Summary
Her presenterer vi en prosedyre for å fluorescently functionalize disulfides på Qβ VLP med dibromomaleimide. Vi beskriver Qβ uttrykk og rensing, syntese av dibromomaleimide-functionalized molekyler og Bøyning reaksjonen mellom dibromomaleimide og Qβ. Den resulterende gule fluorescerende konjugert partikkelen kan brukes som en fluorescens sonde i cellene.
Abstract
Den siste økningen i viruslignende partikler (VLPs) i biomedisinsk og materiale kan tilskrives deres brukervennlighet biosyntesen, diskret størrelse, genetisk programmering og biologisk nedbrytbarhet. Mens de er svært mottakelig for bioconjugation reaksjoner for å legge til syntetiske ligander på overflaten deres, er varierer i bioconjugation metoder på disse vandig født capsids relativt begrenset. For å lette retning av funksjonelle biologisk materiale forskning, må utradisjonelle bioconjugation reaksjoner vurderes. Reaksjonen beskrevet i denne protokollen bruker dibromomaleimides å introdusere ny funksjonalitet i løsemiddelet eksponert disulfide obligasjoner av en VLP basert på Bacteriophage Qβ. Videre er det endelige produktet fluorescerende, som har den ekstra fordelen å generere en sporbar i vitro sonde med en kommersielt tilgjengelig filter.
Introduction
Bruke nano-størrelse viral capsids har dukket opp som et spennende felt, som har som mål å utvide omfanget av programmer i biomedisinsk forskning1,2,3. Recombinantly uttrykt viruslignende partikler (VLPs) er strukturelt avledet fra virus, men de mangler original viral genetiske materialet gjør dem ikke-smittsomme proteinaceous nanopartikler. Idet overflaten funksjonene er genetisk programmerte og hver kapsid uttrykkes identisk til de før og etter det, er det mulig å vite plassering og antall reaktive siden kjeder av aminosyrer med atomistic presisjon. I mange tilfeller har både utvendig og innvendig overflater mange typer løsemidler eksponert aminosyre rester, som kan feasibly være functionalized gjennom bioconjugation reaksjoner - reaksjoner som danner kovalente bindinger mellom en biomolecule og et syntetisk molekyl4,5.
Bioconjugation reaksjoner hjelpe biomolecules rundt har flere ulike funksjoner i en relativt enkel måte. Molekyler steder som terapeutiske narkotika6, fluorescerende tags7 og polymerer8,9 kan pre syntetisert og preget før de knyttes på overflaten av VLPs. En særlig vanlig VLP i biomedisinsk og biologisk materiale forskning har vært VLP basert på Bacteriophage Qβ, som som recombinantly uttrykt, er en 28 nm icosahedral viral kapsid10. De vanligste reaksjon sider på Qβ er lysines av en bred margin om vi nylig har kommunisert på vellykket Bøyning11 dibromomaleimide forbindelser til de reduserte disulfides som porene i Qβ via en Haddleton-Baker reaksjon. Reaksjonen fortsetter med god avkastning, og like viktig, uten å miste den termisk stabiliteten til partikler. Samtidig genererer denne reaksjonen Bøyning-indusert fluorescens, som kan brukes til å spore opptaket av disse partiklene i celler. I dette arbeidet viser vi Bøyning av polyetylenglykol (PEG) på overflaten av Qβ gjennom den Haddleton-Baker reaksjonen, som resulterer i en lys gul fluorophore. Disse partiklene kan deretter spores som de er tatt av celler. Protokollen her vil hjelpe forskerne å generere nye fluorescerende pegylert proteinaceous nanopartikler basert på Qβ, selv om dens prinsipper gjelder for en av de mange andre VLPs inneholder løsemiddel utsatt disulfides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Gjør Lysogeny kjøttkraft (LB) agar og hell plater12.
-
Transformere BL21(DE3) med en pET28 plasmider inneholder wtQβ pels protein sekvensen.
- Tine E. coli BL21(DE3) kompetent celler i en isbadet. Sted 50 μL av celler i et microcentrifuge rør.
- Legg 2 μL plasmider i en tube og forsiktig sveip røret. Deretter ruge på is 30 min.
