Summary
Здесь мы представляем процедура дневно functionalize дисульфиды на Qβ VLP с dibromomaleimide. Мы описываем выражение Qβ и очистки, Синтез функционализированных dibromomaleimide молекул и спряжение реакции между dibromomaleimide и Qβ. Результате желтый флуоресцентный конъюгированных частиц может использоваться как флуоресценции зонда внутрь клетки.
Abstract
Недавний рост вирусоподобных частиц (VLP) в биомедицинских и материалы исследований можно отнести их простота биосинтез, дискретных размер, генетическое программирование и способность к биологическому разложению. Хотя они очень поддаются реакции bioconjugation для добавления синтетическими лигандами на их поверхность, диапазон в методологии bioconjugation на эти водные родился capsids относительно ограничен. Чтобы облегчить направление исследований функциональные биоматериалы, должны рассматриваться нетрадиционных bioconjugation реакций. Реакции, указанных в настоящем Протоколе использует dibromomaleimides ввести новую функциональность в растворителе, подвергаются дисульфидными облигаций VLP основе бактериофага Qβ. Кроме того конечный продукт флуоресцентные, которая имеет дополнительное преимущество генерации отслеживаются в vitro зонд, с помощью набора коммерчески доступных фильтров.
Introduction
С помощью нано размера вирусного capsids стала возбуждающего поля, которая направлена на расширение сферы применения биомедицинских исследований в1,2,3. Recombinantly выразил вирусоподобных частиц (VLP) структурно являются производными от вирусов, но им не хватает оригинальных вирусного генетического материала, делая их неинфекционных белковых наночастиц. Как особенности поверхности генетически запрограммирован и каждый капсид выражается одинаково на те до и после него, это можно узнать местонахождение и количество реактивных боковых цепей аминокислот с атомистическим точностью. Во многих случаях наружных и внутренних поверхностей обладают многие виды растворителей подвергаются аминокислотных остатков, которые реально могут быть функционализированных через bioconjugation реакции - реакции, которые образуют ковалентные связи между биомолекулы и синтетические молекула4,5.
Bioconjugation реакции помогают биомолекул интерес у более разнообразных функций в относительно простой моды. Молекулы интереса, таких как лечебных препаратов6, флуоресцентные метки7 и полимеров8,9 могут быть предварительно синтезируется и характеризуется, прежде чем они крепятся на поверхности VLP. Особенно распространены VLP в биомедицинских и биоматериалов исследования был ВЛП, основанные на бактериофага Qβ, который, как recombinantly выраженным, является 28 Нм икосаэдра вирусного капсида10. Наиболее распространенные реакции сайты на Qβ являются lysines с большим отрывом, хотя недавно мы общались успешного сопряжения11 dibromomaleimide соединений для снижения дисульфиды, которые выстилают поры Qβ через Haddleton-Бейкер реакции. Реакция идёт с хорошим доходность и, что не менее важно, без потери термостабильности частиц. В то же время эта реакция генерирует спряжение индуцированной флуоресценции, который может использоваться для отслеживания поглощение этих частиц в клетки. В этой работе мы демонстрируем спряжение полиэтиленгликоля (PEG) на поверхность Qβ через Haddleton-Бейкер реакцию, которая приводит яркий желтый Флюорофор. Эти частицы затем могут быть отслежены, как они принимаются клетки. Протокол здесь поможет генерировать новые люминесцентные Пегилированный белковых наночастиц на основе Qβ, хотя его принципы применяются к одному из многих других VLP, содержащие растворитель подвергаются дисульфиды исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Сделать Lysogeny бульон (LB) агар и залить12пластин.
-
Преобразование BL21(DE3) с pET28 плазмиды, содержащих последовательности белка wtQβ пальто.
- Оттепель E. coli BL21(DE3) сведущие клетки в ледяной бане. Место 50 мкл клеток в пробки microcentrifuge.
- Добавить 2 мкл плазмида в одну трубу и мягко проведите трубки. Затем Инкубируйте на льду за 30 мин.
- Теплового шока клетки для 45 s в ванне с водой, в Ровно 42 ° C. Сразу после тепло шокирующие Поместите трубку обратно в ледяной ванне и инкубировать в течение 5 мин.
