Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.
Abstract
Der jüngste Anstieg virusähnliche Partikel (untersuchten) in biomedizinischen und Materialforschung kann einfache Biosynthese, diskrete Größe, genetische Programmierbarkeit und biologische Abbaubarkeit zugeschrieben werden. Während sie biokonjugaten Reaktionen für das Hinzufügen von synthetischen Liganden auf ihrer Oberfläche sehr zugänglich sind, ist das Angebot in biokonjugaten Methoden auf diese wässrigen geboren Capsids relativ begrenzt. Um die Ausrichtung der funktionalen Biomaterialien Forschung zu erleichtern, müssen nicht traditionele biokonjugaten Reaktionen berücksichtigt werden. Die Reaktion in diesem Protokoll beschriebenen verwendet Dibromomaleimides, neue Funktionen in dem Lösungsmittel vorstellen exponierten Disulfid-Bindungen der ein VLP Bakteriophagen Qβ zugrunde. Darüber hinaus ist das Endprodukt Leuchtstofflampen, die hat den zusätzlichen Vorteil eine verfolgbaren in-vitro- Sonde mit einem handelsüblichen Filtersatz zu erzeugen.
Introduction
Mit viralen Capsids nanogrösse entstanden als ein spannendes Gebiet, die darauf abzielt, die Ausweitung der Anwendungen in der biomedizinischen Forschung1,2,3. Rekombinant ausgedrückt virusähnliche Partikel (untersuchten) strukturell Viren abgeleitet sind, aber es fehlt das original virale Erbgut so dass sie nicht-infektiösen proteinhaltige Nanopartikel. Da die Oberflächen-Features genetisch programmiert sind und jede Kapsid sich identisch zu den davor und dahinter drückt, ist es möglich, die Lage und Anzahl der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren mit atomistischen Präzision kennen. In vielen Fällen besitzen die äußeren und inneren Oberflächen viele Arten von Lösungsmittel ausgesetzt Aminosäurereste, die praktisch durch biokonjugaten Reaktionen - Reaktionen funktionalisiert werden können, die bilden kovalente Bindungen zwischen ein Biomolekül und ein synthetisches Molekül-4,-5.
Biokonjugaten Reaktionen helfen Biomoleküle von Interesse vielfältigere Funktionen auf relativ einfache Weise haben. Moleküle von Interesse, wie Medikamente6, fluoreszierende Tags7 und Polymere8,9 können Pre synthetisiert und charakterisiert, bevor sie auf der Oberfläche des untersuchten zugeordnet sind. Eine besonders häufige VLP in biomedizinischen und Biomaterialien Forschung wurde der VLP basiert auf Bakteriophagen Qβ, die als rekombinant ausgedrückt, ein 28 nm ikosaedrischen Kapsid virale10. Die häufigsten Lokalisationen der Reaktion auf Qβ sind Lysines bei weitem, obwohl wir vor kurzem die erfolgreiche Konjugation11 Dibromomaleimide Verbindungen zu den reduzierten Disulfides kommuniziert haben, die die Poren des Qβ über eine Haddleton-Baker-Reaktion säumen. Die Reaktion verläuft mit gutem Ertrag und ebenso wichtig ist, ohne die thermische Stabilität der Partikel zu verlieren. Zur gleichen Zeit erzeugt diese Reaktion Konjugation-induzierte Fluoreszenz, die verwendet werden, um die Aufnahme dieser Partikel in Zellen zu verfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir die Konjugation von Polyethylenglykol (PEG) auf die Oberfläche des Qβ durch die Haddleton-Baker-Reaktion, die Ergebnisse in einem hellen gelben Fluorophor. Diese Partikel können dann verfolgt werden, wie sie von den Zellen aufgenommen werden. Das Protokoll hier hilft Forschern neue fluoreszierende pegylierten Qβ, proteinhaltige Nanopartikel Grundlage zu generieren, obwohl seine Prinzipien auf einer der vielen anderen untersuchten mit Lösungsmittel ausgesetzt Disulfides anwendbar sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung
- Machen Sie Lysogeny Brühe (LB) Agar und Gießen Sie Platten12.