- Varme-shock celler for 45 s i et vannbad som er på nøyaktig 42 ° C. Sett røret i isbadet umiddelbart etter varme-sjokkerende og ruge i 5 min.
- Tilsett 950 μL LB medier som ikke inneholder noen antibiotika.
- Riste kulturen på 200 rpm for 60 min på 37 ° C.
- Plate 100 μL av kultur på LB agar plater (med Kanamycin) og Inkuber platen overnatting på 37 ° C. Velg hvit kolonier ved behov.
-
Gjør Super Optimal kjøttkraft (SOB) media.
- Autoclave to 2 L forvirret Erlenmeyer flasker på en superdry syklus.
- I et aseptiske miljø, veie og legge 20.0 g av tryptone, 5.0 g gjær ekstrakt, 2.469 g vannfri magnesium sulfat, 0.584 g natriumklorid og 0.186 g av kalium klorid å hver kolbe.
- Bringe volumet til 1 L med ultrapure vann i hvert kolbe og autoklav på flytende syklusen.
- Når SOB media har nådd romtemperatur etter autoklavering, Legg 1 mL av kanamycin (100 mg/mL) til hver liter media og lagre på 4 ° C.
-
Gjøre 0.1 M kalium fosfatbuffer (pH 7,00).
- Gjør 1 M kalium monobasic løsning ved å løse opp 68.045 g av kalium monobasic på 500 mL ultrapure vann.
- Gjør 1 M kalium dibasic løsning ved å løse opp 87.09 g av kalium dibasic på 500 mL ultrapure vann.
- Legge til 38,5 mL av kalium monobasic løsning og 61,5 mL kalium dibasic en 1 L flaske.
- Justere pH til 7,00 hvis nødvendig, og bringer til et volum på 1 L.
-
Gjør 5-40% sukrose graderinger inne 0.1 M kalium fosfatbuffer (pH 7,00).
- I 50 mL sentrifuge rør, Forbered løsninger med 5-40% (økende i intervaller på 5%) sukrose oppløst inne 0.1 M kalium fosfatbuffer (pH 7,00).
- Innskudd 3.3 mL 5% sucrose løsning på bunnen av en 38 mL runde bunn polykarbonat tube bruker en lang nål sprøyte og gjenta dette for fem andre rør.
- Nøye innskudd 3.3 mL 10% sucrose løsning på bunnen av røret, og fjern forsiktig nålen som ikke forstyrr graderingen. Gjenta for de andre fem rør.
- Fortsett å sette 3.3 mL lag av sukrose, økende fra 15% til 40% i hver retning, mens å være forsiktig å ikke forstyrre graderingen.
- Når fullført, dekker toppen av forløpninger med folie og lagre på-80 ° C.
2. uttrykk for Qβ
- Tørk benk område med 1:1 blekemiddel/etanol.
- Gjøre to 3 mL startkulturer i aseptiske miljø ved å legge enkelt kolonier av E. coli BL21(DE3) i 3 mL SOB media i aseptiske miljø.
- Vokse i en shaker på 250 rpm i en 37 ° C og 0% relativ fuktighet (rH) over natten.
-
Vaksinere startkulturer i SOB medier:
- Ta begge 3 mL startkulturer av shaker og, i et aseptiske miljø, hell hver startkulturer i en av to 2 L forvirret Erlenmeyer flasker med 1 L frisk SOB media i hver.
- Plass inokulerte media på en shaker på 250 rpm i en 37 ° C og 0% rH.
- Vokse bakterier på en shaker på 250 rpm i en 37 ° C og 0% rH til OD600 når 0,9 til 1,0.
- Legg 1 mL 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) bruker en P1000 pipette for å indusere protein uttrykk.
- La media på shaker på 250 rpm i en 37 ° C og 0% rH over natten.
- Fjern medier fra shaker følgende morgen og sentrifuge med 1000 mL flasker 20,621 × g 1t på 4 ° C for å høste celler.
-
Forkaste nedbryting og samle celle pellets.
- Hell nedbryting i en flasken ca 5 mL av blekemiddel å drepe bakterier. Dette er avfall.
- Bruk en slikkepott til å skrape celle pellet fra bunnen av sentrifuger flasken og sette pellet i en 50 mL sentrifuge rør.
