Summary
Detta arbete ger en metod för tillverkning av droplet-baserade mikroflödessystem plattformar och tillämpningen av polyakrylamid mikrosfärer för microsphere-PCR amplifiering. Microsphere-PCR-metoden gör det möjligt att erhålla enkelsträngat DNA amplikoner utan att separera dubbelsträngat DNA.
Abstract
Droplet-baserade mikrofluidik möjliggör tillförlitlig produktion av homogena mikrosfärer i ultrakalla kanalen, som ger kontrollerad storlek och morfologi av den erhållna microsphere. Ett microsphere copolymerized med en acrydite-DNA sond var framgångsrikt fabricerade. Olika metoder såsom asymmetrisk PCR, exonuclease matsmältning och isolering på streptividin-belagda magnetiska pärlor kan användas att syntetisera enkelsträngat DNA (ssDNA). Men kan inte dessa metoder effektivt använda stora mängder högrenade ssDNA. Här beskriver vi ett microsphere-PCR-protokoll som beskriver hur ssDNA kan effektivt förstärks och separerade från dsDNA genom pipettering från en PCR-reaktion tube. Förstärkning av ssDNA kan tillämpas som potentiella reagens för DNA microarray och DNA-SELEX (systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning) processer.
Introduction
Enkelsträngat DNA (ssDNA) och det har ansetts som en molekylär igenkänning element (MRE) i stor utsträckning på grund av dess inneboende egenskaper för DNA-DNA hybridisering1,2. Utvecklingen av ssDNA syntetiska system kan leda till biologiska applikationer såsom DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostik och integrerad molekylär avkänning baserat på kompletterande interaktioner4,5.
Hittills har har mikrometer-skala polymer partiklar framgångsrikt visat använder mikroflödessystem enheter. Flera mikroflödessystem tekniker har visat sig vara kraftfull för att producera mycket homogen mikrosfärer på kontinuerligt flöde i microchannel miljö6,7.
I studien av Lee et al. 8, en droplet-baserade mikroflödessystem plattform för mikroflödessystem syntesen av copolymerizable oligo-microsphere och ssDNA förstärkning rapporterades. Mikroflödessystem plattformen består av två PDMS (Polydimetylsiloxan) lager: en övre del med en mikroflödessystem channel-nätverk för att generera microsphere och en botten platta delen. Dessa består av tre typer av PDMS fluidic kanaler: 1) ett flöde med fokus kanal för droplet generation, 2) en serpentin kanal för att blanda två lösningar och 3) en sekventiell polymerisation kanal för microsphere stel. När två icke blandbara flöden införs i en enda PDMS fluidic kanal, kan flöden tvingas genom smala öppning strukturen. Flöde beteenden såsom kanal geometri, flöde och viskositet påverka storlek och morfologi av microsphere. Den största flytande strömmen kan därför delas in i hur provtagningsutrustningen skall monospheres9,10.
Här ges en detaljerad microsphere-PCR-protokoll för förstärkning av ssDNA. Först beskrivs en droplet-baserade mikroflödessystem enhet designprocess. Sedan, på sätt i vilken polyakrylamid mikrosfärer kan vara functionalized med slumpmässiga DNA mall på ett kompletterande sätt förklaras. Slutligen visas ett microsphere-PCR-protokoll för förstärkande ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av en PDMS mikroflödessystem plattform
- Förbered 20 mL flytande PDMS prepolymer genom att blanda bas polymer och katalysator i volymförhållandet 10:1. Häll 10 mL av vätskan PDMS på en förberedd SU-8 mögel på en silicon wafer för den övre delen av mikrofabricerade nätverket. För platta nedtill, Häll flytande PDMS samma volym på kisel rånet utan en mögel struktur.
Obs: Mikroflödessystem nätverket är designat i ett CAD-program och sedan omvandlas till en photomasken för att fabricera en mästare med typiska photolithography process (se Kompletterande siffror). Denna master består av negativa fotoresist SU-8 mögel på kisel wafer11. - Placera två kiselskivor belagd med flytande PDMS prepolymer på värmeplatta och härdningstid vid 75 ° C i 30 min.
