Summary
Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.
Abstract
La récente hausse des Pseudo-particules virales (VLP) dans la recherche biomédicale et la recherche sur les matériaux peut être attribuée à leur facilité de biosynthèse, taille discrète, programmabilité génétique et biodégradabilité. Pendant qu’ils sont très susceptibles de réactions bioconjugaison permettant d’ajouter des ligands synthétiques sur leur surface, la bioconjugaison méthodologies sur ces capsides nés aqueux est relativement limitée. Pour faciliter la direction de la recherche de biomatériaux fonctionnels, réactions bioconjugaison non traditionnels doivent être considérées. La réaction décrite dans le présent protocole utilise dibromomaleimides pour introduire de nouvelles fonctionnalités dans le solvant disulfures exposées d’un PPV basés sur Qβ de bactériophage. En outre, le produit final est fluorescent, qui présente l’avantage de produire une sonde traçable in vitro à l’aide d’un jeu de filtres disponibles dans le commerce.
Introduction
À l’aide de taille nanométrique des capsides virales est devenue un domaine passionnant, qui vise à élargir le champ des applications dans la recherche biomédicale1,2,3. Inoculation exprimées Pseudo-particules virales (VLP) structurellement proviennent de virus, mais ils n’ont pas le matériel génétique viral initial, ce qui les rend non infectieuses protéinacées nanoparticules. Comme les caractéristiques de la surface sont génétiquement programmés et chaque capside est exprimée identiquement à ceux avant et après elle, il est possible de connaître l’emplacement et le nombre de chaînes de réactif latérales des acides aminés avec précision des atomes. Dans de nombreux cas, des surfaces extérieures et intérieures possèdent beaucoup de genres de résidus de solvant exposés d’acides aminés, qui peuvent facilement être fonctionnalisés par bioconjugaison réactions - réactions qui forment des liaisons covalentes entre une biomolécule et synthétique molécule4,5.
Bioconjugaison réactions aident biomolécules d’intérêt ont des fonctionnalités plus diversifiées de façon relativement simple. Molécules d’intérêt, tels que les médicaments thérapeutiques6, étiquettes fluorescentes7 et polymères8,9 peuvent être préalablement synthétisés et caractérisés avant ils sont attachés à la surface du PPV. Un PPV particulièrement courante en recherche biomédicale et recherche des biomatériaux a été le VLP basé sur Qβ de bactériophage, qui, comme inoculation exprimée, est un de capside icosaédrique nm 2810. Sites de réaction les plus communs sur Qβ sont des lysines par une large marge, bien que nous avons récemment communiqué la conjugaison réussie11 de dibromomaleimide composés pour les disulfures réduites qui tapissent les pores du Qβ par une réaction de Haidar-Baker. La réaction se produit avec un bon rendement et, tout aussi important, sans perdre la stabilité thermique des particules. Dans le même temps, cette réaction génère la fluorescence induite sur la conjugaison, qui peut être utilisée pour suivre l’absorption de ces particules dans des cellules. Dans ce travail, nous démontrons la conjugaison de polyéthylène glycol (PEG) sur la surface de Qβ grâce à la réaction de Haidar-Baker, qui se traduit par un fluorophore jaune vif. Ces particules puis peuvent être suivis que comme elles sont recueillies par les cellules. Le protocole ci-après aidera les chercheurs à générer de nouveau pégylé fluorescent nanoparticules protéiques basés sur Qβ, bien que ses principes sont applicables à l’un des nombreux autres PPV du contenant le solvants disulfures exposées.
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Protocol
1. préparation
- Faire agar de lysogénie bouillon (LB) et verser des plaques12.
-
Transformer BL21 (DE3) avec un plasmide pET28 qui contient la séquence de protéine de manteau de wtQβ.
- Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli BL21 (DE3) dans un bain de glace. Place 50 μL de cellules dans un tube de microcentrifuge.
- Ajouter 2 μL de plasmide dans un tube et effleurer doucement le tube. Puis incuber sur glace pendant 30 min.
- Choc thermique les cellules pour 45 s dans un bain d’eau à 42 ° c exactement. Placer le tube dans le bain de glace immédiatement après la chaleur-choquant et incuber pendant 5 min.
- Ajouter 950 μL de médias LB qui ne contient pas de n’importe quel antibiotique.
- Secouez la culture à 200 tr/min pendant 60 min à 37 ° C.