-
BL21(DE3) mit einem pET28 Plasmid enthält die Proteinsequenz WtQβ Mantel zu verwandeln.
- E. Coli BL21(DE3) kompetente Zellen im Eisbad Auftauen. Platz 50 μL der Zellen in einem Microcentrifuge Schlauch.
- Fügen Sie 2 μL des Plasmids in eine Röhre und sanft flick das Rohr. Inkubieren Sie dann für 30 min auf Eis.
- Hitzeschock Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei genau 42 ° C. Legen Sie das Rohr zurück in das Eisbad unmittelbar nach der Hitze schockierend, und 5 min inkubieren.
- Fügen Sie 950 μl LB-Medium, die keines Antibiotikum enthält.
- Schütteln Sie die Kultur bei 200 u/min für 60 min bei 37 ° C.
- Platte 100 μL der Kultur auf LB-Agar-Platten (mit Kanamycin) und die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wählen Sie weiße Kolonien bei Bedarf.
-
Machen Sie Super optimale Brühe (SOB) Medien.
- Autoklaven 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben auf einem superdry Zyklus.
- In eine aseptische Umgebung abwiegen und fügen 20,0 g Tryptone, 5,0 g Hefe-Extrakt, 2,469 g wasserfreies Magnesiumsulfat, 0,584 g Natriumchlorid und 0,186 g Kaliumchlorid zu jedem Kolben.
- Bringen Sie die Lautstärke auf 1 L mit Reinstwasser in jeder Flasche und Autoklaven auf dem flüssigen Zyklus.
- Sobald die SOB-Medien nach dem Autoklavieren zuerst auf Zimmertemperatur kommen, jeder Liter Medien 1 mL Kanamycin (100 mg/mL) hinzu und Lagerung bei 4 ° C.
-
0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) zu machen.
- Machen Sie 1 M Kalium monobasic Lösung durch 68,045 g Kalium in 500 mL Reinstwasser monobasic auflösen.
- Machen Sie 1 M Kalium Diabas-Lösung durch 87,09 g Kalium in 500 mL Reinstwasser Diabas-auflösen.
- Eine 1 L Flasche 38,5 mL Kalium monobasic Lösung und 61,5 mL Kalium Diabas-hinzufügen.
- PH bis 7.00 Uhr bei Bedarf anpassen, und bringen auf ein Volumen von 1 L.
-
Machen Sie 5 – 40 % Saccharose Steigungen in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
- Erarbeiten Sie in 50 mL Zentrifuge Röhren Lösungen mit 5 – 40 % (in Schritten von 5 % Steigerung) Saccharose in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) aufgelöst.
- Zahlen Sie 3,3 mL 5 % Saccharoselösung am unteren Rand ein 38 mL Rundboden Polycarbonat Rohr mit einer langen Nadel Spritze ein, und wiederholen Sie dies für fünf andere Röhren.
- Hinterlegen Sie 3,3 mL 10 % Saccharose-Lösung an der Unterseite des Schlauches sorgfältig zu, und entfernen Sie vorsichtig die Nadel, die Steigung nicht zu stören. Wiederholen Sie für die anderen fünf Röhren.
- Weiterhin einzahlen 3,3 mL Schichten von Saccharose-Lösungen, Steigerung von 15 % bis 40 % in jedem Röhrchen vorsichtig zu sein, die Steigung nicht zu stören.
- Wenn Sie fertig sind, die Spitzen der Gradienten mit Folie abdecken und lagern bei-80 ° C.
(2) Ausdruck der Qβ
- Wischen Sie Bank Fläche mit Bleichmittel/Ethanol 1:1.
- Machen Sie zwei 3 mL Starterkulturen in eine aseptische Umgebung, indem einzelne Kolonien von E. Coli BL21(DE3) in 3 mL SOB Medien in eine aseptische Umgebung.
- Über Nacht auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % Relative Luftfeuchtigkeit (rH) wachsen.
-
Impfen Sie Starterkultur in SOB Medien:
- Der Shaker beide 3 mL Starterkulturen ausziehen und in eine aseptische Umgebung jeder Starter-Kultur in einer der beiden Gießen 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben mit 1 L frische SOB Medien in jedem.