- Manuellt lossna det härdade PDMS lagret från SU-8 mögel. Justera en 1,5 mm diameter runda hål stansning verktyg till olja porten i replikerade mikroflödessystem nätverket för gränsyta micron-skala flöde kanaler med makro flytande prover. Stansa ut hålmontering manuellt.
- Upprepa detta stansning process tre gånger för bildandet av de två lösningarna och utlopp hamnen.
- Utföra hydrofil ytbehandling på både övre och nedre PDMS lager med en handhållen corona dander12 i flera sekunder per prov.
- Stapla två plasma-behandlade PDMS lager och värme vid 90 ° C i 30 minuter med en värmeplatta för PDMS-till-PDMS limning processen. Leverera den trycksatt vatten med sprutpumpen in tre insugningskanalerna för strukturell limning och läckage test av påhittade enheten.
2. produktion av polyakrylamid Oligo-mikrosfärer
- Förbereda pärla-blandning beskrivs i tabell 1.
- Vortex och kort centrifug den standard ssDNA acrydite märkt sonden (Ap, 100 μM) och acrylamide:bis (19:1) stamlösning.
- Förbereda lösning jag genom att blanda 25 μL av 40% akrylamid bis lösning, 10 μL av ssDNA (acrydite probe), 10 μL av 5 x TBE buffert (1,1 M Tris, 900 mM Borat, 25 mM EDTA) och 5 μL av vatten. Bered II med 50 μl 20% ammonium persulfatoxidation.
- Förbered två sprutor individuellt fylld med lösning jag och lösning II, och montera dem på pumpen för att införa lösningen flöden i ultrakalla plattformen. Förbereda mineralolja blandas med 0,4% TEMED för surface solidifiering av microsphere.
Obs: TEMED är välkänd som en fri radikal stabilisator. Fria radikaler kan påskynda graden av polymer formation med ammonium persulfatoxidation (APS) för att katalysera akrylamid polymerisation. - Fyll en glasflaska med 4 mL mineralolja att generera ett kontinuerligt flöde.
- Infoga två rör till två hamnar i hatten för glasflaska som en mikroflödessystem reservoar: pneumatiska hamnen för att tillämpa den komprimerade luften i glasflaska från luftkompressorn och flytande hamn för att leverera trycksatt olja till nätverkets micro channel från glasflaska. Anslut rören mellan glasflaska och olja hamnen i ultrakalla enheten.
- Anslut rören till två lösning hamnarna i ultrakalla enheten för att förse de två lösningarna från sprutan pumparna. Sätt rör till outlet-porten för att överföra den genererade microsphere i bägaren.
- Ställa in flödet klassar av sprutpumpen 0,4 - 0,7 mL/h. Justera komprimerad luft trycket av kompressorn använder en regulator (82-116 kPa). Ange fältet magnetomrörarens rotationshastighet (500 rpm) i glasbägaren på en värmeplatta. Driva sprutpumpen och leverera den tryckluft som genereras av en extern kompressor i glasflaska med ON/OFF kontroll av en elektromagnetisk ventil13.
- Observera bildandet av mikrosfärer i flöde-fokus geometrin och solidifiering av genererade mikrosfärer i glasbägaren med ett digitalt mikroskop.
Observera: Microsphere storlek och hastighet beror på flödet av lösningar och trycket för mineralolja flödet (tabell 2).
3. utför polyakrylamid Oligo-mikrosfärer räknas
- För hemocytometer kvantifiering, ta en liten mängd (ca 100 μl) vattenlösning av polyakrylamid oligo-mikrosfärer och plats på glas hemocytometer, och försiktigt fylla microsphere suspensionen upp väl av räknande kammaren.
Anmärkning: För ytterligare information, se http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Använda ett mikroskop och hand tally counter för att räkna mikrosfärer i en uppsättning 16 rutor. Sedan flytta hemocytometer till nästa uppsättning av kammaren och fortsätta räkna tills alla fyra uppsättningar av 16 hörn räknas.
