Summary
Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.
Abstract
A ascensão recente em partículas vírus-like (VLP) em biomédica e pesquisa de materiais pode ser atribuída à sua facilidade de biossíntese, tamanho discreto, programação genética e biodegradabilidade. Enquanto eles são altamente favoráveis para reações de bioconjugation para a adição de ligantes sintéticos em sua superfície, o intervalo em metodologias de bioconjugation sobre estes capsids nascidos aquosas é relativamente limitado. Para facilitar a direção da pesquisa de biomateriais funcionais, devem considerar-se reações de bioconjugation não-tradicionais. A reação descrita neste protocolo usa dibromomaleimides para introduzir a nova funcionalidade no solvente dissulfeto expostas de um VIP com base em Qβ do bacteriófago. Além disso, o produto final é fluorescente, que tem a vantagem de gerar uma sonda controlável em vitro , usando um conjunto de filtro disponíveis comercialmente.
Introduction
Usar capsids virais nanométricas emergiu como um campo excitante, que visa alargar o âmbito de aplicações em pesquisa biomédica1,2,3. Recombinantes expressas partículas vírus-like (VLP) são estruturalmente derivadas de vírus, mas falta-lhes o material genético viral original tornando-os não-infecciosa nanopartículas proteicas. Como as características de superfície são geneticamente programadas e cada capsídeo é expressa forma idêntica aos antes e depois dela, é possível saber a localização e o número de cadeias de lado reativo dos aminoácidos com precisão atomística. Em muitos casos, ambas as superfícies exteriores e interiores possuem muitos tipos de solvente expostas aminoácidos, que podem ser viável acrescidos através de reações de bioconjugation - reações que formam ligações covalentes entre uma biomolécula e sintético molécula de4,5.
Reações de Bioconjugation ajudam biomoléculas de interesse têm as mais diversas funcionalidades de uma forma relativamente simples. Moléculas de interesse, tais como drogas terapêuticas6, etiquetas fluorescentes7 e polímeros8,9 podem ser pre-sintetizadas e caracterizadas antes de que estão ligados na superfície de VIPs. Um VIP particularmente comum em biomedicina e pesquisa de biomateriais foi o VIP com base em Qβ do bacteriófago, que, como recombinantes expressas, são 28 nm icosahedral capsídeo viral10. Os locais mais comuns de reação em Qβ são lisinas por uma larga margem, embora nós comunicaram recentemente a conjugação bem sucedida11 de compostos dibromomaleimide para os dissulfetos reduzidos que revestem os poros da Qβ através de uma reação de Haddleton-Baker. A reação procede com bom rendimento e, igualmente importante, sem perder a estabilidade térmica das partículas. Ao mesmo tempo, esta reação gera fluorescência induzida por conjugação, que pode ser usada para rastrear a absorção destas partículas em células. Neste trabalho, demonstramos a conjugação de polietileno glicol (PEG) sobre a superfície da Qβ através da reação de Haddleton-Baker, que resulta em um fluoróforo amarelo brilhante. Estas partículas podem ser rastreadas então como eles estão tomados por células. O protocolo aqui ajudará pesquisadores gerar novo peguilado fluorescente nanopartículas proteicas baseadas em Qβ, apesar de seus princípios são aplicáveis a um dos muitos outros VIPs contendo solventes dissulfetos expostos.
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Protocol
1. preparação
- Fazer o ágar-ágar lisogenia caldo (LB) e despeje placas12.
-
Transforme o BL21(DE3) com um plasmídeo pET28 que contém a sequência de proteínas de revestimento wtQβ.
- Descongele células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) em um banho de gelo. Colocar 50 μL de células em um tubo de microcentrifugadora.
- Adicionar 2 μL do plasmídeo em um tubo e agite suavemente o tubo. Então incube no gelo por 30 min.
- Calor-choque as células para 45 s num banho de água que é exatamente a 42 ° c. Coloque o tubo de volta no banho de gelo imediatamente após calor-choque e incubar durante 5 min.
- Adicione 950 μL de LB mídia que não contenha qualquer antibiótico.