- Plaque de 100 μL de la culture sur plaques de gélose LB (avec kanamycine) et incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Sélectionner les colonies blanches lorsque nécessaire.
-
Faire des médias de Super optimale bouillon (SOB).
- Autoclave deux 2 L déconcerté Erlenmeyers selon un cycle de superdry.
- En milieu aseptique, peser et ajouter 20,0 g de tryptone, extrait de 5,0 g de levure, 2,469 g de sulfate de magnésium anhydre, 0,584 g de chlorure de sodium et 0,186 g de chlorure de potassium dans chaque fiole.
- Compléter le volume à 1 L avec de l’eau ultrapure dans chaque fiole et autoclave sur le cycle de liquid.
- Une fois que les médias de SOB a atteint la température ambiante après la stérilisation, ajouter 1 mL de kanamycine (100 mg/mL) à chaque litre de médias et conserver à 4 ° C.
-
Faire le tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
- Faire 1 M potassium monobasique solution en dissolvant 68,045 g de potassium monobasique dans 500 mL d’eau ultrapure.
- Faire 1 M potassium dibasique solution en dissolvant 87,09 g de potassium dibasique dans 500 mL d’eau ultrapure.
- Ajouter 38,5 mL de solution de potassium monobasique et 61,5 mL de potassium dibasique à une bouteille de 1 L.
- Ajuster le pH à 7,00 si nécessaire et porter à un volume de 1 L.
-
Faites 5 à 40 % de gradients de sucrose à tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
- En tubes de 50 mL de centrifugeuse, préparer les solutions avec 5 – 40 % (augmentation par paliers de 5 %) de saccharose dissous dans le tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
- Déposez 3,3 mL de solution de 5 % de saccharose au fond d’un tube à fond rond en polycarbonate 38 mL à l’aide d’une seringue de longue aiguille et répétez cette opération pour cinq autres tubes.
- Déposer soigneusement 3,3 mL de solution de saccharose de 10 % dans le bas du tube et retirer délicatement l’aiguille quant à ne pas déranger le gradient. Répétez pour les cinq autres tubes.
- Continuer à déposer des couches de 3,3 mL des solutions de saccharose, passant de 15 % à 40 % dans chaque tube, tout en étant prudent ne pas déranger le gradient.
- Lorsque vous avez terminé, couvrir le dessus des gradients d’aluminium et conserver à-80 ° C.
2. expression de Qβ
- Essuyer la zone de banc avec 1:1 eau de Javel et de l’éthanol.
- Faire deux ferments de 3 mL en milieu aseptique en ajoutant des colonies individuelles de e. coli BL21 (DE3) dans 3 mL de médias SOB en milieu aseptique.
- Se développer sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % d’humidité relative (HR) durant la nuit.
-
Ensemencer la culture starter dans les médias de SOB :
- Décoller les deux ferments de 3 mL de l’agitateur et, dans un environnement aseptique, verser chaque culture starter dans un des deux 2 L dérouté Erlenmeyers avec 1 L de supports neufs de SOB dans chacune.
- Placer les médias inoculés sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH.
- Cultiver les bactéries sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH OD600 jusqu'à 0,9 à 1,0.
- Ajouter 1 mL de 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à l’aide d’une pipette P1000 pour induire l’expression de la protéine.
- Laisser les médias sur l’agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH du jour au lendemain.
- Enlevez média le shaker le lendemain matin et centrifuger à l’aide de bouteilles de 1000 mL à 20 621 × g pendant 1 h à 4 ° C de récolter les cellules.
-
Jeter le surnageant et recueillir le culot cellulaire.
- Versez le liquide surnageant dans une fiole avec environ 5 mL d’eau de Javel pour tuer les bactéries. Il s’agit des déchets.
- Utilisez une spatule pour gratter le culot du fond de la bouteille de la centrifugeuse et mettre la pastille dans un tube à centrifuger 50 mL.
3. purification de Qβ
- Resuspendre le culot cellulaire avec environ 20 à 30 mL de tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
- Assurez-vous que la remise en suspension n’a aucun morceaux et lyser les cellules à l’aide d’un processeur microfluidiseur selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Lyse des cellules au moins deux fois pour augmenter le rendement des particules.
- Centrifuger le lysat en bouteilles de 250 mL centrifugeuse à 20 621 x g pendant 1 h à 4 ° C.