- Legen Sie die beimpften Medien auf einen Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH.
- Wachsen Sie die Bakterien auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH bis OD600 0,9 – 1,0 erreicht.
- Fügen Sie 1 mL 1 M Isopropyl β-D-1 Thiogalactopyranoside (IPTG) mit einer Pipette P1000 Proteinexpression induzieren.
- Lassen Sie die Medien auf den Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH-Raum über Nacht.
- Entfernen Sie Medien aus der Shaker am folgenden Morgen und Zentrifuge mit 1000 mL-Flaschen bei 20.621 × g für 1 h bei 4 ° C um die Zellen zu ernten.
-
Verwerfen Sie den überstand und sammeln Sie die Zelle Pellet.
- Gießen Sie den überstand in eine Flasche mit ca. 5 mL Bleichen, um Bakterien abzutöten. Das ist Verschwendung.
- Einem Spatel zu kratzen die Zelle Pellet aus der Zentrifuge Flaschenboden und das Pellet in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
3. Reinigung des Qβ
- Aufschwemmen der Zelle Pellet mit ~ 20 – 30 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
- Stellen Sie sicher die Wiederfreisetzung hat keine Klumpen, und lösen Sie die Zellen mit einem Microfluidizer Prozessor laut Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie die Zellen mindestens zweimal, um den Ertrag der Partikel zu erhöhen.
- Zentrifugieren der lysate in 250 mL Zentrifuge Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.
- Entsorgen Sie das Pellet und Messen Sie das Volumen der Überstand in mL. Multiplizieren Sie diesen Wert durch 0.265 und der Überstand fügen Sie diesen Betrag von g Ammoniumsulfat hinzu.
- Rühren Sie bei 4 ° C für mindestens 1 h auf einem Teller rühren bei 200 u/min das Protein ausgefällt.
- Zentrifugieren Sie in 250 mL Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und erneut das Pellet mit etwa 10 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
- Gleiche Volumina von 1:1 Chloroform/n-Butanol am rohen Probe und fügen Sie Mischung durch Vortexen für ein paar Sekunden hinzu.
- Für 30 Minuten bei 4 ° c in 38 mL Röhrchen mit 20.621 × g zentrifugieren
- Die obere wässrige Schicht mit einer Pasteurpipette zu erholen. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das Gel wie Schicht zu nehmen, der zwischen die wässrige und organische Schicht gebildet hat.
- Tauen Sie sechs 5 – 40 % vorgefertigte Saccharose Steigungen und laden Sie ca. 2 mL des Extrakts auf jede.
- Ultrazentrifugen 99.582 x g für 16 h bei 4 ° C mit kostenlosen Verlangsamung.
- Licht emittierende Dioden (LED) Licht unter jedes Rohr und ein blaues Band sollte sichtbar. Diese Partikel mit einer langen Nadel Spritze zu erholen.
- Ultrapellet die Partikel bei 370.541 x g 2,5 h bei 4 ° C.
- Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der transparenten Pellets gereinigten Partikel mit 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,00).
(4) Quantifizierung und Bestätigung des Produkts
- Verwenden Sie Bradford-Test, um Produkt-13zu quantifizieren.
- Laufen zu reduzieren und nicht-reduzierende Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die Produkt-14zu bestätigen.
Hinweis: Verringerung der SDS-PAGE wird verwendet, um das Molekulargewicht des Hüllprotein bestätigen; nicht-reduzierende SDS-PAGE ist der höhere Auftragsstruktur bestätigen.
(5) Konjugation DB Verbindungen auf Qβ
-
Reduzieren Sie Disulfides auf Qβ.
- Lösen Sie 0,0020 g des tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) in 1 mL Reinstwasser eine 100 X-Stammlösung zu machen.
Hinweis: Bereiten Sie frische DÄMMUND vor der Reduktion. - Fügen Sie 200 µL des Qβ (5 mg/mL) zu einem Microcentrifuge Schlauch.
- Folgen Sie durch Zugabe von 20 µL der Stammlösung der 100 X TCEP.
- Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
- Lösen Sie 0,0020 g des tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) in 1 mL Reinstwasser eine 100 X-Stammlösung zu machen.
-
Neu Brücke reduzierte Disulfid mit Dibromomaleimide Polyethylenglykol (DB-PEG).
- 0,0017 g Dibromomaleimide-Polyethylenglykol (DB-PEG) in 100 µL DMF auflösen.
- 680 µL 10 mM Natriumphosphat Lösung (pH 5,00) hinzufügen.
- Fügen Sie Qβ in die DB-PEG-Lösung reduziert und beobachten Sie den Mischprozess unter 365 nm UV-Licht zu. Die helle gelbe Fluoreszenz kann sofort mit einer 365 nm handheld UV-Lampe beim Mischen visualisiert werden.
- Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) auf ein Drehspieß fortfahren.
- Das Reaktionsgemisch durch zentrifugale Filter zu reinigen (COMW = 10 kDa) dreimal mit 1 X PBS 3.283 x g für 20 min bei 4 ° C.
- Überwachen Sie die Konjugation von nicht-Verringerung der SDS-PAGE und native Agarose-Gelelektrophorese.
Hinweis: Untersuchten als intakt Partikel in native Agarosegel, und trennt sie je nach ihrer Ladung, Größe und Form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Dibromomaleimide-Derivate können durch die Kondensationsreaktion zwischen Dibromomaleimide-Anhydrid und primäre Amine15synthetisiert werden. Alternativ wurde eine milde synthetische Methode16 mit N-Methoxycarbonyl aktiviert 3,4-Dibromomaleimide hier ausgenutzt durch die Reaktion mit Methoxypolyethylene Glykol (PEG) Rendite DB-PEG (Abbildung 1). NMR wurde verwendet, um die zusammengesetzte Struktur (Abbildung 2) zu identifizieren. Qβ VLP ist ein 28 nm ikosaedrischen proteinhaltige Nanopartikel, die aus 180 identischen hüllproteinen besteht. Die Hüllproteine neigen dazu, über ihre α-helikale Domänen mit β-Blätter aus der angrenzenden Mantel Proteine17nichtkovalente ineinandergreifenden Dimere bilden. Untersuchten neigen dazu, für ihre Stabilität bei hohen Temperaturen, extreme pHs und in verschiedenen Lösungsmitteln Kompositionen18ausgewählt werden. In diesem Fall ist Qβ VLP stabiler als andere RNA-Phagen in der Leviviridac -Familie wegen 180 Inter Strang Disulfid Anleihen befindet sich an der fünf - und sechs-Fach Achsen der Symmetrie auf die Kapsid19 (Abbildung 3). Diese Hexameric und Pentameric Strukturen sind durch Disulfides, verbunden, die durch nicht-reduzierende SDS-PAGE19visualisiert werden können. Zehn Entsprechungen der DÄMMUND (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 µmol), bezogen auf die Disulfides in 1 mg Qβ (0.070 µmol Hüllprotein, 0,070 µmol Disulfides) wurden verwendet, um alle Disulfides um die reduzierten Qβ Capsids (rQβ) bei Raumtemperatur in einem generieren Stunde und nicht-reduzierende SDS-PAGE zeigt, dass die Strukturen der höheren Ordnung zu Monomeren Hüllproteine (Abbildung 4 und Abbildung 5A) reduziert wurden. Die Reaktion auf diese rebridge erfolgte als eine ein-Topf-Synthese, die rohe rQβ Beimischung direkt 20 äquivalente einer DB-PEG-Lösung hinzugefügt wurde (1,4 µmol) in Natriumphosphat (10 mM, pH 5,00, 10 % DMF) nach der einstündigen Reduktion Reaktion11. Sofort nach Zugabe von DB-PEG gab es sichtbare helle gelbe Fluoreszenz unter 365 nm UV Lampe (Abbildung 5). Die Mischung wurde dann inkubiert bei RT über Nacht auf ein Drehspieß, gefolgt von Reinigung mit Zentrifugal-Filter (MWCO = 10 kDa) Spülen mit dem gewünschten Puffer drei Mal, um überschüssige Mengen kleiner Moleküle zu entfernen. Die Qβ-Malemide-Konjugate wurden in 10 mM Natriumphosphat Lösung (pH 5,00) Förderung Photostabilität Nukleinsäuretablette. Die Konjugation wurde vom nicht-reduzierenden SDS-PAGE unter UV- und Coomassie blaue Färbung (Abb. 5A) bestätigt. Alle Bands zeigten Fluoreszenz (Abb. 5A) unter UV-die colocalized mit der Coomassie blaue Färbung, was eine erfolgreiche Konjugation. Die Integrität des Qβ-PEG Konjugate wurden durch native Agarose-Gel-Elektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abbildung 5 b, C) bestätigt.