- Agite a cultura a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
- Placa 100 μL da cultura em placas de ágar LB (com canamicina) e incube a placa durante a noite a 37 ° C. Selecione colônias brancas quando necessário.
-
Faça mídia Super ideal caldo (SOB).
- Autoclave dois 2 L confusos Erlenmeyers num ciclo superdry.
- Em um ambiente asséptico, pesar e adicionar 20,0 g de triptona, extrato de 5,0 g de levedura, 2,469 g de sulfato de magnésio anidro, 0,584 g de cloreto de sódio e 0,186 g de cloreto de potássio para cada balão.
- Trazer o volume de 1 L com água ultrapura em cada balão e autoclave ao ciclo de líquido.
- Uma vez que a mídia SOB alcançou a temperatura após a autoclavagem, adicionar 1 mL de canamicina (100mg/mL) para cada litro de mídia e armazenar a 4 ° C.
-
Fazer o tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
- Fazer 1 M potássio monobásico solução dissolvendo-se 68,045 g de potássio monobásico em 500 mL de água ultrapura.
- Fazer 1 M potássio dibásico solução dissolvendo 87,09 g de potássio dibásico em 500 mL de água ultrapura.
- Adicione 38,5 mL de solução de potássio monobásico e 61,5 mL de potássio dibásico para uma garrafa de 1 L.
- Ajustar o pH a 7.00, se necessário e trazer para um volume de 1 L.
-
Faça 5 – 40% gradientes de sacarose em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
- Em tubos de centrífuga de 50 mL, prepare soluções com sacarose 5 – 40% (aumentando em incrementos de 5%) dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
- Depósito 3,3 mL da solução de sacarose 5% na parte inferior de um tubo de fundo redondo de policarbonato 38 mL utilizando uma seringa de agulha longa e repita isto para cinco outros tubos.
- Depositar cuidadosamente 3,3 mL da solução de sacarose 10% na parte inferior do tubo e Retire cuidadosamente a agulha como para não incomodar o gradiente. Repita para os outros cinco tubos.
- Continue a depositar camadas 3,3 mL das soluções de sacarose, aumento de 15% para 40% em cada tubo, enquanto sendo cuidadoso para não perturbar o gradiente.
- Quando completo, cobrir os topos dos gradientes com papel alumínio e armazene a-80 ° C.
2. a expressão de Qβ
- Limpe a área com água sanitária de 1:1 (etanol) banco.
- Faça dois fermentos de 3 mL em um ambiente asséptico adicionando única colônias de Escherichia coli BL21(DE3) em 3 mL de mídia SOB um ambiente asséptico.
- Cresce num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% de umidade relativa (rH) durante a noite.
-
Inocule a cultura em mídia SOB:
- Tire o agitador ambos os fermentos de 3 mL e, em um ambiente asséptico, despeje cada cultura starter em um dos dois 2L perplexo Erlenmeyers com 1 L de mídia de soluço fresca em cada um.
- Coloque a mídia inoculada num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH.
- Cresce a bactéria num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH até OD600 atinge 0,9 – 1.0.
- Adicione 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando uma pipeta P1000 para induzir a expressão da proteína.
- Deixe a mídia no agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH durante a noite.
- Remova mídia de agitador da manhã seguinte e centrífuga usando garrafas de 1000ml a 20.621 × g por 1 h a 4 ° C para colher as células.
-
Desprezar o sobrenadante e coletar o centrifugado.
- Despeje o sobrenadante para um balão com cerca de 5 mL de água sanitária para matar as bactérias. Isso é lixo.
- Use uma espátula para raspar o centrifugado do fundo da garrafa centrífuga e colocar a pelota em um tubo de centrífuga de 50 mL.
3. purificação de Qβ
- Ressuspender as células com ~ 20 a 30 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
- Verifique se a ressuspensão tem sem pedaços e lisar as células usando um processador de microfluidizer de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Lise as células pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas.
- Centrifugue o lisado em garrafas de 250 mL centrífuga a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
- Descartar a pelota e medir o volume de sobrenadante em mL. Multiplique esse valor por 0,265 e adicionar essa quantidade de g de sulfato de amônio para o sobrenadante.