- Jeter le culot et mesurer le volume du liquide surnageant dans mL. Multipliez cette valeur par 0,265 et ajouter ce montant de g de sulfate d’ammonium au surnageant.
- Remuer à 4 ° C pendant au moins 1 h sur une plaque de remuer à 200 tr/min à précipiter les protéines.
- Centrifuger en bouteilles de 250 mL à 20 621 x g pendant 1 h à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot avec environ 10 mL de tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
- Ajouter des volumes égaux de 1:1 chloroforme/n-butanol à l’échantillon brut et mélanger au Vortex pendant quelques secondes.
- Centrifuger en tube 38 mL à 20 621 × g pendant 30 minutes à 4 ° C.
- Récupérer la couche aqueuse à l’aide d’une pipette Pasteur. Soyez prudent ne pas de prendre du gel comme couche qui s’est formé entre la couche aqueuse et organique.
- Décongeler les six gradients de sucrose pré-faites de 5 à 40 % et charger environ 2 mL de l’extrait sur chacune.
- Ultracentrifugeuse à 99 582 x g pendant 16 h à 4 ° C, avec une décélération gratuite.
- Briller un feu émettant une lumière diode électroluminescente (del) dans chaque tube et une bande bleue devienne visible. Récupérer ces particules avec une longue aiguille seringue.
- Ultrapellet les particules à 370 541 x g pendant 2,5 heures à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot transparent de particules purifiés avec tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
4. quantification et Confirmation du produit
- Analyse de Bradford permet de quantifier les produits13.
- Réduction de l’exécution et non réductrice de dodécylsulfate de sodium sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) pour confirmer le produit14.
NOTE : Réduction de SDS-PAGE est utilisé pour confirmer le poids moléculaire de la protéine de capside ; SDS-PAGE non réducteur est de confirmer la structure d’ordre supérieure.
5. conjugaison des composés de la DB sur Qβ
-
Réduire les disulfures sur Qβ.
- Dissoudre 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) dans 1 mL d’eau ultrapure pour faire une solution stock de 100 x.
NOTE : Préparez PTCE fraîche avant réduction. - Ajouter 200 µL de Qβ (5 mg/mL) dans un tube de microcentrifuge.
- Suivre en ajoutant 20 µL de solution étalon de 100 x TCEP.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Dissoudre 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) dans 1 mL d’eau ultrapure pour faire une solution stock de 100 x.
-
Nouveau pont disulfure réduit à l’aide de dibromomaleimide polyéthylène glycol (PEG-DB).
- Dissoudre 0,0017 g de dibromomaleimide-polyéthylène glycol (PEG-DB) dans 100 µL de DMF.
- Ajouter 680 µL de solution de phosphate de sodium 10 mM (pH 5.00).
- Ajouter Qβ a réduit dans la solution de DB-PEG et observer le processus de mixage sous une lampe à UV 365 nm. La fluorescence jaune vif peut être visualisée immédiatement avec une lampe à UV poche 365 nm à mélanger.
- Laissez la réaction passez une nuit à température ambiante (RT) sur une rôtissoire.
- Purifier le mélange réactionnel par filtre centrifuge (OCMV = 10 kDa) trois fois à l’aide de solution 1 PBS x à 3 283 x g pendant 20 min à 4 ° C.
- Surveiller la conjugaison non réducteur SDS-PAGE et électrophorèse sur gel d’agarose native.
Remarque : VLP couler comme des particules intactes en gel d’agarose native, et elles sont séparées selon leur charge, la taille et la forme.
