: NFT 515, FW1: ingen |
| Bølgelængde | 543 nm 100.0% |
Tabel 7. Indstillinger for Konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kontaminanter i dsDNA er et stort problem i ssDNA forstærkning. Det er fortsat vanskeligt at minimere dsDNA forstærkning i konventionelle asymmetriske PCR forstærkning15. Desuden, selv om tekniske forbedringer for at generere ssDNA har gjort det muligt for os at øge effektiviteten af prøven overførselshastighed, er ssDNA isolation stadig problematisk på grund af sin høje omkostninger og ufuldstændige rensning udbytter.
Asymmetriske PCR er en af de mest udfordrende, der bruges når man arbejder med ssDNA. Denne metode gælder ulige beløb af primer (fx, 20: 1 ratio) for at generere store mængder af ssDNA. Det er imidlertid meget vanskeligt at optimere hver forstærkning reaktion for at give ssDNA. Således skal biprodukter (dsDNA) fjernes fra resultants4.
Generere ssDNA uden yderligere adskillelse trin, producerede vi polyacrylamid mikrokugler at eksponere DNA-sonder baseret på metoden acrydite copolymerization. Vores DNA fastgørelse metode var nemt tilpasses ved hjælp af en droplet-baserede mikrofluid platform. Copolymeriseret oligomicrospheres at have individuel diametre blev produceret. Derfor blev microsphere-PCR brugt til at forstærke ssDNA i en enkelt-tube reaktion. Selvfølgelig, for at tilpasse denne fremgangsmåde for andre PCR eksperimenter, er almindeligt nødvendige justeringer (f.eks.ændre forstærkning cyklus, udglødning temperatur og skabelon sekvenser) påkrævet. Afslutningsvis har microsphere-PCR været detaljeret her, gøres tilgængelige for bioassay udvikling, DNA-sekventering og DNA microarray analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Denne undersøgelse er understøttet af et projekt med titlen "kooperativ forskningsprogram for landbrug Science & Technology Development (projekt nr. PJ0011642) "finansieret af landdistrikternes udvikling Administration, Republikken Korea. Denne forskning blev også delvist støttet af en bevilling (NRF-2017R1A2B4012253) af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtid planlægning, Republikken Korea. Denne forskning blev også støttet af tilskud (N0000717) af programmet uddannelse for kreative og industrielle konvergens finansieret af Ministeriet for handel, industri og energi, Republikken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