3. rensing av Qβ
- Resuspend celle pellets med ~ 20-30 mL 0.1 M kalium fosfatbuffer (pH 7,00).
- Kontroller rørets har ingen biter, og lyse cellene med en microfluidizer prosessor i henhold til produsentens protokollen (se Tabell for materiale). Lyse cellene minst to ganger for å øke avkastningen av partikler.
- Sentrifuge den lysate i 250 mL sentrifuge flasker 20,621 x g for 1 hr på 4 ° C.
- Forkast pellet og måle volumet av nedbryting i mL. Multipliserer verdien med 0.265 og legger til at mengden av g ammonium sulfate nedbryting.
- Rør i 4 ° C i minst 1 h på en røre plate på 200 rpm til bunnfall ut protein.
- Virvel i 250 mL flasker 20,621 x g 1t på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend pellets med ca 10 mL 0.1 M kalium fosfat bufferen (pH 7,00).
- Legg til like volum av 1:1 kloroform/n-butanol råolje utvalg og blanding av vortexing i noen sekunder.
- Virvel i 38 mL rør 20,621 × g i 30 minutter på 4 ° C.
- Gjenopprette topp vandig laget med en Pasteur pipette. Vær forsiktig med å ta noen av gel som lag som har dannet mellom vandige og organiske laget.
- Tine seks 5-40% forhåndslagde sukrose graderinger og laste ca 2 mL av ekstraktet på hver.
- Ultracentrifuge 99,582 x g 16 h på 4 ° C med gratis retardasjon.
- Skinne lys emitting diode (LED) lys under hver rør og en blå bånd skal vises. Gjenopprette disse partiklene med en lang nål sprøyte.
- Ultrapellet partikler 370,541 x g for 2,5 t på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend den gjennomsiktige pellet av renset partikler med 0.1 M kalium fosfatbuffer (pH 7,00).
4. kvantifisering og bekreftelse av produktet
- Bruk Bradford analysen for å kvantifisere produkt13.
- Kjøre redusere og ikke reduserer natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) å bekrefte det produkt14.
Merk: Redusere SDS-siden brukes til å bekrefte molekylvekt pels protein; ikke-reduserende SDS-siden er å bekrefte høyere orden strukturen.
5. bøye DB forbindelser på Qβ
-
Redusere disulfides på Qβ.
- Oppløse 0,0020 g tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) i 1 mL av ultrapure vann for å lage en 100 x lagerløsning.
Merk: Forberede frisk TCEP før reduksjon. - Legge til 200 µL av Qβ (5 mg/mL) inn i et microcentrifuge rør.
- Følg ved å legge til 20 µL av 100 x TCEP lager løsning.
- Inkuber ved romtemperatur 1t.
- Oppløse 0,0020 g tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) i 1 mL av ultrapure vann for å lage en 100 x lagerløsning.
-
Nytt bro redusert disulfide bruker dibromomaleimide polyetylenglykol (DB-PEG).
- Oppløse 0.0017 g dibromomaleimide-polyetylenglykol (DB-PEG) i 100 µL av DMF.
- Legge til 680 µL av 10 mM natrium fosfat løsning (pH 5.00).
- Legg til redusert Qβ i løsning av DB-pinne og observere miksing under en 365 nm UV-lampe. Den lyse gule fluorescensen kan visualiseres umiddelbart med en 365 nm håndholdte UV lampen på miksing.
- La reaksjonen fortsette over natten i romtemperatur (RT) på en drikke.
- Rense reaksjonsblandingen av sentrifugal filter (COMW = 10 kDa) tre ganger bruke 1 x PBS 3,283 x g for 20 min på 4 ° C.
- Overvåke Bøyning av ikke-reduserende SDS side og innfødte agarose gel geleelektroforese.