- Добавление 950 мкл LB средств массовой информации, которые не содержат любой антибиотик.
- Встряхнуть культуры на 200 об/мин, 60 мин при температуре 37 ° C.
- Пластина 100 мкл культуры на плитах агара фунтов (с канамицин) и инкубировать пластину на ночь при 37 ° C. Выберите белый колонии при необходимости.
-
Сделайте супер оптимального бульон (SOB) средства массовой информации.
- Автоклав два 2 L озадаченного Эрленмейер колбы на superdry цикла.
- В асептических условиях весят и добавить 20,0 г Триптон, 5,0 г дрожжей экстракт, 2.469 g безводного сульфата магния, 0,584 г натрия хлорида и 0,186 г хлористого калия на каждый флакон.
- Доводят объем до 1 Л с ультрачистая вода в каждом колбу и автоклава на жидком цикла.
- После того, как СОБ СМИ достигла комнатной температуре после автоклавирования, добавить 1 мл канамицин (100 мг/мл) в каждый литр средства массовой информации и хранить при 4 ° C.
-
Сделайте буфер фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
- Сделайте 1 M калия монокальций решения путем растворения 68.045 г калия монокальций в 500 мл ультрачистая вода.
- Сделайте 1 M калия двуосновной решения путем растворения 87.09 г калия двуосновной в 500 мл ультрачистая вода.
- Добавьте 38,5 мл раствора калия монокальций и 61,5 мл калия двуосновной бутылка 1 Л.
- Отрегулируйте пэ-аш до 7.00, в случае необходимости и довести до объемом 1 л.
-
Сделать 5-40% сахарозы градиенты в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
- В 50 мл пробирок Подготовьте решения с сахарозы 5-40% (увеличение с шагом 5%), растворенного в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
- Депозит 3,3 мл раствора 5% сахарозы в нижней части 38 мл раунд дно из поликарбоната с помощью длинной иглой шприца и повторите это действие для пяти других труб.
- Тщательно депозит 3,3 мл 10% раствора сахарозы в нижней части трубки и осторожно извлеките иглу относительно не беспокоить градиента. Повторите для других пяти трубок.
- Продолжать депозит слои 3,3 мл растворов сахарозы, увеличение от 15% до 40% в каждой тюбике, будучи осторожны, чтобы не нарушить градиента.
- Когда закончите, охватывают верхушки градиенты с фольгой и хранить при температуре-80 ° C.
2. выражение Qβ
- Протрите скамейке Блич/этанол 1:1.
- Сделать два 3 мл закваски в асептической среде путем добавления одной колонии E. coli BL21(DE3) в 3 мл SOB СМИ в асептической среде.
- Растут на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% относительная влажность (rH) номер на ночь.
-
Прививать закваски в СОБ СМИ:
- Снять оба 3 мл стартерных культур шейкер и в асептических условиях, налить каждый закваски в один из двух 2 L озадаченного Эрленмейер колбы с 1 Л свежих SOB СМИ в каждом.
- Место привитых СМИ на шейкер на 250 об/мин в комнате 37 ° C и 0% rH.
- Расти бактерии на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате, пока ОД600 достигает 0,9 – 1,0.
- Добавьте 1 mL 1 М изопропиловый β-D-1 тиогалактопиранозид (IPTG) с помощью пипетки P1000 побудить выражения протеина.
- Оставьте СМИ на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате на ночь.
- Удалите СМИ из шейкер следующее утро и центрифуги с помощью 1000 мл бутылки на 20,621 × g за 1 час при температуре 4 ° C для сбора клеток.
-
Отменить супернатант и собирать Пелле ячейки.
- Залейте супернатант в колбу с около 5 мл отбеливатель, чтобы убить бактерии. Это отходов.
- Лопаточкой скрести клетки гранулы из нижней части бутылки центрифуги и положить лепешку в 50 мл пластиковых пробирок.
3. Очистка Qβ
- Ресуспензируйте клетки лепешка с ~ 20-30 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
- Убедитесь, что ресуспендирования имеет не куски и лизировать клетки, с помощью microfluidizer процессора по данным производителя протокол (см. Таблицу материалы). Лизируйте клетки по крайней мере дважды увеличить доходность частиц.