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Representative Results
Les dérivés de dibromomaleimide peuvent être synthétisés par la réaction de condensation entre l’anhydride dibromomaleimide et des amines primaires,15. Par ailleurs, une méthode synthétique doux16 à l’aide de N-méthoxycarbonyl activé 3,4-dibromomaleimide a été exploitée ici en réagissant avec le MÉTHOXYPOLYÉTHYLÈNE glycol (PEG) au rendement DB-PEG (Figure 1). La RMN a été utilisés pour identifier la structure du composé (Figure 2). Qβ VLP est un 28 nm icosaédrique protéiques NANOPARTICULE, qui se compose de 180 protéines identiques. Les protéines de manteau tendent à former des dimères de verrouillage non covalentes grâce à leurs domaines α-hélicoïdale à la β-feuilles de la couche adjacente protéines17. Les PPV ont tendance à être sélectionnés pour leur stabilité à haute température, des pH extrêmes et diverses compositions solvant18. Dans ce cas, Qβ VLP est plus stable que les autres phages de RNA dans la famille de Leviviridac en raison de 180 disulfures inter-brin situé à cinq et six rabattable axes de symétrie de la capside19 (Figure 3). Ces structures hexamérique et pentamérique sont reliées par disulfures, qui peuvent être visualisés par non réducteur SDS-PAGE19. Dix équivalents de TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 µmol), par rapport aux disulfures dans 1 mg de Qβ (protéine de capside 0.070 µmol, 0,070 µmol disulfures), ont été utilisés pour réduire tous les disulfures pour générer les capsides réduites de Qβ (rQβ) à la température ambiante dans un heure et non réducteur SDS-PAGE montre que toutes les structures supérieures de l’ordre ont été réduits à protéines monomériques (Figure 4 et Figure 5 a). La réaction de rebridge leur a été faite comme une synthèse one-pot, comme le mélange brut rQβ a été ajouté directement à 20 équivalents d’une solution de DB-PEG (1,4 µmol) en phosphate de sodium (10 mM, pH 5.00, 10 % DMF) suite à la réaction de réduction d’une heure11. Il y avait des observable fluorescence jaune vif sous lampe à 365 nm UV (Figure 5) immédiatement après l’addition de la DB-PEG. Le mélange est alors incubé à RT du jour au lendemain sur une rôtisserie, suivie d’épuration par filtre centrifuge (MWCO = 10 kDa) rinçage avec le tampon souhaité trois fois pour enlever des quantités excessives de petites molécules. Les conjugués de Qβ-malemide ont été remis en suspension dans une solution de phosphate de sodium de 10 mM (pH 5.00) pour promouvoir la photostabilité. La conjugaison a été confirmée par SDS-PAGE, sous UV et coloration (Figure 5 a) bleu de coomassie non réducteur. Toutes les bandes ont montré de fluorescence (Figure 5 a) sous exposition aux UV qui colocalisé avec le bleu de coomassie, coloration, ce qui représente une conjugaison réussie. L’intégrité des Qβ-PEG conjugués ont été confirmés par le natif d’agarose gel électrophorèse et transmission par microscopie (met) (Figure 5 b, C).
La spectroscopie de fluorescence a montré les maxima d’excitation et d’émission de Qβ-maléimide (Qβ-Μ) et Qβ-PEG à près de 400 nm et 540 à 550 nm, respectivement (Figure 6). Il s’aligne avec le jeu de filtre GFP-uv disponible dans le commerce, dont longueur d’onde d’excitation est de 405 nm et émission de longueur d’onde est de 500 à 540 nm. L’alignement idéal des propriétés photophysiques des conjugués avec le filtre disponible dans le commerce définit les permis en utilisant Qβ-PEG comme une sonde in vitro , qui a été faite et imagée à la Figure 7. Qβ-PEG (200 nM) a été incubé avec souris Raw-264.7 cellules dans un milieu DMEM sans sérum, suivie par la coloration du noyau. Images de colocalisation dans la Figure 7 montre que les particules fluorescentes jaunes ont été adoptés par les premières-264.7 cellules et peuvent être l’objet d’un suivi après quatre heures d’incubation. Les PPV de Qβ du tétrahydrofuraniques montrent une fluorescence négligeable.
Figure 1 : schéma synthétique de DB-PEG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : caractérisation de NMR. (A) 1 H et (B) 13C du DB-PEG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : structure cristallographique de la capside Qβ VLP comme transformé en chimère (PDB ID : 1QBE). Deux résidus de cystéine (Cys 74 et 80 Cys) sont indiqués en orange.