Merk: VLPs kjører som intakt partikler i native agarose gel, og de er atskilt basert på kostnad, størrelse og form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dibromomaleimide derivater kan syntetiseres gjennom kondens reaksjonen dibromomaleimide anhydride og primære aminer15. Alternativt ble en mild syntetiske metoden16 bruker N-methoxycarbonyl aktivert 3,4-dibromomaleimide utnyttet her av reagerer med methoxypolyethylene glycol (PEG) til å gi DB-pinne (figur 1). NMR ble brukt til å identifisere sammensatte strukturen (figur 2). Qβ VLP er en 28 nm icosahedral proteinaceous hydrogenion, som består av 180 identiske pels proteiner. Pelsen proteiner tendens til å danne noncovalent sikringsanlegg dimers gjennom sine α-spiralformede domener med den β-ark fra tilstøtende pels proteiner17. VLPs tendens til å bli valgt for deres stabilitet ved høye temperaturer, ekstrem O.l. og ulike løsemiddel komposisjoner18. I dette tilfellet er Qβ VLP mer stabilt enn andre RNA-phages i Leviviridac familien på grunn av 180 mellom strand disulfide obligasjoner på fem - og seks-fold aksene av symmetri på kapsid19 (Figur 3). Disse hexameric og pentameric strukturer er forbundet med disulfides, som kan visualiseres ikke-reduserende SDS side19. Ti ekvivalenter av TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 µmol), i forhold til disulfides i 1 mg av Qβ (0.070 µmol pels protein, 0.070 µmol disulfides) ble brukt til å redusere alle disulfides for å generere de reduserte Qβ capsids (rQβ) i romtemperatur i en time og ikke-reduserende SDS-siden viser at alle høyere orden strukturer ble redusert til monomerisk pels proteiner (Figur 4 og figur 5A). Reaksjonen til rebridge dem ble gjort som en one-pot syntese, som råolje rQβ blanding ble lagt direkte til 20 ekvivalenter i en løsning av DB-pinne (1,4 µmol) i natrium fosfat (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) etter en time reduksjon reaksjon11. Det var observerbare lyse gule fluorescens under 365 nm UV lampen (figur 5 d) umiddelbart etter DB-pinne. Blandingen ble deretter ruges på RT natten på en drikke, etterfulgt av rensing ved hjelp av sentrifugal filter (MWCO = 10 kDa) skylling med ønsket bufferen tre ganger for å fjerne overflødig mengder små molekyler. Qβ-malemide conjugates ble resuspended i 10 mM natrium fosfat løsning (pH 5.00) å fremme photostability. Bøyning ble bekreftet av ikke-reduserende SDS side under UV og coomassie blå flekker (figur 5A). Alle feltene viste fluorescens (figur 5A) under UV som colocalized med coomassie blå flekker, som representerer en vellykket Bøyning. Integriteten til Qβ-pinne conjugates ble bekreftet av innfødte agarose gel gelelektroforese og overføring elektronmikroskop (TEM) (figur 5B, C).
Fluorescens spektroskopi viste eksitasjon og utslipp maxima Qβ-maleimide (Qβ-Μ) og Qβ-pinne å være rundt 400 nm og 540-550 nm, henholdsvis (figur 6). Dette justert med kommersielt tilgjengelige GFP-uv filter settet, som eksitasjon bølgelengde er 405 nm og utslipp bølgelengde er 500-540 nm. Praktisk justeringen av photophysical egenskapene til conjugates kommersielt tilgjengelig filteret angir tillatelse bruker Qβ-pinne som en i vitro sonde, som ble gjort og avbildet i figur 7. Qβ-pinne (200 nM) ble inkubert med musen Raw-264.7 celler i serum-free DMEM medium, etterfulgt av kjernen flekker. Colocalization bilder i figur 7 viser at gul fluorescerende partikler var uptaken av Raw-264.7 celler og kan spores etter fire timers inkubasjon. Den unfunctionalized Qβ VLPs viser ubetydelig fluorescens.
Figur 1: syntetisk ordningen med DB-pinne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: NMR karakterisering. (A) 1 H-NMR og (B) 13C av DB-pinne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: krystallografisk struktur av Qβ VLP kapsid som behandles i Chimera (PDB-ID: 1QBE). To cystein rester (Cys 74 og Cys 80) vises i oransje.