Die Fluoreszenz-Spektroskopie zeigte die Anregung und Emission Maxima der Qβ-Maleimide (Qβ-Μ) und Qβ-PEG rund 400 nm und 540-550 nm betragen (Abbildung 6). Dies deckt sich mit den handelsüblichen GFP-UV-Filter, deren Erregung Wellenlänge 405 ist nm und Emission Wellenlänge beträgt 500 – 540 nm. Die bequeme Ausrichtung der photophysikalischen Eigenschaften der Konjugate mit den handelsüblichen Filter setzt Genehmigung mit Qβ-PEG als eine in-Vitro -Sonde, die getan wurde und in Abbildung 7dargestellt. Qβ-PEG (200 nM) war mit Maus Raw-264,7 Zellen in serumfreien DMEM Medium inkubiert, gefolgt von Kern zu beflecken. Ns1 Bilder in Abbildung 7 zeigt, dass gelb fluoreszierende Partikel wurden Uptaken von Raw-264,7 Zellen und nach vier Stunden Inkubation verfolgt werden. Die unfunctionalized Qβ untersuchten zeigen vernachlässigbar Fluoreszenz.
Abbildung 1: synthetische Schema der DB-PEG. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: NMR Charakterisierung. (A) 1 H-NMR und (B) 13C des DB-PEG. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: kristallographische Struktur des Qβ VLP Kapsid in Chimera verarbeitet (PDB ID: 1QBE). Zwei Cystein-Rückstände (Cys 74 und 80 Cys) werden in Orange angezeigt.
Abbildung 4: Konjugation Schema der Qβ-Maleimide (Qβ-M) Konjugate. Qβ (0,07 µmol Disulfides) wurde mit 10 Äquivalente der DÄMMUND gesenkt (0,7 µmol) bei RT für eine Stunde gefolgt durch Zugabe von 20 äquivalente Dibromomaleimide Verbindungen (DB und DB-PEG) (1,4 µmol). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Charakterisierung von Qβ, rQβ, Qβ-M und Qβ-PEG. (A) Non-Verringerung der SDS-PAGE und (B) native Agarose gel von Qβ, rQβ, Qβ-M und Qβ-PEG unter UV (oben) und Coomassie blaue Färbung (unten). (C) TEM mikrograph von Qβ-M (oben) und Qβ-PEG (unten). (D) Fotografieren der Qβ-PEG Reaktionsgemisch unter 365 nm UV-Beleuchtung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Fluoreszenz Spektren. Fluoreszenz Erregung (A) und Emission (B) Spektren von Qβ M und Qβ-PEG in 0,1 M von Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,00). Die maximale Erregung ist rund 400 nm und Emission Maximum ist um 540-550 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: konfokale Fluoreszenzbilder der Qβ-PEG in Makrophagen 264,7 Zellen konjugieren. Blau: NucRed Leben 647 ReadyProbes Reagenzien. Gelb: Qβ-PEG. Top Bilder: blau und gelb Kanäle zusammengeführt. Bilder unten: Hellfeld Bilder. Filtersätze: uv-GLP (ex λ = 405 nm, λEm = 500 – 540 nm), Cy5. Zeit der Inkubation war 4 Std. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Im Vergleich zu kleineren Proteinreinigung, ist ein einzigartiger Schritt bei der Reinigung von Bakteriophagen Qβ der Saccharose gradient Zentrifugation. Nach dem Chloroform/n-Butanol Extraktionsschritt wird Qβ weiter gereinigt mit 5-40 % Saccharose Steigungen. Bei der Zentrifugation werden Partikel anhand ihrer Größe getrennt. Größere Partikel Reisen in die höhere Dichte-Region, während kleinere Partikel in der niedrigeren Dichte Region bleiben. Qβ reist in das untere Drittel des Farbverlaufs und verweilt dort, während kleinere Protein Verunreinigungen am oberen Rand die Zentrifugenröhrchen gefangen sind. Die kolloidale Suspension von Qβ zeigt starke Tyndall Streuung in der Saccharose-Gradient, die kann man als ein blaues Band wenn eine LED-Leuchte aus gerichtet ist unter. Dieses Band ist dann einfach zu extrahieren, mit einer langen Spritzennadel. Qβ in Saccharose wird dann durch Ultrazentrifugation, oelletiert einen klare Pellet nachgeben. Das Pellet kann Nukleinsäuretablette in den gewünschten Puffer oder weiter durch schnelles Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt werden. Die Reinheit des daraus resultierenden Partikels kann durch SDS-PAGE bestätigt werden.