- Misture a 4 ° C, durante pelo menos 1 h em um prato misture a 200 rpm para precipitar-se a proteína.
- Centrifugue em frascos de 250 mL a 20.621 x g, durante 1 h a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com cerca de 10 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
- Adicione volumes iguais de clorofórmio/n-butanol de 1:1 para a amostra bruta e mistura num Vortex durante alguns segundos.
- Centrifugue em tubos de 38 mL a 20.621 × g por 30 minutos a 4 ° C.
- Recupere a camada aquosa superior utilizando uma pipeta Pasteur. Seja cauteloso para não tomar qualquer do gel como camada que se formou entre a camada aquosa e orgânica.
- Descongelar o seis gradientes de sacarose pré-fabricados de 5-40% e carregar cerca de 2 mL do extrato para cada um.
- Se a 99.582 x g, durante 16 h a 4 ° C, com desaceleração livre.
- Brilha uma luz emitindo luz de diodo (LED) em cada tubo e uma faixa azul deve tornar-se visível. Recupere essas partículas com uma seringa de agulha longa.
- Ultrapellet as partículas a 370.541 x g, durante 2,5 h a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o transparente de partículas purificadas com tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
4. quantificação e confirmação do produto
- Use o ensaio de Bradford para quantificar o produto13.
- Reduzindo a execução e não de redução de sódio Dodecil sulfato de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar o produto14.
Nota: Reduzir SDS-PAGE é usado para confirmar o peso molecular da proteína do revestimento; não-reduzir SDS-PAGE é para confirmar a estrutura de ordem superior.
5. conjugação DB compostos em Qβ
-
Reduza a dissulfetos na Qβ.
- Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) (TCEP) de fosfina em 1 mL de água ultrapura, tornar-se uma solução estoque de 100 x.
Nota: Prepare TCEP fresco antes da redução. - Adicione 200 µ l de Qβ (5 mg/mL) em um tubo de microcentrifugadora.
- Siga pela adição de 20 µ l de solução-mãe de 100 x TCEP.
- Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
- Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) (TCEP) de fosfina em 1 mL de água ultrapura, tornar-se uma solução estoque de 100 x.
-
Re-ponte dissulfeto reduzido usando dibromomaleimide polietileno glicol (PEG-DB).
- Dissolva 0,0017 g de dibromomaleimide-polietileno glicol (PEG-DB) em 100 µ l de DMF.
- Adicione 680 µ l de solução de fosfato de sódio de 10 mM (pH 5,00).
- Adicionar reduzida Qβ na solução de DB-PEG e observar o processo de mistura sob uma lâmpada de UV 365 nm. A fluorescência amarela brilhante pode ser visualizada imediatamente com um 365 nm portátil UV lâmpada em cima da mistura.
- Deixe a reação prosseguir durante a noite em temperatura ambiente (RT) em um espeto.
- Purificar a mistura de reação pelo filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) três vezes usando 1X PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
- Monitore a conjugação, não reduzindo SDS-PAGE e eletroforese em gel de agarose nativo.
Nota: VIPs executar como partículas intactas em gel de agarose nativo, e eles são separados com base em sua carga, tamanho e forma.