- Центрифуга lysate в 250 мл бутылки центрифуги на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
- Отменить гранулы и измерить объем супернатант в мл. Умножьте это значение на 0,265 и добавить что количество г сульфата аммония супернатант.
- Движение на 4 ° C для по крайней мере 1 h на плите переполох на 200 об/мин, чтобы осадить из белка.
- Центрифуга в 250 мл бутылки на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с около 10 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
- Добавьте равных объемах 1:1 хлороформ/н бутанолом в сырой пример и микс, vortexing на несколько секунд.
- Центрифуга 38 мл пробирки на 20,621 × g 30 минут при 4 ° C.
- Восстановите Топ водный слой с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожным, чтобы не принимать любое из геля как слой, который сложился между водный и органического слоя.
- Оттепель шесть 5-40% готовые сахарозы градиенты и загрузки около 2 мл экстракт на каждую.
- Ультрацентрифуги на 99,582 x g для 16 ч при 4 ° C с бесплатным замедления.
- Блеск Светоиспускающий диод (LED) свет под каждой трубы и синей полосой должен стать видимым. Восстановите эти частицы с длинной иглой шприца.
- Ultrapellet частиц на 370,541 x g для 2,5 ч при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте Прозрачные гранулы очищенный частиц с буфером фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
4. Количественная оценка и подтверждение продукта
- Использование Assay Брадфорд для количественного определения продукта13.
- Выполнения сокращения и не сокращение натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) для подтверждения продукта14.
Примечание: Уменьшение SDS-PAGE используется для подтверждения низкомолекулярных белков пальто; не сокращение SDS-PAGE является подтверждение структуры высшего порядка.
5. спряжение DB соединений на Qβ
-
Уменьшите дисульфиды на Qβ.
- Распустить 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в 1 мл сверхчистой воды сделать Стоковый раствор 100 x.
Примечание: Подготовьте свежие TCEP до сокращения. - Добавьте 200 мкл Qβ (5 мг/мл) в трубку microcentrifuge.
- Следовать за путем добавления 20 мкл 100 x TCEP раствор.
- Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Распустить 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в 1 мл сверхчистой воды сделать Стоковый раствор 100 x.
-
Повторно мост снижение дисульфида, с помощью dibromomaleimide Полиэтиленгликоль (DB-PEG).
- Растворите 0,0017 г dibromomaleimide-Полиэтиленгликоль (DB-PEG) в 100 мкл ДМФ.
- 680 мкл раствора натрия фосфата 10 мм (рН 5.00).
- Добавить сократить Qβ в раствор DB-КОЛЫШЕК и наблюдать процесс смешивания под лампой УФ 365 Нм. Яркие желтые флуоресценции могут быть немедленно визуализированы с 365 Нм Карманный УФ лампой после смешивания.
- Пусть реакции перейти на ночь при комнатной температуре (RT) на вертеле.
- Очистить реакционной смеси центробежным фильтром (COMW = 10 кДа) три раза с использованием ПБС в 3,283 x g 20 мин при 4 ° C.
- Контролировать спряжение, не снижая SDS-PAGE и родной геля агарозы.