- Bestäm antalet genomsnittliga microsphere och beräkna antalet mikrosfärer i ursprungliga pärla avstängning.
- Överför 100 μL av mikrosfärer till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Ta bort supernatanten genom skonsam centrifugering (400 x g) och pipettering.
4. utför DNA hybridisering på ytan av polyakrylamid Oligomicrosphere
Obs: Ett identiskt DNA sond med en 5'-NH2-gruppen i stället för 5'-acrytide modifiering läggs till lösning jag och testade för Ap-innehållande mikrosfärer parallellt. DNA hybridisering resultaten visas i figur 2. Cy3-märkt kompletterande oligonukleotiden sonder (GJP) lösningen bör placeras i ett mörkt rum.
- Återsuspendera Cy3-locket med 100 μL av 1xTE buffert (TE buffert: 10 mM Tris och 1μM EDTA, pH 8,0) för att uppnå en slutlig koncentration på 100 μM. Till exempel Återsuspendera 1 pmol av cAp i 100 mL TE buffert och överföring till en mikrocentrifug rör täckt med aluminiumfolie.
Obs: För strand sekvenser, se tabell 3. - Lägga till 100 μM av Cy3-cAp i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör som innehåller Ap-copolymerized mikrosfärer.
- Tryck röret några gånger att blanda och odla i rumstemperatur i mörkret för 1 h.
- Avlägsna supernatanten och ta bort kvarvarande buffert genom pipettering.
- Skölj tre gånger med 500 μL av TE buffert.
- Återsuspendera mikrosfärer genom att försiktigt knacka mikrocentrifug röret. Upprepa sedan steg 4,4.
- Placera mikrosfärer på glasskiva (75 x 50 mm) och täck med aluminiumfolie innan imaging.
5. asymmetrisk PCR för förstärkande ssDNA
- Förbereda en asymmetrisk PCR reagens mix för förstärkande ssDNA ska analyseras. Tina reagenserna i tabell 4 på is. Förvara inte enzymet Taq polymeras (50 U/µL) på isen, men snarare förvara den vid-20 ° C tills den behövs.
- Försiktigt vortex alla reagenser och sedan kort Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 s.
- Kombinera alla reagenser som beskrivs i tabell 4.
- Placera prover i en termocykler och starta asymmetrisk PCR under följande förutsättningar: 25 cykler (95 ° C i 30 s, 52 ° C för 30 s och 72 ° C under 30 s), 85 ° C i 5 min, håll vid 4 ° C.
6. Microsphere-PCR för förstärkande ssDNA
Obs: Det här avsnittet beskrivs i protokollet för förstärkande ssDNA i en PCR-reaktion tub. Microsphere-PCR reaktioner utfördes i 50 μl reaktionsvolym. De detaljerade sekvenser som används för att förstärka ssDNA listas i tabell 5. I det här fallet kan Ap på ytan av mikrosfärer glödga till slumpmässiga DNA mallar på ett kompletterande sätt. Detta är ett mycket viktigt steg för att producera kompletterande DNA-strängar (antisense DNA-strängen, figur 3). DNA extended används som mall för microsphere-PCR-amplifiering.
- Förbereda microsphere-PCR reagens mix. Tina reagenserna i tabell 6 på is; dock håll inte enzymet Taq polymeras på is. Förvara den vid-20 ° C tills den behövs.
- Försiktigt vortex alla reagenser och sedan kort Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 s.
- Erhålla cirka ~ 25 mikrosfärer genom mikroskopiska räknar.
Anmärkning: Antalet mikrosfärer i en reaktionsröret beräknas med ett ljusmikroskop med 40 X förstoring. Ca ~ 25 mikrosfärer används för microsphere-PCR-amplifiering. Mer detaljerad information finns i steg 3. - Kombinera alla reagenser som beskrivs i tabell 6.