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Representative Results
Os derivados do dibromomaleimide podem ser sintetizados através da reação de condensação entre anidrido dibromomaleimide e aminas primárias15. Como alternativa, um método sintético suave16 usando N-metoxicarbonil ativado 3,4-dibromomaleimide aqui foi explorada por reagir com methoxypolyethylene glicol (PEG) de rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR foi usado para identificar a estrutura de compostos (Figura 2). Qβ VLP é um 28 nm icosahedral proteicas nanopartículas, que é composto de 180 proteínas casaco idêntico. As proteínas de casaco tendem a formar dímeros de bloqueio não covalente através de seus domínios de α-hélice com as β-folhas do casaco adjacentes proteínas17. Os VIPs tendem a ser selecionado para a sua estabilidade em altas temperaturas, pHs extremos e em várias composições de solvente18. Neste caso, Qβ VLP é mais estável que outros fago RNA da família Leviviridac devido à 180 dissulfeto inter vertente localizado em cinco e seis meias eixos de simetria em capsídeo19 (Figura 3). Estas estruturas hexamérica e pentamérica estão ligadas por dissulfetos, que podem ser visualizados por não-reduzindo SDS-PAGE19. Equivalentes de dez do TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 µmol), em relação os dissulfetos em 1 mg de Qβ (0,070 µmol casaco proteína, 0,070 dissulfetos µmol), foram utilizados para reduzir todos os dissulfetos para gerar os capsids reduzidas de Qβ (rQβ) à temperatura ambiente em um hora e não reduzindo SDS-PAGE mostra que todas as estruturas superiores da ordem foram reduzidas a proteínas monoméricas casaco (Figura 4 e Figura 5A). A reação de rebridge-los foi feita como uma síntese de um pote, como a adição de rQβ cru foi adicionada diretamente à 20 equivalentes de uma solução de DB-PEG (1.4 µmol) em fosfato de sódio (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) após a redução de uma hora de reação11. Havia observável fluorescência amarela brilhante sob lâmpada de 365 nm UV (Figura 5) imediatamente após a adição de PEG-DB. A mistura foi então incubada a RT durante a noite em um espeto, seguido de depuração usando filtro centrífugo (MWCO = 10 kDa) enxaguar com o buffer desejado três vezes para remover quantidades excessivas de pequenas moléculas. Conjugados a Qβ-malemide foram resuspended em solução de fosfato de sódio de 10 mM (pH 5,00) para promover a fotoestabilidade. A conjugação foi confirmada, não reduzindo SDS-PAGE sob UV e coomassie azul coloração (Figura 5A). Todas as bandas mostraram fluorescência (Figura 5A) sob luz ultravioleta, que colocalized com o azul de coomassie, coloração, representando uma bem sucedida conjugação. A integridade da Qβ-PEG conjugados foram confirmados por nativos agarose gel de eletroforese e transmissão microscopia electrónica (TEM) (Figura 5B, C).
A espectroscopia de fluorescência mostraram os máximos da excitação e emissão de Qβ-maleimide (Qβ-Μ) e Qβ-PEG ser cerca de 400 nm e 540-550 nm, respectivamente (Figura 6). Isto se alinha com o conjunto de filtro disponível comercialmente GFP-uv, cujo comprimento de onda de excitação é 405 nm e emissão de comprimento de onda é 500-540 nm. O alinhamento conveniente das propriedades dos conjugados com o filtro disponível comercialmente photophysical define autorização usando Qβ-PEG como uma sonda em vitro , que foi feita e fotografada na Figura 7. Qβ-PEG (200 nM) foi incubado com Mouse Raw-264.7 células em meio livre de soro DMEM, seguido de coloração de núcleo. Imagens colocalization na Figura 7 mostra que o amarelas fluorescentes partículas foram captação pelas células Raw 264.7 e podem ser controladas após quatro horas de incubação. Os VIPs Qβ unfunctionalized mostrar fluorescência insignificante.
Figura 1: esquema sintética da DB-PEG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização de NMR. (A) 1 H-NMR e (B) 13C de DB-PEG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: estrutura cristalográfica do capsídeo Qβ VLP como processada em Quimera (PDB ID: 1QBE). Dois resíduos de cisteína (Cys 74 e 80 Cys) são mostrados em laranja.