Figure 4 : schéma de la conjugaison de conjugués Qβ-maléimide (Qβ-M). Qβ (0.07 µmol de disulfures) a été réduite à l’aide de 10 équivalents de TCEP (0,7 µmol) à ta pendant une heure, suivie par l’addition de 20 équivalents des composés dibromomaleimide (DB et DB-PEG) (1,4 µmol). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : caractérisation de Qβ, rQβ, Qβ-M et Qβ-PEG. (A) Non réductrices SDS-PAGE et (B) native agarose gel de Qβ, rQβ, Qβ-M et Qβ-PEG sous UV (en haut) et de bleu de coomassie bleu coloration (en bas). Micrographie TEM (C) Qβ-M (en haut) et Qβ-PEG (en bas). (D) la photo de Qβ-PEG mélange réactionnel sous un éclairement 365 nm UV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : les spectres de Fluorescence. Fluorescence (A) et émission (B) spectres d’excitation de Qβ-M et Qβ-PEG en 0,1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7.00). L’excitation maximale est environ 400 nm et émission maximale est d’environ 540 à 550 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : images Confocal fluorescence de Qβ-PEG conjugué dans les cellules macrophages 264.7. Bleu : NucRed Live 647 ReadyProbes réactifs. Jaune : Qβ-PEG. Top images : fusionne les canaux bleus et jaunes. Images de fond : images de champ lumineux. Filtrer les jeux : uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500 – 540 nm), Cy5. Temps d’incubation est de 4 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Par rapport à la purification de protéines plus petite, une étape unique en épurant bactériophage Qβ est la centrifugation en gradient de saccharose. Après l’étape d’extraction chloroforme/n-butanol, Qβ est ensuite purifiée à l’aide de gradients de sucrose de 5 à 40 %. Lors de la centrifugation, les particules sont séparées selon leur taille. Grosses particules rendront dans la région de densité plus élevée, alors que les plus petites particules restent dans la région de densité plus faible. Qβ se rend dans le tiers inférieur du dégradé et y reste pendant que les plus petites impuretés de protéine sont pris au piège dans la partie supérieure du tube à centrifuger. La suspension colloïdale de Qβ montre Tyndall forte dispersion dans le gradient de saccharose, qui peut être vu comme une bande bleue lorsqu’une lumière LED est a brillé de dessous. Cette bande est ensuite facile à extraire à l’aide d’une aiguille de seringue longue. Qβ en saccharose est ensuite granulé par ultracentrifugation, produisant une boulette de claire. Les granulés peuvent être remises en suspension dans le tampon souhaité ou purifié par chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC). La pureté de la particule qui en résulte peut être confirmée par SDS-PAGE.
PTCE n’est pas stable dans un tampon phosphate, donc une solution-mère x TCEP 100 doit être fraîchement préparées dans l’eau juste avant la réduction. En outre, PTCE contient thiol libre ni réagit envers les autres acides aminés, n’est pas nécessaire d’enlever l’excès de PTCE avant d’effectuer la réaction de conjugaison. Composés Dibromomaleimide sont dissous dans la solution de phosphate de sodium 5,00 pH, puis en ajoutant la Qβ réduite. À pH 5.00, cystéine (disulfure réduit) est protoné, qui favorise la réaction de conjugaison avec dibromomaleimide en empêchant la réoxydation vers un disulfure. 365 sous illumination UV de nm, le mélange réactionnel émet une fluorescence jaune immédiatement après que Qβ réduite a été ajouté en composés de la DB. Différemment, de se fixer des fluorophores préalablement synthétisés sur Qβ, cette fluorescence est induite par la réaction de conjugaison. Le fluorophore est formé dès que les nouvelles obligations entre le soufre et l’anneau maléimide sont créées. Les spectres de fluorescence montre que l’excitation (400 nm) et des émissions (550 nm) maxima monter le filtre uv-GFP dans un microscope confocal (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PEG est ensuite incubé avec macrophages Raw 264.7 en DMEM sans sérum. Après quatre heures d’incubation, Qβ-PEG a été absorbée et ponctuée jaune fluorescents compartiments peuvent être visualisées à l’intérieur des cellules. Un fait qui doit être mentionné est que la fluorescence peut être transférée pour une certaine mesure à l’albumine sérique bovine (BSA) dans le sérum ou d’autres substances riches en cystéine dans les lysosomes ou les endosomes fin des cellules. Au fil du temps, cela va affaiblir la fluorescence à l’intérieur de la cellule pour la cellule de suivi des applications ; Toutefois, il fournit également l’occasion pour une nouvelle conception pour les systèmes de livraison de médicaments.
En conclusion, nous avons démontré conjugaison DB-PEG sur Qβ VLP grâce à la chimie de dibromomaleimide-thiol. La réaction de conjugaison all-in-one functionalizes non seulement les disulfures le long des pores sur VLP avec PEG, mais rend également une NANOPARTICULE protéique fluorescent étiquetée.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
B.E. reconnaît la National Science foundation (DMR-1654405) Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pour leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
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