- Placera prover i en termocykler och starta asymmetrisk PCR under följande förutsättningar: 25 cykler (95 ° C i 30 s, 52 ° C för 30 s och 72 ° C under 30 s), 85 ° C i 5 min, håll vid 4 ° C.
- Följande amplifiering, tillsätt 8 μl av 6 x laddar buffert och läsa in 15 μL av varje prov i 2% agarosgel. Därefter utför elektrofores vid 100 V i 35 min i 1 x TAE (Tris-acetat-EDTA, 40 mM Tris acetat, 1 mM EDTA, pH 8,2) buffert.
7. konfokalmikroskopi förvärv
Obs: Resultaten av microsphere-DNA sonden hybridisering är avbildade i confocal Mikroskop. Bildanalys utförs med ImageJ.
- Fixa hybridiserade mikrosfärer på scenen av Mikroskop i en hållare.
- Välj laser (Helium/Neon laser, 543 nm linje) och slå på den i laser kontroll.
- Välj objektivet i Mikroskop kontroll.
- Välj önskat filter för Cy3 och kanal konfiguration kontroll.
- Starta experimentet och observera provet. Inställningar för mikroskopet confocal sammanfattas i tabell 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabricerade polymera droplet-baserade mikroflödessystem plattformen består av två PDMS lager (figur 1a). Tre sorters mikroflödessystem kanal nätverk används för att generera mikrosfärer: 1) flöde-fokus geometri som visas i figur 1boch 2) en serpentin kanal för att blanda lösningen jag och lösning II (3) en polymerisation kanal för microsphere solidifiering. Höjden på alla kanaler var 60 μm. Kanal längd för blandning och polymerisation var 74.35 mm och 94.45 mm, respektive. Bredden av microchannel för två icke blandbara flytande flöden och en för mineralolja flöde var 100 μm och 200 μm, respektive. Orifice struktur används för microsphere bildandet var 50 μm längd och 25 μm bredd. Vinkeln på diffusor strukturen var 37°. Ett lab-baserad pneumatiska styrsystem för kontinuerligt flöde av mineralolja och två spruta-pumpar för lösning flödet (figur 1 c) användes för att generera mikrosfärer i ultrakalla plattformen (figur 1 d). Produktionshastigheten av mikrosfärer var ca 30 mikrosfärer per sekund när flödet klassar av lösningar och utövat påtryckningar var vid 0,6 mL/h och 108 kPa, respektive (tabell 2). Dess diameter i micro channel är 78,7 ± 2,5 m. På-flow syntesen av mikrosfärer kan manipuleras framgångsrikt använder mikroflödessystem enheten. Pärla storlekar mättes efter svullnad. Den genomsnittliga diametern av den resulterande mikrosfärer var 150,4 ± 12,8 m. Storlek variationerna var ca 8,5%. Mikrosfärerna genomgå svullnad i vatten, vilket resulterar i en enorm storlek ökar.
Egenskapen copolymerizable för microsphere kan varieras. Vi införlivas microsphere lösningen en 5'-acrydite-DNA sond (lösning, se tabell 1). Efter samtidig polymerisation, en kompletterande DNA sond är märkta med fluorescerande färg, Cy3, i rumstemperatur i 1 h. Confocal microscopy kan användas för att bevisa syntesen av copolymerizable oligomicrospheres samt så funktionell hybridisering på den ytan av mikrosfärer. Fluorescerande bilder av microsphere visas i figur 2. Om mikrosfärer är korrekt functionalized med 5'-acrydite-DNA sond, bör de leda täckning av fluorescerande aktivitet på ytan under hybridisering experimentet. Om copolymerization inte inträffade korrekt, skulle den optiska microsphere bilden uppvisar intern-kontamination inuti mikrosfärerna. Som visas i figur 2, finns det ingen inblandning av random-interior orientering. Detta resultat gjorde att vi kunde genomföra DNA sonden presentationen i en 3-dimensionell (3D) arrangemang och microsphere-PCR. Det bör noteras att ett identiskt DNA sond med en 5'-NH2-gruppen i stället för en ändring av 5'-acrytide inte copolymerize under den flöde syntes av microsphere8.