Figura 4: esquema de conjugação de conjugados de Qβ-maleimide (Qβ-M). Qβ (0,07 µmol de dissulfetos) foi reduzida usando 10 equivalentes do TCEP (0,7 µmol) em RT durante uma hora, seguida pela adição de 20 equivalentes de compostos dibromomaleimide (DB e DB-PEG) (1.4 µmol). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: caracterização de Qβ, rQβ, Qβ-M e Qβ-PEG. (A) Non-reduzindo SDS-PAGE e (B) nativo agarose gel de Qβ, rQβ, Qβ-M e Qβ-PEG sob UV (topo) e coomassie blue coloração (parte inferior). Micrografia de temperatura (C) de Qβ-M (topo) e Qβ-PEG (parte inferior). (D) mistura de reação de fotografar da Qβ-PEG sob iluminação de 365 nm UV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: espectro de fluorescência. Fluorescência excitação (A) e emissão (B) espectros de Qβ-M e Qβ-PEG em 0,1 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,00). A excitação máxima é de cerca de 400 nm e emissão máxima é em torno de 540-550 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: imagens de fluorescência Confocal de Qβ-PEG conjugado em células de macrófagos 264.7. Azul: NucRed Live 647 ReadyProbes reagentes. Amarelo: Qβ-PEG. Top imagens: fundiu-se canais de azuis e amarelos. Imagens de fundo: imagens de campo brilhante. Conjuntos de filtro: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. Tempo de incubação foi 4 h. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Comparado a purificação de proteínas menor, um único passo na purificação do bacteriófago Qβ é a centrifugação gradiente de sacarose. Após a etapa de extração de clorofórmio/n-butanol, Qβ ainda mais purified usando gradientes de sacarose 5-40%. Durante a centrifugação, as partículas são separadas com base em seus tamanhos. Partículas maiores viajam à região de densidade mais elevada, enquanto que partículas menores fica na região da baixa densidade. Qβ viaja para o terço inferior do gradiente e permanece lá enquanto impurezas menores de proteína são presos na parte superior do tubo. A suspensão coloidal de Qβ mostra forte Tyndall espalhamento no gradiente de sacarose, que pode ser visto como uma banda azul quando um diodo emissor de luz é brilhada de baixo. Esta banda é então fácil de extrair usando uma agulha longa seringa. Qβ em sacarose é então peletizado por ultracentrifugação, rendendo uma pelota de clara. O sedimento pode ser resuspended no buffer desejado ou mais purificado por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). A pureza da partícula resultante pode ser confirmada por SDS-PAGE.
TCEP não é estável em tampão de fosfato, então uma solução stock de x TCEP 100 deve ser preparado na água imediatamente antes da redução. Além disso, TCEP contém thiol livre nem reage em direção a outros aminoácidos, portanto, não é necessário remover o excesso de TCEP antes de realizar a reação de conjugação. Dibromomaleimide compostos são dissolvidos em solução de pH 5,00 fosfato de sódio, seguida, adicionando o Qβ reduzida. Em pH 5,00, cisteína (bissulfeto reduzida) é protonado, que promove a reação de conjugação com dibromomaleimide, impedindo a re-oxidação para um dissulfeto. Iluminação de UV abaixo dos 365 nm, a mistura de reação emite fluorescência amarela imediatamente após Qβ reduzida foi adicionado em compostos de DB. Diferentemente de anexar fluorophores pre-sintetizado na Qβ, essa fluorescência é induzida pela reação de conjugação. O fluoróforo é formado, assim como são criados os novos laços entre o enxofre e o anel de maleimide. Espectros de fluorescência mostra que a excitação (400 nm) e emissão (550 nm) maxima cabe o filtro uv-GFP definido em um microscópio confocal (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PEG foi então incubado com macrófagos 264.7 crus em DMEM isento de soro. Após quatro horas de incubação, Qβ-PEG foi captação e punctate amarelo fluorescentes compartimentos podem ser visualizados no interior das células. Um fato que deve ser mencionado é que a fluorescência pode ser transferida para certa medida a albumina de soro bovino (BSA) no soro ou outras substâncias rica em cisteína dentro os lisossomos ou os endossomos atrasados de células. Ao longo do tempo, isso vai enfraquecer a fluorescência no interior da célula por célula, acompanhamento de pedidos; no entanto, ele também fornece uma oportunidade para um novo design para sistemas de distribuição de drogas.
Em conclusão, temos demonstrado conjugação DB-PEG na Qβ VLP através da química dibromomaleimide-tiol. A reação de conjugação de all-in-one não só functionalizes os dissulfetos, ao longo dos poros na VIP com PEG, mas também o torna uma nanopartícula fluorescente etiquetada proteicas.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
J.J.G. reconhece a Fundação Nacional de ciência (DMR-1654405) e câncer prevenção Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pelo seu apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