DÄMMUND ist nicht in Phosphatpuffer, stabil, so dass eine 100 X TCEP Stammlösung in Wasser direkt vor der Reduzierung frisch zubereitet werden sollte. Darüber hinaus DÄMMUND enthält freie Thiol weder gegenüber anderen Aminosäuren reagiert, so ist es nicht notwendig, die Überschreitung des DÄMMUND vor der Durchführung der Konjugation Reaktion zu entfernen. Dibromomaleimide Verbindungen sind pH 5,00 Natriumphosphat Lösung, gefolgt von den reduzierten Qβ hinzufügen aufgelöst. Cystein (reduzierte Disulfid) ist bei pH 5,00 protonierten, die die Konjugation Reaktion mit Dibromomaleimide fördert, indem es zurück auf ein Disulfid Re-Oxidation zu verhindern. Unter 365 nm UV-Beleuchtung, strahlt das Reaktionsgemisch gelbe Fluoreszenz unmittelbar nach reduzierten Qβ in DB Verbindungen hinzugefügt wurde. Anders wird diese Fluoreszenz von der Befestigung bereits synthetisierten Fluorophore auf Qβ, durch die Konjugation Reaktion induziert. Das Fluorophor wird gebildet, sobald die neue Verbindungen zwischen Schwefel und Maleimide Ring erstellt werden. Fluoreszenz-Spektren zeigt, dass die Erregung (400 nm) und Emission (550 nm) Maxima passen die uv-GFP-Filtersatz in einem confocal Mikroskop (λex = 405 nm, λEm = 500−540 nm). Qβ-PEG wurde dann mit Makrophagen Raw 264,7 in serumfreien DMEM inkubiert. Nach vier Stunden Inkubation war Qβ-PEG Uptaken und punktförmige gelbe fluoreszierende Fächer im Inneren der Zellen visualisiert werden können. Eine Tatsache, die erwähnt werden muss ist, dass die Fluoreszenz für teilweise an Rinderserumalbumin (BSA) im Serum oder anderen Cystein-reichen Substanzen in den Lysosomen oder die späten Endosomen Zellen übertragen werden kann. Im Laufe der Zeit schwächt dies die Fluoreszenz im Inneren der Zelle für Zelle tracking-Anwendungen; Es bietet jedoch auch eine Chance für ein neues Design für Drug Delivery Systeme.
Zusammenfassend haben wir bewiesen, Konjugation DB-PEG auf Qβ VLP durch Dibromomaleimide-Thiol-Chemie. Die all-in-One-Konjugation Reaktion nicht nur functionalizes die Disulfides entlang der Poren auf VLP mit PEG, aber macht es auch ein eindringmittel beschrifteten proteinhaltige Nanopartikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
J.J.G. erkennt die National Science Foundation (DMR-1654405) und Cancer Prevention Research Institut of Texas (CPRIT) (RP170752s) für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