När du arbetar med mikrosfärer, är manipulera 3D-ytan med en DNA oligo-probe en mycket snabbare process14. Därför, en på-flow microsphere syntes plattform kan ge ett verktyg för ssDNA amplifiering och rening, som beskrivs i figur 3. Anti känsla DNA mallen (-, kompletterande mall) kan utökas genom att lägga till en slumpmässig DNA mall (+, mall). I detta fall initialt copolymerized 5'-Ap erbjuder en 3'-OH slutet för DNA polymerisation efter glödgning till dess kompletterande mall (76 nt). Microsphere-PCR kan utföras på en enda PCR mikrorör med functionalized mikrosfärer, en slumpmässig DNA-mall och en tagg-forward primer. För att särskilja den resulterande ssDNA amplikoner från slumpmässiga DNA mall (+ mall, 76 nt), framåt primern har en ytterligare 24 nukleotid-tagg. Om framåt primern inte har en ytterligare tagg sekvens, är det mycket svårt att känna igen mellan ssDNA amplikoner och den inledande slumpmässiga DNA-mallen.
En asymmetrisk PCR utfördes. Vi kunde konstatera dsDNA föroreningar som visas i figur 4. I de flesta fall är det nödvändigt att isolera ssDNA använder streptividin-belagda magnetiska pärlor och exonuclease matsmältning. Microsphere-PCR gör dock effektiv användning av en enda primer (Tag-forward primer) ansamlas ssDNA i vattenfasen. Det förväntas att dsDNA föroreningar kommer att fästa på ytan av mikrosfärer. Därför kan ssDNA amplikoner erhållas genom pipettering utan behov av centrifugering. Den resulterande ssDNA demonstrerades genom att jämföra den till syntetiska storlek markörer (76 nt ssDNA och 100 nt ssDNA) genom gelelektrofores analys.
Figur 1: mikroflödessystem plattformen. (a) fabricerade mikroflödessystem plattform, (b) Utvidgad vy av flow-fokus geometri, (c) experimentella set-up, och (d) tagna bilder visar kontinuerlig generering av mikrosfärer. 1: micro channel struktur för flöde fokus geometri, 2: för blandning lösningar, 3: för microsphere stel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fluorescerande avläsning av DNA hybridisering på ytan av mikrosfärer. 5'-Acrydite-modifierat DNA sonder (Ap) var kapabla att korsa med kompletterande Cy3 märkt DNA sonder (GJP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Illustration av protokollet microsphere-PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse mellan konventionell asymmetrisk PCR och microsphere-PCR. M; ssDNA markör (76mer och 100mer), Lane 1; Asymmetrisk PCR, Lane 2; Mikrokulor-PCR. Omtryckt med tillåtelse från tidigare arbete8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym i mix (μL) | Slutlig koncentration | |
| Lösning jag | 40% Acrylamide:bis lösning (19:1) | 25 | 10% |
| 100 μM Acrydite sond (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, länkare sekvens) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x TBE-buffert (Tris-base-EDTA) | 10 | 0,5 X | |
| Vatten | 5 | - | |
| Lösning II | 20% ammonium persulfatoxidation | 50 | 10% |
| Lösning III | TEMED (N,N,N′, ′N-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0,40% |
| Mineralolja | 1000 | - | |
Tabell 1. Reagens mix komponenter för på-flow polyakrylamid microsphere syntes.
| Operativa villkor | Microsphere produktionshastighet |
|
| Lösning flöde | Oljetryck | |
| (mL/h) | (kPa) | (per sekund) |
| 0,4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0,6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tabell 2. Sammanfattning av driftförhållanden och producerade microsphere.
| DNA sond | Sekvenser |
| Cy3 märkt kompletterande oligonukleotiden sonden (GJP) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Tag (första 24 nt)-vidarebefordra primer | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' |
Tabell 3. Information om aktivitetssekvens av DNA sonder.