Figur 4: Bøyning ordningen med Qβ-maleimide (Qβ M) conjugates. Qβ (0.07 µmol av disulfides) ble redusert med 10 ekvivalenter av TCEP (0,7 µmol) på RT i én time etterfulgt av tillegg av 20 ekvivalenter av dibromomaleimide forbindelser (DB og DB-pinne) (1,4 µmol). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: karakterisering av Qβ, rQβ, Qβ-M og Qβ-pinne. (A) ikke-reduserende SDS side og (B) native agarose gel av Qβ, rQβ, Qβ-M og Qβ-pinne under UV (øverst) og coomassie blå flekker (nederst). (C) TEM mikroskop-bilde av Qβ-M (øverst) og Qβ-pinne (nederst). (D) fotografi av Qβ-pinne reaksjonsblandingen under 365 nm UV-belysning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: fluorescens spectra. Fluorescens eksitasjon (A) og utslipp (B) spektra av Qβ-M og Qβ-pinne i 0.1 M kalium fosfat bufferen (pH 7,00). Magnetisering maksimal er rundt 400 nm og utslipp er rundt 540-550 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: AC Confocal fluorescens bilder av Qβ-pinne bøy i macrophage 264.7 celler. Blå: NucRed Live 647 ReadyProbes reagenser. Gul: Qβ-pinne. Top bilder: fusjonerte blå og gul. Bunn bilder: lysende felt bilder. Filtrere sett: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. Med inkubering var 4 h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med mindre protein rensing, er en enestående steg i rensing bacteriophage Qβ sukrose gradient sentrifugering. Etter kloroform/n-butanol utvinning trinn, er Qβ videre renset med 5-40% sukrose graderinger. Under sentrifugering skilles partikler basert på deres størrelser. Større partikler reise til høyere tetthet regionen, mens mindre partikler bo i regionen for lavere tetthet. Qβ reiser til nedre tredjedel av graderingen og fortsatt det mens mindre protein urenheter er fanget på toppen av sentrifuger røret. Kolloidalt suspensjon av Qβ viser sterk Tyndall spredning i sukrose forløpningen, som kan sees som en blå når en smal avsats lyset er skinte fra under. Dette bandet er så lett å trekke ut bruker en lang sprøyte nål. Qβ i sukrose er deretter pelleted av ultracentrifugation, gir klare pellets. Pellet kan resuspended inn i ønsket buffer eller ytterligere renset ved rask protein flytende kromatografi (FPLC). Renheten av den resulterende partikkelen kan bekreftes av SDS-side.
TCEP er ikke stabil i fosfatbuffer, så en 100 x TCEP lager løsning bør være nylaget i vann rett før reduksjon. I tillegg TCEP verken inneholder gratis thiol eller reagerer mot andre aminosyrer, så det ikke er nødvendig å fjerne overflødig av TCEP før du utfører Bøyning reaksjonen. Dibromomaleimide forbindelser er oppløst i pH 5,00 natrium fosfat løsning, etterfulgt av å legge til redusert Qβ. PH 5,00 er cystein (redusert disulfide) protonerte, som fremmer Bøyning reaksjon med dibromomaleimide ved å hindre re-oksidasjon til en disulfide. Under 365 nm UV lys, reaksjonsblandingen avgir gule fluorescens straks redusert Qβ ble lagt til DB forbindelser. Forskjellig fra fester pre syntetisk fluorophores på Qβ, er denne fluorescens indusert av Bøyning reaksjonen. Fluorophore er dannet så snart de nye båndene mellom svovel og maleimide ringen er opprettet. Fluorescens spectra viser at magnetisering (400 nm) og utslipp (550 nm) maxima passer uv-GFP filteret i AC confocal mikroskop (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-pinne ble deretter inkubert med macrophage rå 264.7 i serum-free DMEM. Etter fire timers inkubasjon var Qβ-pinne uptaken og vises punctate gul fluorescerende avdelinger kan visualiseres i cellene. Et faktum som må nevnes er fluorescensen kan overføres til en viss grad til storfe serum albumin (BSA) i serum- eller andre cystein-rik stoffer av lysosomer eller sen endosomes celler. Over tid vil dette svekke fluorescens inne i cellen for celle sporingsprogrammer; men gir det også en mulighet for en ny design for narkotika leveringssystemer.
I konklusjonen, har vi vist bøye DB-pinne på Qβ VLP gjennom dibromomaleimide-thiol kjemi. Alt-i-ett Bøyning reaksjonen ikke bare functionalizes disulfides langs porene på VLP med PEG, men gjør det også en fluorescently merket proteinaceous hydrogenion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
J.J.G. erkjenner National Science foundation (DMR-1654405) og kreft forebygging Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