Примечание: VLP как нетронутыми частиц в родной агарозном геле, и они разделяются на их заряда, размер и форму.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dibromomaleimide производные могут быть синтезированы посредством реакции конденсации между dibromomaleimide ангидрид и первичных аминов15. Кроме того мягкий синтетический метод16 , с использованием N-метоксикарбонил активированный 3,4-dibromomaleimide эксплуатировался здесь, реагируя с methoxypolyethylene гликоль (PEG) доходности DB-ПЭГ (рис. 1). ЯМР была использована для выявления составных структуру (рис. 2). Qβ VLP является 28 Нм икосаэдра белковых наночастиц, который состоит из 180 идентичные пальто белков. Белки пальто, как правило, образуют нековалентных взаимосвязанных димеры путем их α-винтовой домены с β-листы из прилегающих пальто белков17. VLP клонат быть выбраны для их стабильность при высоких температурах, экстремальные pHs и в различных растворителей композиции18. В этом случае Qβ VLP является более стабильным, чем другие бактериофаги РНК в семье Leviviridac из-за 180 облигации Интер стренги дисульфида, находится в пяти - и шести фолд осей симметрии капсид19 (рис. 3). Эти структуры hexameric и pentameric связаны дисульфиды, которые могут быть визуализированы-уменьшение SDS-PAGE19. Десять эквиваленты TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 мкмоль), относительно дисульфиды в 1 мг Qβ (0.070 мкмоль пальто белка, 0.070 дисульфиды мкмоль), были использованы для уменьшения всех дисульфиды произвести сокращение Qβ capsids (rQβ) при комнатной температуре в одном час и не сокращение SDS-PAGE показывает, что все выше структур порядка были снижены до мономерных пальто белков (рис. 4 и рис 5A). Реакция на rebridge их было сделано как Однореакторный синтез, как сырой rQβ примесь был добавлен непосредственно в 20 эквиваленты решения DB-ПЭГ (1.4 мкмоль) в фосфат натрия (10 мм, pH 5.00, 10% ДМФ) после сокращения на один час реакции11. Сразу же после добавления DB-PEG был наблюдаемый яркий желтый флуоресценции под 365 Нм УФ лампой (рис. 5 d). Смесь была затем инкубируют на RT на ночь на вертел, следуют с помощью центробежного фильтра очистки (MWCO = 10 кДа) полоскания с желаемой буфера три раза для удаления избыточного количества малых молекул. Qβ-malemide конъюгатов были высокомобильна в 10 мм фосфат натрия раствор (pH 5.00) для содействия светостойкость. Спряжение был подтвержден не сокращение SDS-PAGE под УФ и Кумасси синий окрашивание (Рисунок 5A). Все полосы показали флуоресцирования (Рисунок 5A) под УФ colocalized который с Кумасси синим окрашивание, представляющие успешного сопряжения. Целостность конъюгаты Qβ-PEG были подтверждены родной агарозы gel электрофореза и передачи электронной микроскопии (ТЕА) (Рисунок 5B, C).
На страницу отдела Флуоресценция показал возбуждения и выбросов Максима Qβ-maleimide (Qβ-Μ) и Qβ-КОЛЫШЕК быть около 400 Нм и 540 – 550 Нм, соответственно (рис. 6). Это выравнивает с коммерчески доступных набор фильтров GFP-УФ, чья длина волны возбуждения является 405 нм и выбросов волны составляет 500 – 540 Нм. Удобный выравнивание свойства изучены фотофизические конъюгаты с коммерчески доступных фильтр задает разрешения, с помощью Qβ-PEG как зонд в пробирке , что было сделано и отражаться на рисунке 7. Qβ-ПЭГ (200 Нм) был инкубировали с мыши Raw-264.7 клеток в среде DMEM сыворотки бесплатно, после окрашивания ядра. Colocalization изображения в Рисунок 7 показывает, что желтый флуоресцентные частицы были освоен Raw-264.7 клетками и может отслеживаться после четырех часов инкубации. Unfunctionalized Qβ VLP показывают незначительное флуоресценции.
Рисунок 1: синтетическая схема DB-PEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: характеристика ЯМР. (A) 1 H ЯМР и (B) 13C DB-КОЛЫШЕК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Кристаллографическая структура Qβ VLP капсид как обрабатываются в Химера (PDB ID: 1QBE). Два остатков цистеина (Cys 74 и Cys 80) показаны оранжевым цветом.