| Reagens | Volym 1 x reaktion (μL) | Slutlig koncentration |
| Slumpmässiga DNA mall | 1 | 1 ng/μl |
| Tagg-forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Reverse primer | 1 | 0,02 ΜM |
| 10 x Taq buffert | 5 | 1 X |
| 10 mM av dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vatten | 37,8 | - |
| Totalt | 50 | - |
Tabell 4. Asymmetrisk PCR reagens blanda komponenter i 20 L reaktion.
| Mall | Sekvens | Längd (nt) |
| Slumpmässiga DNA mall | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (slumpmässig sekvens, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Tagg-Forward primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Reverse primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabell 5. Information om aktivitetssekvens för Microsphere-PCR.
| Reagens | Volym 1 x reaktion (μL) | Slutlig koncentration |
| AP-mikrosfärer | ~ 25 mikrosfärer | - |
| Slumpmässiga DNA mall | 1 | 1 ng/μl |
| Tagg-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| 10 x Taq buffert | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vatten | 37,8 | - |
| Totalt | 50 | - |
Tabell 6. Microsphere-PCR reagens blanda komponenter i 50 L reaktion.
| Skanningsläge | Plan |
| Skalning | X: 2.49 μm, Y: 2,49 μm |
| Stackstorlek | X: 1272.79 μm, Y: 1272.79 μm |
| Skanna zoom | 0,7 |
| mål | EG Plan-Neofluar 10 x / 0.3 M27 |
| Genomsnitt | 1 |
| Pinhole | CH2: 104 um |
| Filter | CH3: LP 420 |
| Beam splitters | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: spegel, DBS2: NFT 515, FW1: ingen |
| Våglängd | 543 nm 100,0% |
Tabell 7. Inställningar för mikroskopet confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föroreningar av dsDNA är en huvudfråga i ssDNA förstärkning. Det är fortfarande svårt att minimera dsDNA amplifiering i konventionella asymmetrisk PCR-amplifiering15. Dessutom, även om tekniska förbättringar för att generera ssDNA möjliggjort för oss att öka effektiviteten i provkapaciteten, är ssDNA isolering fortfarande problematiskt på grund av dess höga kostnader och ofullständig rening avkastning.
Asymmetrisk PCR är en av de mest utmanande metoder som används när du arbetar med ssDNA. Denna metod gäller ojämlika mängder primer (t.ex., förhållandet 20: 1) för att generera stora mängder ssDNA. Det är dock mycket svårt att optimera varje förstärkning reaktion för att ge ssDNA. Biprodukter (dsDNA) måste således elimineras från Resultanterna4.
För att generera ssDNA utan ytterligare separation steg, producerat vi polyakrylamid mikrosfärer för att exponera DNA sonder utifrån metoden acrydite copolymerization. Vår metod för fastsättning av DNA anpassades enkelt med hjälp av en droplet-baserade mikroflödessystem plattform. Copolymerized oligomicrospheres att ha hur provtagningsutrustningen skall diametrar producerades framgångsrikt. Följaktligen, microsphere-PCR användes för att förstärka ssDNA i en singel-tube reaktion. Naturligtvis, för att anpassa detta förfarande för andra PCR-experiment, krävs vanligen nödvändiga justeringar (t.ex., ändra förstärkning cykeln, glödgning temperatur och mall sekvenser). Sammanfattningsvis har microsphere-PCR varit detaljerad här, vilket gör den tillgänglig för bioassay utveckling och DNA-sekvensering DNA microarray-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöds av ett projekt med titeln ”kooperativa forskningsprogram för jordbruk Science & teknikutveckling (projekt nr. PJ0011642) ”finansieras av landsbygdens utveckling Administration, Sydkorea. Denna forskning stöds också delvis av bidrag (NRF-2017R1A2B4012253) av den grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella Research Foundation (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering, Sydkorea. Denna forskning stöddes också av bidrag (N0000717) av programmet utbildning för Creative och industriella konvergens finansieras av ministeriet för handel, industri och energi, Sydkorea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