Рисунок 4: спряжение схема Qβ-maleimide (Qβ-M) конъюгатов. Qβ (0,07 мкмоль дисульфиды) было уменьшено с помощью 10 эквиваленты TCEP (0,7 мкмоль) на RT на один час, после добавления 20 эквиваленты dibromomaleimide соединений (DB и DB-PEG) (1.4 мкмоль). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: характеристика Qβ, rQβ, Qβ-М и Qβ-PEG. (A) Non уменьшение SDS-PAGE и (B) родной агарозы гель из Qβ, rQβ, Qβ-М и Qβ-КОЛЫШЕК под УФ (вверху) и Кумасси синий окрашивание (внизу). (C) ТЕА Микрофотография Qβ-M (вверху) и Qβ-ПЭГ (внизу). (D) фотография из Qβ-PEG реакционную смесь под 365 Нм УФ освещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: спектры флуоресценции. Флуоресценции возбуждения выбросов (A) и (B) спектры Qβ-М и Qβ-КОЛЫШЕК в 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00). Максимальная возбуждения находится около 400 Нм и выбросов максимум составляет около 540 – 550 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Confocal флуоресценции изображения Qβ-PEG конъюгат в клетки макрофагального 264.7. Голубой: NucRed живут 647 ReadyProbes реагентов. Желтый: Qβ-КОЛЫШЕК. Лучшие образы: объединить каналы синий и желтый. Снизу изображения: светлые области изображения. Фильтровать наборы: УФ GFP (λex = 405 нм,Эм λ = 500 – 540 Нм), Cy5. Время инкубации было 4 ч. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с небольших очищение протеина, уникальный шаг в очищающий бактериофага Qβ — сахароза градиентного центрифугирования. После извлечения хлороформ/н бутанолом шага Qβ далее очищается с помощью 5-40% сахарозы градиентов. Во время центрифугирования частицы разделяются на их размеры. Крупные частицы поездки в регионе более высокой плотности, в то время как мелкие частицы остаются в регионе нижней плотности. Qβ едет в нижней трети градиента и остается там в то время как меньшие белковых примесей оказались в ловушке в верхней части пластиковых пробирок. Коллоидный подвеска Qβ показывает сильный Тиндаля рассеяния в градиенте сахарозы, который можно рассматривать как синяя полоса когда светодиодный свет сиял от под. Эта группа затем легко извлечь с помощью иглы длиной шприца. Qβ в сахароза затем гранулированных, ultracentrifugation, давая четкое Пелле. Гранулы можно высокомобильна в желаемой буфер или неразделимая быстро белок жидкостной хроматографии (ПСОК). Чистоты результате частицы могут быть подтверждены SDS-PAGE.
TCEP не является стабильной в фосфатного буфера, поэтому 100 x TCEP Стоковый раствор следует свежеприготовленный в воду прямо до сокращения. Кроме того TCEP содержит бесплатные тиоловых не реагирует к другие аминокислоты, поэтому нет необходимости удалить избыток TCEP до выполнения сопряжения реакции. Dibromomaleimide соединений растворяются в рН раствора 5.00 фосфат натрия, затем, добавляя снижение Qβ. При pH 5.00 хвоща (снижение дисульфида) является протонированных, который способствует спряжение реакции с dibromomaleimide путем предотвращения ре окисления молибдена. До 365 Нм УФ освещения, реакционную смесь испускает желтый флуоресценции, сразу же после того, как сокращение Qβ был добавлен в DB соединений. По-разному от крепления предварительно синтезированных флуорофоров на Qβ, этот флуоресценции индуцируется спряжение реакции. Флюорофор формируется, как только будут созданы новые узы между серы и maleimide кольцо. Спектры флуоресценции показывает, что возбуждение (400 Нм) и выбросов (550 Нм) Максима установите фильтр УФ ГФП в Конфокальный микроскоп (λex = 405 нм, λет = 500−540 Нм). Qβ-PEG был затем инкубируют с макрофагов Raw 264.7 в DMEM сыворотки бесплатно. После четырех часов инкубации Qβ-PEG был освоен и пунктата желтый флуоресцентный отсеки могут быть визуализированы внутри клетки. Один факт, который необходимо отметить — флюоресценция могут быть переданы для некоторой степени бычьим сывороточным альбумином (БСА) в сыворотке или других веществ хвоща-богатые люди внутри лизосомы или конце endosomes клеток. Со временем это ослабит флуоресценции внутри клетки для ячейки отслеживания приложений; Однако он также предоставляет возможность для нового дизайна для систем доставки наркотиков.
В заключение мы продемонстрировали спрягать DB-КОЛЫШЕК на Qβ VLP через dibromomaleimide тиоловых химии. Все-в-одном спряжение реакции не только functionalizes дисульфиды вдоль поры на VLP с PEG, но и делает его дневно обозначенные белковых наночастиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
J.J.G. признает Национальный научный фонд (DMR-1654405) и Институт исследования профилактики рака штата Техас (CPRIT) (RP170752s) за их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
